Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Micróbios associados a hospedeiros compõem esse ecossistema muito complexo que realmente requer imagens para serem compreendidas. E através dessa partícula, vamos mostrar como passar pelo processo de coloração e alcançar a visualização da interface do microbioma hospedeiro. Entender a biologia das bactérias associadas ao hospedeiro requer uma compreensão de sua localização dentro de micro ambientes.

E essa técnica nos permitirá visualizar a taxa individual dentro dos ambientes hospedeiros, bem como dentro do contexto de outras bactérias. Através desta técnica, será possível determinar quais bactérias podem ter penetrado através do tecido hospedeiro, bem como determinar se características-chave como o muco hospedeiro podem ser esgotadas. Prepare methacarn fresco em um recipiente compatível com metanol 60% absoluto, clorofórmio 30% e ácido acético 10%.

Usando ferramentas afiadas e limpas, corte segmentos intestinais dos camundongos para imagem. Minimize perturbar a amostra o máximo possível e manuseie as seções por seus cumes para evitar afetar a área de imagem. Fixar a amostra o mais rápido possível após a dissecação para evitar a degradação.

Coloque as seções intestinais em fitas histologias segurando delicadamente uma borda do tecido com pinças. Feche o e submerse completamente em uma solução de methacarn fresco, garantindo que a solução não seja mais antiga do que algumas horas após a imersão das fitas. Para amostras clínicas que serão coletadas em um conjunto clínico sem acesso a um capô de fumaça, use um recipiente de armazenamento de polietileno com um retalho cortado na tampa que permitirá a passagem dos de histologia.

Fita esta aba fechada quando não passa amostras para evitar a fuga de fumaça tóxica. Coloque a parafina em um recipiente resistente ao calor e derreta em um forno a 60 graus Celsius durante a noite. Lave o tecido derramando o líquido no recipiente de resíduos apropriado e incubando-o sequencialmente em metanol absoluto, etanol absoluto e xileno, conforme descrito no manuscrito do texto.

Abra ligeiramente as fitas para permitir que a parafina entre sem perder os segmentos de tecido usando luvas duplas ou pinças. Submersa e feche as fitas no recipiente de parafina derretida. Coloque o recipiente de volta no forno Celsius de 60 graus, garantindo que as fitas estejam cheias de parafina e que não permaneçam grandes bolhas de ar.

Após a incubação por duas horas, retire o recipiente do forno. Usando fórceps, remova cuidadosamente as fitas. Aqueça o forno a 60 graus Celsius e pré-aqueça um frasco de Coplin.

Adicione volume suficiente de xileno em uma garrafa de vidro para cobrir as lâminas de vidro no frasco duas vezes e coloque parafilm ao redor da tampa para evitar a evaporação dos xilenos. Deixe que a temperatura dos xilenos atinja 60 graus Celsius. Prepare a solução de hibridização FISH, conforme mencionado no manuscrito do texto.

Coloque os slides no frasco coplin, garantindo que as seções não entrem em contato com outros slides ou o frasco e asse os slides a 60 graus Celsius por 10 minutos. No capô da fumaça, encha o frasco de Coplin com xileno pré-entubado do forno, tomando cuidado para não derramar diretamente em cima das amostras e potencialmente desalojar os tecidos. Coloque o frasco de Coplin de volta no forno de 60 graus.

Despeje xilenos usados em um recipiente de lixo adequado, tomando cuidado para não perturbar as seções de tecido nas lâminas de vidro e usando um par de fórceps para evitar que os slides caiam do frasco de Coplin. Reponha o frasco de Coplin com os xilenos restantes e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente no capô da fumaça. Incubar as seções em 99,5% de etanol por cinco minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, remova os slides do frasco de Coplin. Limpe a parte de trás dos slides em um lenço de laboratório ou uma toalha de papel e seque brevemente até que as gotículas de etanol se vão. Crie círculos muito próximos em torno de cada seção de tecido usando um bloqueador líquido ou caneta PAP para limitar a área de expansão necessária para ser coberta pela solução de hibridização, evitando o contato com a seção.

