Name: Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a implantar uma janela craniana crônica para imagem longitudinal de neurônios e astrócitos em camundongos acordados. Este método permite visualizar alterações celulares em modelos de distúrbios neurológicos.

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Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo IACUC no Centro Médico da Universidade de Nebraska.
1. Antes da cirurgia
<ol><li>Prepare pipetas para injeções virais. Puxe capilares de vidro borossilicato usando um puxador de pipeta e coloque a pipeta em um ângulo de 20°. Esterilize as pipetas durante a noite.</li>
	<li>Prepare peças frescas de espuma de gel estéril cortando-as em pequenos quadrados. Submergir a espuma de gel em um tubo microfuge estéril contendo 0,5 mL de soro fisiológico. Mergulhe a espuma de gel em soro fisiológico por pelo menos 30 minutos antes de usar.</li>
	<li>Prepare pedaços frescos de tiras de esponja cortando-as em tiras finas.</li>
	<li>Vinte minutos antes da cirurgia, injete camundongos GLAST-CreER/GCaMP6f de 4-6 semanas de idade intraperitoneal com 0,2 mg/kg dexametasona para evitar inchaço cerebral e 5 mg/kg de carprofeno para reduzir a inflamação. NOTA: Para induzir a recombinação e expressão do GCaMP6f em aproximadamente 40% dos astrócitos, os camundongos GLAST-CreER/GCaMP6f foram injetados com 100 mg/kg de tamoxifeno a 3 semanas por 5 dias consecutivos.</li>
</ol>2. Início da cirurgia
<ol><li>Após 20 min, anestesia os camundongos com 3% de isoflurano com oxigênio a uma vazão de 1 L/min por aproximadamente 1,5 min.</li>
	<li>Uma vez anestesiado, coloque o mouse em uma estrutura estereotaxa que se senta em uma manta de recirculação de água para manter uma temperatura corporal de 37 °C durante toda a cirurgia. Fixar o mouse na armação usando o grampo de focinho e as barras de ouvido. Certifique-se de que o grampo de focinho e as barras de ouvido estão estáveis o suficiente para que a cabeça não se mova durante o procedimento, mas não tão apertado que o crânio esteja danificado.</li>
	<li>Mantenha a anestesia com isoflurane de 1-1,5% com oxigênio a uma vazão de 1-2 L/min. Note que alguns animais podem precisar de mais ou menos isoflurane para manter a sedação. Monitore a respiração do animal, bem como seus reflexos para as pinças dos dedo do dedo do poço e da cauda, e ajuste o isoflurane adequadamente.</li>
	<li>Aplique pomada ocular em cada olho usando um aplicador de ponta de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento.</li>
	<li>Usando aparadores de roedores, raspe o cabelo do pescoço para passar pelos olhos. Tenha cuidado para garantir que os bigodes do animal não sejam acidentalmente aparados.</li>
	<li>Limpe a área raspada com uma almofada de preparação de iodo, seguida por uma almofada de preparação para álcool.</li>
	<li>Usando fórceps de tecido estéril e tesoura cirúrgica, corte e remova a pele das suturas frontais anteriores à bregma até posteriormente a lambda.</li>
	<li>Uma vez que a pele é removida, adicione aproximadamente 0,1 mL de 1% de xilocaine (lidocaína com epinefrina 1:200.000) ao crânio para minimizar o sangramento do crânio.</li>
	<li>Usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono de tamanho 11 estéril presa a uma alça, raspe suavemente o tecido conjuntivo do crânio. Tome cuidado extra ao remover o tecido conjuntivo perto da borda do crânio, pois qualquer tecido restante poderia evitar uma forte aderência do vidro ou placa da cabeça mais tarde.</li>
	<li>Use fórceps de tecido estéril para remover tecido conjuntivo solto do crânio.</li>
	<li>Usando aplicadores de ponta de algodão estéreis, limpe qualquer xilocaine restante do crânio.</li>
	<li>Uma vez concluído, desengreça completamente o crânio usando um aplicador de ponta de algodão estéril mergulhado em acetona. Use ar comprimido para secar imediatamente o crânio.</li>
</ol>3. Craniotomia
<ol><li>Usando um marcador de ponto fino e uma régua, meça o tamanho apropriado para a abertura no local desejado. Confirme o tamanho da abertura comparando-a com o tamanho do vidro de cobertura (3 ou 5 mm de diâmetro); certifique-se de que a abertura é ligeiramente menor do que o tamanho do vidro de cobertura.</li>
