Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3
22 de fevereiro de 2022
Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).
Os métodos descritos neste protocolo fornecerão uma plataforma valiosa para avaliar a maturação funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca. O fluxo de cálcio é observado exclusivamente em ICMs e fornece uma forma de avaliar a maturação funcional do ICM. Esta cepa de mouse simplifica os procedimentos de avaliação e aumenta a reprodutibilidade dos resultados.
Este protocolo é um novo método para avaliar a maturação funcional dos ICMs no campo de reprogramação cardíaca. Também pode ser aplicado para avaliar a diferenciação de cardiomiócitos e a função cardíaca. Comece por obter de oito a 10 filhotes, filhotes P0 a P2 para isolar 10 milhões de fibroblastos cardíacos neonatais, ou NCFs.
Anestesiar profundamente os filhotes por hipotermia. Observe os corações sob o microscópio de fluorescência para garantir que o coração com o genótipo desejado mostre fluxo de cálcio, indicado por GCaMP3 com os corações batendo. Os outros genótipos não mostrarão fluorescência.
Após o isolamento dos corações, corte-os em quatro pedaços de tal forma que eles estejam vagamente conectados. Lave-os completamente várias vezes no soro fisco tamponado de Dulbecco, ou DPBS, em uma placa de seis centímetros para limitar a poluição das células sanguíneas nas células isoladas. Digerir os corações com oito mililitros de 0,25% de trypsin-EDTA em 37 graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante Trypsin e adicione cinco mililitros de 0,5 miligramas por mililitro quente tipo dois colagemnase na solução de sal balanceada de Hank. Vórtice a mistura completamente e incubada a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, novamente, vórtice da mistura completamente e deixar o tecido não digerido se acalmar pela gravidade.
Colete o supernatante em um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de meio fibroblasto frio. Diluir as células com meio fibroblasto de tal forma que a densidade de semeadura esteja em torno de duas a 2,5 vezes 10 para as quatro células por centímetro cúbico. Em seguida, semeou as células em pratos ou pratos.
Os fibroblastos anexados devem ter uma forma oval a redonda no segundo dia após a semeadura. No dia zero, semente os NCFs para a densidade de cerca de um a dois vezes 10 para as quatro células por centímetro cúbico em meio fibroblasto. No primeiro dia, substitua o meio de cultura por um vírus contendo meio para cada um dos desejados.
No dia 2, 24 horas após a infecção pelo vírus, substitua o vírus que contém meio por um meio de ICM regular. Avalie o fluxo de íons de cálcio com um microscópio de fluorescência invertida à temperatura ambiente. Observe as células positivas GCaMP3 sob o objetivo 10X, garantindo que ela mostre células espontâneas batendo no canal brightfield.
Corações com o genótipo correto mostraram fluxo de íons de cálcio sincronizado com batida, visualizado como farinha GCaMP3. Enquanto nenhuma fluorescência foi observada em corações de controle. NCFs isolados ligados ao poço dentro de duas horas e mostraram uma forma oval a redonda um dia após a semeadura.
A oscilação da íon cálcio mostrou a variação da fluorescência GCaMP3 entre o máximo e o mínimo e a oscilação de íons de cálcio dessas células mudou periodicamente. Após a introdução do IMAP, o número de clusters de espancamento foi significativamente maior do que no grupo controlado, pois o número de células positivas GCaMP3 com fluxo de íons de cálcio para um campo de alta potência foi aumentado no grupo médio tratado do IMAP. Os NCFs devem ser recém-preparados e saudáveis após o isolamento.
Um procedimento rápido de isolamento cardíaco, corte e tempo adequado de digestão pode ajudar a evitar a redução da viabilidade e condição celular. Este método fornece uma maneira de identificar ICMs amadurecidos funcionais para pesquisadores de reprogramação cardíaca. Com vários métodos de avaliação adicionais, pode-se obter uma compreensão mais concisa sobre ICMs funcionais maturados.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma nova linhagem de camundongos repórteres, αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, para avaliação da reprogramação cardíaca. O protocolo estabelecido permite a análise de cardiomiócitos induzidos (iCMs) derivados de fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) por meio da análise de fluxo de cálcio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Reprogramação cardíaca
- Cardiomiócitos induzidos
- Análise de fluxo de cálcio
Antecedentes
- O modelo de camundongo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 facilita a pesquisa cardíaca.
- Fibroblastos cardíacos neonatais podem ser convertidos eficientemente em iCMs.
- O fluxo de cálcio atua como um indicador-chave da maturação funcional de iCMs.
- Este método melhora a reprodutibilidade em estudos de reprogramação cardíaca.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer uma plataforma confiável para avaliar a maturação funcional de iCMs.
- Simplificar os procedimentos de avaliação na pesquisa de reprogramação cardíaca.
