Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato
March 31st, 2022
Este protocolo descreve um novo ensaio de intensificador-repórter transitório baseado em rAAV. Este ensaio pode ser usado para induzir a expressão impulsionada por potenciadores in vivo no cérebro do rato.
Esse protocolo é significativo porque permite a visualização não apenas se uma sequência de intensificador pode conduzir a expressão, mas também se pode conduzir a expressão em uma parte específica do corpo. É rápido. As injeções levam menos de 10 minutos para serem concluídas, e se e onde um gene repórter é expresso pode ser visto dentro de apenas alguns dias após a coleta da amostra.
Para iniciar a clonagem, escolha ou crie uma construção de repórter. O construto aqui utilizado coloca o candidato potenciador nas três principais regiões não traduzidas de um gene repórter do EGFP expresso sob o controle do promotor mínimo hsp68. Para projetar os primers de PCR para amplificar uma sequência de interesse e clonagem no vetor, adicione o braço de homologia apropriado para clonagem de Gibson à extremidade principal dos primers.
Usando os primers projetados, execute a PCR a partir de uma amostra de DNA. Digerir de um a 10 microgramas de DNA vetorial usando Pac1 e Asc1, dependendo do número desejado de reações de clonagem necessárias. Ao empregar eletroforese de 0,7 a 1% em gel por 30 a 60 minutos a 100 volts, separe os fragmentos de digestão de restrição.
Extraia a banda para o vetor linearizado e purifique-a com um kit comercial de extração em gel. Uma vez concluída a clonagem e transformação de células de Gibson, coloque as células em meio seletivo e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Após verificar a clonagem bem-sucedida do construto repórter, inocular cinco mililitros da cultura inicial usando o estoque de glicerol.
Cultive a cultura por oito a 16 horas em uma incubadora de agitação a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto. À medida que o caldo ficar turvo, dilua a cultura inicial de 1.000x em 250 a 300 mililitros de caldo LB seletivo fresco e incube-o durante a noite em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto. Usando um kit maxi de plasmídeo comercial, purifique o plasmídeo.
Para testar a recombinação dos ITRs, execute uma digestão Xma1. Visualize as bandas. Certifique-se de que seu resumo mostre o número esperado de bandas.
A recombinação resultará em bandas menores do que o esperado. Prepare a mistura de AAV recombinante para entrega. Ao comparar os padrões de expressão de vários vírus repórteres intensificadores, dilua cada vírus para equiparar os títulos do vírus ao vírus menos concentrado.
Misture o vírus do repórter potenciador e o vírus do repórter de controle expresso constitutivamente em uma proporção de dois para um ou três para um. Adicione uma pequena quantidade de corante verde rápido com uma concentração final de 0,06%Quebre a ponta de uma pipeta de vidro puxada feita de um tubo capilar graduado em microlitros, perfurando-a suavemente em um lenço delicado e sem fiapos. Insira a pipeta em um conjunto de aspirador com um dispositivo de aplicação de pressão conectado a uma junta de borracha para segurar uma pipeta microcapilar.
Desenhe um pequeno volume de cerca de 0,2 a 0,5 microlitros de óleo mineral na pipeta aplicando pressão negativa através do aspirador. Mantenha o conjunto do aspirador de lado e coloque o vírus no gelo até que esteja pronto para injetar. Depois de anestesiar crioanestesiar os camundongos neonatais, aplique pressão negativa usando o conjunto do aspirador e puxe a mistura de vírus para a pipeta de vidro puxada até que o menisco passe a marca de escala de dois microlitros.
Tire o mouse da câmara fria e coloque-o na bancada. Localize os locais de injeção bilateral a meio caminho entre o lambda e o bregma, bem como a sutura sagital e cada olho. Higienize-os usando um toalhete com álcool.