	<li>Usando uma broca dentária, rastreie gradualmente o contorno da abertura, afinando o osso. Perfurar lentamente para evitar perfurar o osso, e perfurar em círculos concêntricos para facilitar o afinamento do osso.</li>
	<li>Após cada passe concêntrico, adicione uma gota ou duas de soro fisiológico estéril à área perfurada. Deixe que o soro fisiológico se sente por pelo menos 10 s para evitar que o osso superaqueça e danifique a duração subjacente.</li>
	<li>Use um aplicador de ponta de algodão estéril para absorver qualquer solução salina restante. Soprar ar comprimido sobre a área para garantir que todos os salinos restantes evaporaram antes de retomar a perfuração. Faça isso para explodir detritos ósseos que permanecem.</li>
	<li>Repita as etapas 3.2-3.4 até que o osso esteja adequadamente afinado para remoção.</li>
	<li>Certifique-se de que o osso está adequadamente diluído para remoção, empurrando suavemente a área central do osso com fórceps finos para verificar se o crânio diluído se move. A vasculatura subjacente deve ser visível onde a perfuração ocorreu. Observe que o osso pode aparecer como se rachasse onde ocorreu o afinamento. NOTA: O treinamento nesta fase é crucial para identificar quando o osso foi diluído adequadamente.</li>
	<li>Antes de tentar remover o osso, verifique o mouse para ter certeza de que ele está completamente sedado. Caso não, aumente gradualmente a manutenção isoflurane para evitar o inchaço cerebral ao remover o osso.</li>
	<li>Adicione um pequeno pedaço de espuma de gel saturado em soro fisiológico ao crânio diluído. Adicione uma ou duas gotas adicionais de soro fisiológico ao crânio diluído. NOTA: Ter bastante soro fisiológico sobre o crânio diluído ajuda a reduzir o sangramento e proteger a dura dura ao remover a aba óssea.</li>
	<li>Usando uma lâmina pontiaguda de 15° em miniatura, insira cuidadosamente a lâmina no osso diluído e corte ao longo do osso fino. Mantenha a espuma de gel encharcada em soro fisiológico, pronta para parar qualquer sangramento que possa ocorrer.</li>
	<li>Usando fórceps, levante cuidadosamente e remova o osso. Seja o mais gentil possível para evitar danos ao tecido subjacente e vasculatura. Tome muito cuidado para não danificar a dura-mãe.</li>
	<li>Uma vez que a aba óssea é removida, adicione um pedaço fresco de espuma de gel saturado em soro fisiológico ao córtex. Adicione algumas gotas de soro fisiológico para evitar que a espuma de gel seque, pois isso causará danos ao tecido subjacente.</li>
</ol>4. Injeções virais
<ol><li>Realize injeções virais usando um aparelho estereotaxico.<ol>
<li>Prepare AAV1. CaMKII.0.4.Cre (título de 3 × 1013 cópias de genoma (GC)/mL) em 1:5.000 por diluições seriais em soro fisiológico.</li>
		<li>Prepare a mistura de AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) e AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (título de 5 × 1012 GC/mL) em um pequeno pedaço de parafilm.</li>
		<li>Encha uma pipeta de vidro estéril com um tamanho de ponta de 20 μm com a mistura do vírus, colocando suavemente a pipeta na solução.</li>
		<li>Abaixe a pipeta de modo que ela apenas toque a superfície do cérebro e continue a baixar por mais 200-300 μm para injeções L2/3. Utilizando um sistema de dispensa de microinjeção intracelular (ver a Tabela de Materiais), injeção de pressão 12-15 vezes ao longo de 2 min (20 psi, 9 ms de duração do pulso). Observe o menisco na queda da pipeta com cada injeção para garantir que a pipeta não esteja bloqueada.</li>
		<li>Uma vez injetado, deixe a pipeta no cérebro por 4-5 minutos para evitar o fluxo de volta. Retraia lentamente a pipeta.</li>
		<li>Repita as injeções em 2-3 locais (aproximadamente 500 μm de distância).</li>
		<li>Descarte as pipetas de vidro usadas, parafilm, pontas de pipeta e tubos de microfuge usados para diluições seriais do vírus Cre em 10% de alvejante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Implantação de janela craniana
<ol><li>Remova qualquer espuma de gel e use uma pequena tira de esponja para absorver qualquer solução salina restante.</li>
	<li>Adicione algumas gotas do antibiótico enrofloxacina (22,7 μg/mL) à abertura e deixe que ele permaneça lá por 1 min. Depois de 1 min, use um pedaço fresco de tira de esponja para absorver qualquer enrofloxacina restante. Repita este processo mais duas vezes.</li>