Prepare a solução de hibridização e adicione 0,5 microgramas de sonda para cada 50 microliters da solução utilizada. Pipete a solução nas seções do slide. Sobreponha a seção com tampas plásticas flexíveis, garantindo que o volume de líquido utilizado cubra toda a seção.

Crie uma câmara úmida com uma caixa de ponta de pipeta com lenços ou toalhas de papel que foram encharcadas com solução de hibridização em excesso ou PBS para fornecer umidade. Incubar o slide na câmara úmida a 45 a 50 graus Celsius por pelo menos três horas, dependendo da sonda definida para reduzir a evaporação. Remova as tampas plásticas e incuba as lâminas no tampão de lavagem FISH em um frasco de Coplin, ambos pré-armados a 50 graus Celsius.

Coloque o frasco de Coplin de volta no forno Celsius de 50 graus por 10 a 20 minutos. Remova o tampão de lavagem FISH e substitua-o por PBS no frasco Coplin. Imediatamente após reabastecendo o frasco de Coplin com PBS, decante o PBS.

Remova as lâminas do frasco e a pipeta a contra-mancha em cima de toda a seção, certificando-se de não tocar no tecido com a ponta da pipeta. Incubar a 4 graus Celsius por 45 minutos. Lave as manchas três vezes rapidamente com PBS fresco.

Limpe a parte de trás dos slides contra uma toalha de lenço ou papel e deixe que a maioria do PBS evapore as seções auxiliadas por uma linha de vácuo conectada a uma ponta de pipeta. Monte as seções usando um meio de montagem. Afixe as tampas no slide pintando ao longo das bordas do deslizamento com esmalte claro, tomando o cuidado de ficar longe da borda do slide.

Deixe-o definido em temperatura ambiente. Imagens de cólon distal de camundongo monocolonizado com muribaculum intestinal e um bi-colonizado com Muribaculum intestinale e Bacteroides thetaiotaomicron são mostrados aqui. As amostras foram manchadas com uma sonda FISH três primeiras cianoine-3 marcadas específicas para o isolamento muribaculum e também contra-manchadas com a lectina UEA-1 e DAPI com destino à rhodamina.

As imagens de seções manchadas com peixes de cianeina-3, DAPI e canais combinados de peixes e dapi de cianeto e dapi mostram a localização do muribaculum intestinale. Todos os sinais daPI em forma de bactérias e do tamanho de bactérias são rotulados com cianeto-3 no estado de mono-colonização. No estado de dupla colonização, além dessas células cianeina-3 e DAPI dupla positiva, existem células bacterianas manchadas de DAPI que são cianotina-3 negativas como esperado.

Com exceção de bactérias mais filamentosas, estruturas maiores do DAPI positivo são material vegetal ou núcleos de células hospedeiras. Um segmento intestinal que foi seccionado a uma profundidade que fornece uma visão do lúmen, bem como vistas longitudinais do epitélio e um segmento de seção rasa revelando apenas seções transversais de criptas e nenhuma camada de muco constante ou bactérias prova que a seção rasa não fornecerá fatias luminais do intestino. A cobertura desigual do tecido ou da cobertura resulta em tomografias embaçadas e irregularmente iluminadas.

Um exemplo de fundo normal e alto plano de fundo também são mostrados aqui. À medida que aprendemos mais sobre a microbiota, tornou-se realmente óbvio que ensaios em massa como sequenciamento não são suficientes para realmente determinar o que acontece entre diferentes espécies microbianas e como eles interagem juntos. E para isso, realmente precisamos de imagens.

Esse tipo de técnica permitiu algumas descobertas realmente importantes, por exemplo, de que a privação de fibras da dieta causa o afinamento da camada muco e potencialmente infecção por patógenos, como estudos do grupo Martins, bem como estudos sobre os efeitos da diarreia osmótica e como o esgotamento da camada de muco realmente impacta tanto o hospedeiro quanto a microbiota. E estes foram estudos feitos pelo grupo Sonnenberg, bem como nosso grupo.