- Fornecer insights sobre a diferenciação de cardiomiócitos e a função cardíaca.
Métodos Utilizados
- Isolamento de fibroblastos cardíacos neonatais de filhotes P0 a P2.
- Conversão de FCFs em cardiomiócitos induzidos.
- Avaliação da maturação funcional por meio da medição do fluxo de cálcio.
- Avaliação da eficiência de reprogramação e da função cardíaca.
Resultados Principais
- Conversão bem-sucedida de NCFs em iCMs funcionais.
- Fluxo de cálcio observado exclusivamente em iCMs indica maturação.
- Reprodutibilidade aprimorada dos resultados em estudos de reprogramação cardíaca.
- Protocolo aplicável para avaliação da diferenciação de cardiomiócitos.
Conclusões
- O modelo de camundongo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 é uma ferramenta valiosa.
- A análise do fluxo de cálcio é eficaz para avaliar a maturação de iCMs.
- Este método pode avançar a pesquisa em reprogramação cardíaca e função.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da maturação funcional de cardiomiócitos induzidos continua sendo um gargalo crítico no reprogramamento cardíaco para terapias regenerativas. Este protocolo fornece uma leitura direta, baseada em repórter, do fluxo de cálcio que permite a avaliação objetiva da maturidade funcional de iCMs, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao vincular o reprogramamento transcricional à saída eletrofisiológica funcional, ele aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos e orienta decisões sobre estratégias de reparo cardíaco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao vincular a entrega de fatores de transcrição (MGT) a leituras funcionais de transitórios de cálcio em células reprogramadas.
- Valor Operacional: Utiliza a fluorescência do GCaMP3 para isolar iCMs com reprogramação bem-sucedida, reduzindo a dependência de marcadores indiretos como a expressão gênica.
- Valor Preditivo: O fluxo de cálcio atua como um biomarcador funcional que apoia a redução de riscos biológicos e a confiança no alvo em abordagens de reprogramação cardíaca.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Estabelece uma plataforma padronizada baseada em fluorescência para quantificar o fluxo de cálcio como uma variável dependente quantitativa em ensaios de maturação de iCMs.
- Reprodutibilidade: A linhagem de camundongos repórter garante detecção consistente de iCMs funcionais entre experimentos, apoiando a padronização do ensaio.
- Escalabilidade: Compatível com microscopia de fluorescência e adaptável a sistemas de imagem de maior produtividade para triagem da eficiência de reprogramação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Fornece um sistema relevante para a doença para avaliar a maturação funcional de iCMs in vitro, conectando a descoberta à validação pré-clínica.
- Continuidade Tradutiva: Permite a avaliação longitudinal da maturação de iCMs desde os estágios iniciais de reprogramação até a competência eletrofisiológica funcional.
- Redução de Riscos Mecanísticos: As medições de fluxo de cálcio ajudam a distinguir células estruturalmente reprogramadas de iCMs funcionalmente maduros, reduzindo resultados falso-positivos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, permitindo especificamente a avaliação funcional após a reprogramação transcricional, mas antes da validação in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao determinar se os fatores de reprogramação induzem não apenas a expressão de marcadores, mas também o manejo funcional de cálcio.
- Triagem: Fornece sistemas biológicos prontos para ensaios e reproduzíveis, com leituras quantitativas de fluxo de cálcio para comparação de compostos ou condições.
- Análises: Gera dados temporais baseados em fluorescência sobre a frequência e amplitude das oscilações de cálcio, permitindo comparação estatística de condições de reprogramação.
- Pesquisa Translacional: Conecta os resultados de reprogramação in vitro a fenótipos funcionais de cardiomiócitos relevantes para modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de repórter reutilizável, aplicável a múltiplos alvos de reprogramação cardíaca e protocolos de diferenciação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece medida direta da maturação funcional, reduzindo ambiguidade mecanicista nos resultados de reprogramação.
- Valor Operacional: Aprimora padronização e reprodutibilidade por meio da especificidade do marcador genético, minimizando a variabilidade dos métodos baseados em anticorpos.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao vincular reprogramação molecular à prontidão eletrofisiológica funcional.
- Impacto no Portfólio: Permite priorização ajustada ao risco de estratégias de reprogramação com base no rendimento funcional de iCMs e na qualidade de maturação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em criação de camundongos, isolamento de tecido cardíaco e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso à linhagem de camundongos αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e a sistemas virais de entrega para MGT.
- Necessita condições e cronograma de cultura padronizados para indução consistente de iCMs e avaliação do fluxo de cálcio.
- A adaptação a outras fontes de fibroblastos ou espécies pode exigir validação da especificidade do marcador e da fidelidade da sinalização de cálcio.
- As limitações práticas incluem a dependência da contração espontânea para visualização do fluxo e a variabilidade potencial na eficiência de transfeção.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