	<li>Após a terceira lavagem, adicione algumas gotas de soro fisiológico à abertura e deixe que ela permaneça lá por 1 min. Depois de 1 min, use um pedaço fresco de tira de esponja para absorver qualquer solução salina restante. Repita este processo de lavagem mais duas vezes e após a terceira lavagem, adicione uma pequena gota de soro fisiológico à abertura.</li>
	<li>Coloque o vidro da tampa sobre a abertura. Use fórceps para garantir que o vidro esteja alinhado sobre a abertura para obter imagens de boa qualidade.</li>
	<li>Enquanto segura suavemente o vidro no lugar, aplique gel adesivo de cianoacrilato (Tabela de Materiais) ao redor do perímetro do vidro para selar as bordas da janela ao crânio. Certifique-se de não deixar a cola escoar sob o vidro de cobertura, e manter o máximo de cola fora da superfície do vidro de cobertura possível.</li>
	<li>Aplique uma camada de super cola sobre o gel adesivo. Adicione uma camada de líquido de cimento dental sobre a cola para permitir que ela endureça.</li>
	<li>Pegue uma placa de cabeça do tipo helicóptero de tamanho apropriado e aplique uma fina camada de cola ao redor da abertura central. Coloque a placa da cabeça sobre o vidro de cobertura e deixe a cola secar brevemente.</li>
	<li>Em um tubo de microfuça de 1,5 mL, adicione o pó de cimento dental à marca de 0,1 mL no tubo. Adicione 7-8 gotas de cura rápida, adesivo instantâneo e misture. Desenhe em uma seringa de 1 mL com uma agulha de 19 G que foi cortada para criar uma abertura maior.</li>
	<li>Injete a mistura através dos orifícios laterais da barra de helicóptero até que ela escoe de ambos os lados. Aplique a mistura de cimento/adesivo dentário ao resto do crânio exposto para fixar a placa de cabeça no crânio, o que reduzirá os artefatos de movimento durante a imagem.</li>
	<li>Deixe a mistura secar ao ar por pelo menos 15 minutos.</li>
	<li>Injete 0,5 mL de soro fisiológico subcutâneamente para ajudar na recuperação.</li>
</ol>6. Pós-operação
<ol><li>Remova o mouse do quadro estereotaxic e devolva-o à gaiola.</li>
	<li>Coloque uma parte da gaiola em uma manta de re-circulação de água, almofadas de aquecimento de gel espacial ou almofadas isotermais para ajudar na recuperação.</li>
	<li>Fornecer ao animal uma pequena dose de pelotas de alimentos e alimentos molhados, além de sua dieta regular, para ajudar ainda mais na recuperação. Adicione novas pelotas de alimentos e alimentos molhados todos os dias após a cirurgia durante a recuperação.</li>
	<li>No dia seguinte à cirurgia, injete camundongos uma vez com 5 mg/kg de carprofeno e 5 mg/kg enrofloxacina.</li>
	<li>Nos dias 2-6, injete os camundongos uma vez com 5 mg/kg de carprofeno e duas vezes com 5 mg/kg enrofloxacina, aguardando aprovação do IACUC local. Separe as injeções de enrofloxacina por pelo menos 8 h.</li>
	<li>Nos dias 7 a 20, injete os ratos diariamente com 5 mg/kg de carprofeno.</li>
</ol>7. Habituação animal para imagem
<ol><li>No dia 14, após a cirurgia, examine a janela craniana para obter clareza óptica. Não use camundongos com janelas não claras ou danificadas (ou seja, angiogênese excessiva).</li>
	<li>Verifique se há expressão tdTomato sob um microscópio de fluorescência. Se as células rotuladas puderem ser identificadas, proceda com a habituação animal.</li>
	<li>Primeiro dia de habituação (manuseio)<ol>
<li>Segure o mouse por alguns minutos e devolva-o à sua gaiola após o manuseio. Repita o manuseio três vezes com um intervalo de 15 minutos entre as sessões.</li>
		<li>Após o terceiro ensaio, habite o rato embrulhando o animal em um pequeno pedaço de pano.</li>
		<li>Segure o mouse enrolado em pano por aproximadamente 1 min.</li>
		<li>Após o julgamento, devolva o rato para sua gaiola. Repita este processo mais duas vezes, permitindo um intervalo de 15 minutos entre cada ensaio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segundo dia de habituação<ol>
<li>Pese e grave o peso do rato.</li>
		<li>Enrole o rato em pano e fixe-o através de sua placa de cabeça para o braço de fixação da cabeça da gaiola doméstica levantada a ar.</li>
		<li>Deixe a gaiola em casa exposta à luz.</li>
		<li>Deixe o mouse permanecer preso na gaiola doméstica móvel por 15 minutos.</li>
		<li>Após a habituação, remova o mouse da gaiola doméstica e desligue o fluxo de ar.</li>
		<li>Pese o rato e devolva-o para sua gaiola. Tome cuidado para incluir apenas camundongos que não perdem mais de 10% de seu peso corporal. Exclua camundongos que perdem mais de 10% de seu peso durante qualquer dia de habituação de experimentos de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Terceiro dia de habituação e além<ol>
<li>Pese e grave o peso do rato antes de segurá-lo à gaiola de ar.</li>
		<li>Segure o mouse na gaiola de casa levantada pelo ar.</li>
		<li>Cubra a gaiola doméstica com algo que forneça um interior escuro, como uma caixa, e deixe que o mouse permaneça seguro por 30 minutos.</li>
		<li>Depois de 30 minutos, descubra a gaiola, remova o mouse e desligue o fluxo de ar.</li>
		<li>Pese e grave o peso do mouse após a habitação.</li>
		<li>Repita este processo todos os dias, aumentando a duração do mouse é fixado na gaiola doméstica em 15 minutos. Continue este processo até que o mouse possa ser fixado na gaiola doméstica por 1,5 h, pois esta é a duração aproximada de uma sessão de imagem de dois fótons.</li>
		<li>Para habituar o mouse ao ruído, realize algumas sessões de habitação no microscópio para aclimatar o mouse ao som dos espelhos de varredura a laser. Exclua camundongos que não habituam o suficiente (ou seja, vocalizações e defecação induzida pelo estresse).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Imagem multifoton
<ol><li>Comece a imagem 3 semanas após a cirurgia para permitir que a janela se limpe.</li>
	<li>Realize imagens em um microscópio multifoton personalizado ou comercialmente disponível equipado com um laser Ti:Sapphire. Adquira imagens usando um objetivo de imersão de água de alta abertura numérica (NA). NOTA: A imagem de dois canais é obtida usando um espelhodicróico de 565 nm e dois tubos fotomultiplier externos. Um filtro de bandpass 535/50 é usado para detectar emissão de GCaMP6f, e um filtro de bandpass 610/75 é usado para detectar tdTomato. Um objetivo de imersão em água de 25x (1,05 NA) e scanners ressonantes foram utilizados para adquirir imagens mostradas na Figura 1 e Figura 2. Cada região de interesse consistia em uma pilha de imagens separadas axially por 1 μm. Cada seção óptica foi coletada em 512 x 512 pixels, 0,18 μm/pixel. As imagens foram adquiridas da região do primeiro membro do córtex motor primário, conforme determinado pelas coordenadas estereotributicas.</li>
	<li>Defina o comprimento de onda do laser para 920 nm (990 nm se um GECI de mudança vermelha for usado).</li>
	<li>Coloque o mouse na gaiola doméstica móvel e aperte a placa da cabeça no braço de fixação da cabeça.</li>
	<li>Adicione algumas gotas de água ao centro da janela.</li>
	<li>Usando o modo de campo largo do microscópio, selecione 2-3 posições de vasculatura facilmente identificável. Salve as imagens desses vasos sanguíneos e registe as coordenadas X e Y que aparecem no controlador do motor para realocar os dendritos rotulados por TdTomato para sessões de imagem subsequentes. Ajuste as coordenadas X e Y cada vez para realinhar com as imagens salvas dos vasos sanguíneos.</li>
	<li>Uma vez que a vasculatura tenha sido imageda e as posições registradas, localize as regiões com neurônios expressando tdTomato (Figura 1). Imagem as estruturas sinápticas (dendritos e axônios) de neurônios e atividade GCaMP6f em astrócitos. NOTA: Os dendritos servirão como marcos para retornar de forma confiável às mesmas regiões e imagem dos mesmos dendritos e astrócitos ao longo de dias repetidos. Não foi observada mudança detectável no plano de imagem com fixação estável da cabeça e após a fixação da cabeça. O deslocamento que ocorre nas direções X e Y é corrigido por movimento.</li>
	<li>Após a imagem, devolva o rato para sua gaiola. NOTA: Os ratos são normalmente mantidos no escopo por um máximo de 2 h. Quando a imagem dura muito tempo, a água sob o objetivo pode secar. A água deve ser adicionada durante os experimentos. Alternativamente, um gel ultrassônico pode ser usado em vez de água.</li>
</ol>

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<li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li>
<li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422(2014).</li>
</ol>

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação de janelas cranianas crônicas para imagens in vivo de astrócitos cortical e neurônios em ratos acordados e com cabeça em uma gaiola doméstica levantada pelo ar. Exemplos específicos foram fornecidos da aplicação da janela craniana para astrócitos de imagem que expressam GECIs e estruturas sinápticas neuronais. Com o uso de microscopia multifotítica, a dinâmica de sinalização de cálcio astrócito e a dinâmica sináptica estrutural podem ser registradas repetidament...

A capacidade de realizar microscopia de fluorescência in vivo multifotônio no córtex dos camundongos é primordial para o estudo da sinalização celular e estrutura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, patologia da doença 10,11, e desenvolvimento celular12,13 . Com a implantação de janelas cranianas crônicas, é possível imagens longitudinais, permitindo imagens repetidas de áreas corticais por dias, semanas ou meses13,14 em animais vivos. A microscopia multifotônio é ideal para imagens in vivo, repetidas devido à melhor sondagem de profundidade e fotodamagem reduzida associada ao laser infravermelho utilizado. Isso permite o estudo da dinâmica molecular e celular de células específicas em várias regiões corticais.
A microscopia multifotal tem sido utilizada para imagens in vivo de células neuronais e gliais em camundongos 15,16,17,18,19,20. Várias estratégias podem ser implementadas para rotular determinados tipos de células e áreas de interesse. Uma abordagem comum é conduzir a expressão de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas de forma específica das células usando o sistema de recombinação Cre-Lox. Isso pode ser realizado com camundongos geneticamente modificados, por exemplo, cruzando o tdTomato "floxed" mouse (Ai14) com um mouse expressando Cre-recombinase sob um promotor de interesse21. Alternativamente, a rotulagem específica de células e locais pode ser alcançada com injeções virais. Aqui, um vírus codificando Cre recombinase sob um promotor específico de células e um vírus codificando um gene de interesse floxed são injetados em uma região definida. Os tipos de células apropriados que recebem ambos os vetores virais expressarão os gene(s" desejados. Esses genes podem ser marcadores estruturais, como o tdTomato, para ver mudanças na morfologia celular22 ou indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como GCaMP e/ou RCaMP, para examinar a dinâmica do cálcio23. Métodos de recombinação genética podem ser aplicados individualmente ou em combinação para rotular um ou mais tipos de células. Uma terceira abordagem, não exigindo camundongos transgênicos ou construtos virais (que têm capacidade limitada de embalagem), está na eletroporação uterótera de construçõesde DNA 24. Dependendo do tempo da eletroporação, diferentes tipos de células podem ser direcionados 25,26,27.
Ao realizar imagens multifoton, os ratos podem ser visualizados enquanto estão acordados ou anestesiados. A imagem de ratos acordados pode ser realizada prendendo o mouse através de uma placa de cabeçaanexada 28. Essa abordagem torna-se menos estressante ao permitir a circulação relativamente livre do animal usando métodos, como bolas de isopor de flutuação livre, apoiadas pelo ar29, esteiras flutuantes1 ou um sistema de gaiola doméstica com ar levantado por ar onde os ratos são presos por uma placa de cabeça anexada e autorizados a se mover em uma câmara aberta30. Para cada uma dessas condições de imagem, primeiro será necessário habituar os ratos à configuração de imagem. Este artigo descreve o procedimento de habitação e imagem usando um sistema de gaiola doméstica com ar.
Este protocolo descreve a implantação de uma janela craniana crônica para imagens longitudinais in vivo no córtex. Aqui, usaremos camundongos que expressam condicionalmente GCaMP6f em astrócitos para monitorar a dinâmica de sinalização de cálcio. Além disso, este artigo descreve o procedimento para injeções virais usando tdTomato como um rótulo para neurônios. Isso permite a determinação de mudanças na estrutura sináptica neuronal e/ou a disponibilidade como marcador estrutural que permite imagens repetidas do mesmo astrócito. Ao longo do protocolo, serão destacadas etapas cruciais para garantir a melhor qualidade possível das imagens obtidas a partir da microscopia multifoton.

<table><tbody><tr><td>15o Lâmina pontiaguda</td><td>Surgistar</td><td>6500</td><td>Ferramentas de cirurgia</td></tr><tr><td>19 G Agulhas</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Fornecimento de cirurgia</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>Vetor viral</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>Vetor viral</td></tr><tr><td>Acteone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>Almofadas</td></tr> de preparação de álcool reagente <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>Covidien 5750</td><td>Fornecimento de cirurgia</td></tr><tr><td>Beveler</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Vidro de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Fornecimento</td></tr><tr><td>de cirurgia Brocas de carboneto</td><td>SS White Dental</td><td>14717</td><td>Ferramentas de cirurgia</td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl), 50 mg/mL</td><td>Zoetis Mylan Institucional, LLC.Drug</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ar Comprimido</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022-523</td><td>Aplicadores de Ponta de Algodão para Cirurgia</td></tr><tr><td></td><td>Puritan</td><td>836-WC NO BINDER</td><td>Vidro de Cobertura para Suprimentos de Cirurgia</td></tr><tr><td>, espessura nº 1, 3 mm/5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720, 64-0700</td><td>Equipamento</td></tr><tr>de <td></td><td>Cirurgia Dental para Furadeira</td><td>Asséptica</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona, 4 mg/mL</td><td>Mylan Institucional, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção de Drogas</td><td>Nikon</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Duralay Liquid&nbsp; (líquido de cimento dentário)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-8518</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Duralay em Pó&nbsp; (pó de cimento dentário)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-7932</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Enrofloxacina, 2.27%</td><td>Bayer</td><td></td><td>Drug</td></tr><tr><td>Pomada para os Olhos</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Fornecimento de</td></tr><tr><td>Cirurgia Fiber Lite Iluminador de Alta Intensidade Pinça</td><td>de Equipamento da Dolan-Jenner Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Grande)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de Cirurgia Fórceps ( Pequeno)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>501764</td><td>Ferramentas de Cirurgia</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No: 024105</td><td>Linha de camundongos</td></tr><tr><td>Germinador</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No: 012586</td><td>Linha de camundongos</td></tr><tr><td>Placa de cabeça</td><td>Neurotar</td><td>Modelo 1, Modelo 3</td><td>Fornecimento de Cirurgia</td></tr><tr><td>Fórceps Hemostático</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td>Suporte de ferramentas de cirurgia</td></tr><tr><td>para lâmina de 15o Pointed</td><td>World Precision Instruments</td><td>501247</td><td>Suporte de ferramentas de cirurgia</td></tr><tr><td>para lâminas de bisturi</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Ferramentas</td></tr> <tr>de cirurgia<td>Almofadas de preparação de iodo</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>Fornecimento de cirurgia</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fornecimento de cirurgia</td><td>piramal</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de mesa de isoflurano com caixa de indução</td><td>Equipamento de aparelho</td><td></td><td></td>Harvard</tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Equipamento</td><td>SurgiVet</td><td></td></tr><tr><td>Cola Krazy</td><td>Office Depot</td><td>KG517</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>40140</td><td>adesivo instantâneo de cura rápida</td></tr><tr><td>Loctite 454</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9194415</td><td>gel adesivo de cianoacrilato</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Equipamento</td></tr> Equipamento de <tr><td></td>microscópio <td></td><td></td><td>multifotônico</td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td>Matheson</td><td>NI M200</td><td>Gás</td></tr><tr><td></td><td>Oxigênio Matheson</td><td>OX Sistema</td><td></td></tr> de <tr><td>microinjeção intracelular</td>M250<td>Gas Picospritzer</td><td>Parker</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta</td><td>Rainin</td><td>17014340</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Supply Aparador de Cabelo para Roedores</td><td>Wahl</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Saline (0.9% Sodium Chloride)</td><td>Med Lâminas de</td> Bisturi para <td>Cirurgia</td><td>Vet International RX0.9NACL-30BAC</td></tr><tr><td>, Tamanho 11</td><td>Integra</td><td>4-111</td><td>Ferramentas de Cirurgia</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>World Precision Instruments</td><td>503667</td><td>Ferramentas de Cirurgia</td></tr><tr><td>Equipamento</td>de <td>Armazenamento</td><td></td> de<td>Instrumentos Estereotáxicos</td></tr><tr><td>Sugi Sponge Strips (tiras de esponja)</td> <td>Kettenbach Dental</td><td>31002</td><td>Surgery Supply</td></tr><tr><td>SURGIFOAM (espuma de gel)</td> <td>Ethicon</td><td>1972</td><td>Seringa de Suprimentos de Cirurgia</td></tr><tr><td>com Agulha de 26 G</td><td>BD</td><td>309625</td><td>Cirurgia Fornecimento</td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Ti: Laser de Safira</td><td>Equipamento Coerente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Fornecimento de</td></tr><tr><td>Cirurgia Manta de Água</td><td>Fisher Scientific Equipment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilocaína MPF com Epinefrina (1:200.000), 10 mg/ mL</td><td>Fresenius Kabi EUA</td><td></td><td>Droga</td></tr></tbody></table>

implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Para entender completamente a fisiologia celular dos neurônios e da glia no comportamento dos animais, é necessário visualizar sua morfologia e registrar sua atividade in vivo no comportamento de camundongos. Este artigo descreve um método para a implantação de uma janela craniana crônica para permitir a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça. Em combinação com estratégias genéticas e injeções virais, é possível rotular células específicas e regiões de interesse com marcadores estruturais ou fisiológicos. Este protocolo demonstra como combinar injeções virais para rotular neurônios nas proximidades de astrócitos que expressam GCaMP6 no córtex para imagens simultâneas de ambas as células através de uma janela craniana. Imagens multifoton das mesmas células podem ser realizadas por dias, semanas ou meses acordados, comportando animais. Essa abordagem fornece aos pesquisadores um método para visualizar a dinâmica celular em tempo real e pode ser aplicada para responder a uma série de perguntas em neurociência.

A qualidade da janela craniana pode ser avaliada pelo quão nítidas as estruturas neuronais aparecem. Em uma boa janela, espinhos dendráticos são claramente visíveis (Figura 1). Com os dados estruturais e posicionais armazenados, o mesmo animal pode ser imageado repetidamente por dias, semanas ou meses para examinar as mesmas células (Figura 1). As imagens na Figura 1 foram obtidas da região do primeiro quarto do córtex motor primári...

Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

O protocolo descreve como realizar injeções virais e implantar uma janela craniana para imagens de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça. A vantagem deste método é que a estrutura e a atividade dos neurônios e astrócitos podem ser imagens repetidamente ao longo de várias sessões. Essa abordagem pode ser usada para determinar como as células neurais são alteradas em modelos de distúrbios neurodesenvolvimentantes ou neurodegenerativos, ou se a plasticidade dependente da experiência é prejudicada.Comece prendendo um mouse anestesiado em uma estrutura estereotaxic usando o grampo de focinho e as barras de ouvido. Utilizando ferramentas cirúrgicas estéreis, corte e remova a pele das suturas frontais anteriores à bregma posteriormente à lambda. Usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono de tamanho 11 estéril, raspe suavemente todo o tecido conjuntivo do crânio.Com a ajuda de uma broca dentária, perfura gradualmente o osso do crânio ao longo do contorno da abertura em círculos concêntricos para facilitar o afinamento do osso. Após cada passe concêntrico, adicione uma gota, ou duas de soro fisiológico à área perfurada, e deixe o soro fisiológico sentar-se por pelo menos 10 segundos antes de retomar a perfuração. Empurre suavemente a área central do osso do crânio com fórceps finos para verificar se o crânio está adequadamente diluído e se move.Certifique-se de que a vasculatura subjacente onde a perfuração ocorreu está intacta, e que o osso não está rachado. Insira cuidadosamente uma lâmina pontiaguda em miniatura de 15 graus no osso fino e corte e use a espuma de gel encharcada em soro fisiológico para impedir qualquer sangramento que possa ocorrer. Usando fórceps, levante cuidadosamente e remova o osso, tomando cuidado para não danificar a dura-máter.Para a injeção, encha uma pipeta de vidro estéril com uma ponta de 20 micrômetros com a mistura do vírus. Em seguida, baixe a pipeta para tocar a superfície do cérebro, e continue a baixar por mais 200 a 300 micrômetros para injeções de camada 2/3. Usando um sistema de dispensa de microinjeção intracelular, a pressão injeta o sistema de 12 a 15 vezes ao longo de dois minutos.Para a implantação da janela craniana, coloque o vidro da tampa sobre a abertura no crânio. Use fórceps para garantir que o vidro esteja alinhado sobre a abertura. Para selar as bordas da janela de vidro ao crânio, aplique gel adesivo de cianoacrila ao redor do perímetro da superfície de vidro.Sobre o gel adesivo, aplique uma camada de cola. Em seguida, adicione uma camada de líquido de cimento dental. Quando o cimento dentário endurecer, aplique uma fina camada de cola ao redor da abertura central da placa principal tipo helicóptero, e coloque a placa principal tipo helicóptero do tamanho apropriado sobre o vidro de cobertura.Deixe a cola secar. Adicione pó de cimento dental em um tubo de microfuça de 1,5 mililitro até a marca de 0,1 mililitro. Misture sete a oito gotas de adesivo instantâneo de cura rápida no pó, e desenhe a mistura resultante em uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 19 que foi cortada para criar uma abertura maior.Injete a mistura de pó através dos orifícios laterais da barra de helicóptero até que ela escoa de ambos os lados. Aplique a mistura de adesivo de cimento dental ao resto do crânio exposto para fixar a placa da cabeça no crânio. Enrole o rato em pano e fixe-o através de sua placa da cabeça no braço de fixação da cabeça da gaiola de origem, em seguida, deixe a gaiola de casa exposta à luz.Após um tempo de habituação de 15 minutos, remova o mouse da gaiola doméstica. Usando o modo de campo largo do microscópio, selecione duas a três posições de vasculatura facilmente identificável. Salve as imagens dos vasos sanguíneos e regissou as coordenadas x e y que aparecem no controlador do motor.Imagem as estruturas sinápticas de neurônios, e atividade GCaMP6f em astrócitos. Na análise representativa, a qualidade da janela craniana foi avaliada com imagens repetidas de dendritos e astrócitos expressos gCaMP6f ao longo dos dias. Em uma boa janela, as estruturas neuronais pareciam nítidas com espinhas dendríticas claramente visíveis.Duas espinhas novas apareceram no segundo dia de imagens. Apenas uma coluna persistiu e foi visível no quinto dia. A atividade de cálcio foi estudada em astrócitos expressando GCaMP6f em diferentes momentos.Um evento global que abrange toda a célula foi testemunhado durante uma luta de locomoção. As duas etapas críticas deste protocolo são que o osso precisa ser adequadamente diluído antes da remoção do osso, e a colocação adequada do vidro de cobertura sobre a abertura. A imagem pode ser combinada com a análise comportamental, seja durante a imagem, ou pós-comportamento, como aprender uma nova habilidade motora, para determinar como a estrutura e função neuronal e astrócito é modulada pelo aprendizado.

implantation-cranial-window-for-repeated-vivo-imaging-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Ao combinar um polido e reforçado crânio-fino (portas) craniana janela e injeção de células do glioblastoma (GBM), podemos observar glioma iniciação e crescimento de células GBM injetadas no cérebro de um rato vivo longitudinalmente.

Imagem Glioma Iniciação<em&gt; Em Vivo</em&gt; Através de um polido e reforçado Janela crânio-Thin craniana

Este vídeo apresenta um procedimento cirúrgico para implantar janela craniana em um modelo de camundongo para acesso óptico estável a diferentes regiões do cérebro.

Implantação de janela de imagem craniana em modelo de camundongo: um procedimento cirúrgico para implantar lamínula à base de vidro para acesso óptico estável a regiões do cérebro murino

Este vídeo demonstra a gravação da atividade neural do cérebro através de uma janela óptica em camundongos transgênicos. Os camundongos expressam uma proteína fluorescente que permite a detecção de atividades neurais. Uma pequena parte do crânio é cuidadosamente removida para instalar uma janela óptica, e o crânio é então coberto com cimento preto para bloquear a luz antes da imagem.

Instalação de janelas ópticas no cérebro de camundongos transgênicos para imagens de atividades neurais

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as...

Implantação de janela da medula espinhal em um camundongo para imagens in vivo

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.

Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Este protocolo descreve um método cirúrgico em duas fases para criar uma grande janela craniana revedável e preservadora da dura-máter em camundongos. Essa técnica permite registros eletrofisiológicos crônicos e multimodais a partir de redes transmissas profundas do cérebro, como a Rede de Modos Padrão, ao longo de várias semanas.

Protocolo cirúrgico para uma grande janela craniana reselável que permite registros eletrofisiológicos longitudinais e multimodais da rede de modo padrão do camundongo

Aprenda a implantar uma janela craniana crônica para imagem longitudinal de neurônios e astrócitos em camundongos acordados. Este método permite visualizar alterações celulares em modelos de distúrbios neurológicos.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

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