Perfure o crânio dos ratos neonatais usando a pipeta de vidro puxada. À medida que a agulha entra no crânio, aplique uma pressão positiva através do conjunto do aspirador. Dispense um microlitro do vírus no ventrículo lateral e retire a pipeta.
Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou uma câmara de aquecimento para recuperar. Devolva o animal para a gaiola de casa uma vez acordado. Grave imagens de fluorescência que atravessam a seção do cérebro usando uma lente subjetiva de baixa ampliação 5x.
Ao localizar o local da injeção, avalie a extensão da transdução do vírus, dependendo da densidade e intensidade das células fluorescentes vermelhas. Compare os animais que foram transduzidos de forma semelhante. Grave imagens fluorescentes com uma lente objetiva de ampliação mais alta de mais de 25x.
Em seguida, abra o software de análise e aplique um filtro mediano de três por três para reduzir o ruído. Clique no menu Processo, clique em Ruído e escolha a opção Despeckle. Em seguida, para subtrair a fluorescência de fundo das imagens, comece separando os canais de uma imagem multicanal.
Clique no menu Imagem, clique em Cor e selecione a opção Dividir canais. Usando a ferramenta de seleção de retângulo ou círculo, desenhe uma pequena forma em uma área da imagem sem células fluorescentes. Meça a intensidade média de pixels do plano de fundo clicando em Analisar e, em seguida, em Medir e repita para a amostra várias vezes.
Faça a média do valor cinza médio de cinco a oito áreas de plano de fundo e solte os valores decimais. Subtraia os valores de cada pixel na imagem selecionando o menu Processo e clique em Matemática e Subtrair. Em seguida, insira o valor em segundo plano a ser subtraído e clique em OK. Se necessário, mescle os canais novamente em uma imagem multicanal selecionando o menu Imagem, clique em Cor e selecione Mesclar canais.
Para contar o número de células fluorescentes verdes, oculte o canal verde e desenhe uma forma ao redor da região do cérebro expressando fluorescência vermelha usando a ferramenta de seleção de forma livre. Clique na função Medir para medir a área, a densidade integrada e o valor cinza médio do canal vermelho na zona selecionada. Conte o número de células verdes usando uma ferramenta de seleção de vários pontos e normalize o número de células verdes pela intensidade integrada do canal vermelho.
Depois de transduzir o intensificador repórter que o rato injetado intracranialmente em P0 com um construto AAV positivo mostrou expressão EGFP impulsionada pelo potenciador nas camadas médias inferiores do córtex 28 dias após a injeção. O rato injetado com uma construção de controlo negativo em P0 não mostra qualquer expressão de EGFP 28 dias após a injeção, demonstrando que os elementos potenciadores são encontrados para conduzir a transcrição de EGFP no cérebro do rato. Para visualizar a área transduzida com sucesso e controlar a variabilidade potencial, foram examinadas bibliotecas de repórteres intensificadores entregues por AAV de diferentes títulos.
A biblioteca de títulos altos de potenciadores candidatos impulsiona a expressão ampla do EGFP, enquanto a biblioteca de títulos inferiores dos potenciadores candidatos impulsiona a expressão CGFP esparsa no cérebro do rato P7. É vital misturar o AAV do repórter potenciador com o controle positivo em cada injeção, a fim de distinguir entre potenciadores sem atividade e partos falhados. Este procedimento pode ser emparelhado com imuno-histoquímica, RNA FISH ou sequenciamento de RNA de célula única para determinar em quais tipos de células um potenciador está ativo.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo ensaio transiente baseado em rAAV para uso in vivo no cérebro de camundongos para visualizar a expressão gênica dirigida por enhancers. O protocolo permite que pesquisadores avaliem rapidamente não apenas se um enhancer pode dirigir a expressão, mas também onde ele pode fazê-lo dentro de regiões cerebrais específicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Expressão Gênica
- Biologia Molecular
Fundo
- Compreender sequências de enhancers é crucial para decifrar a regulação gênica.
- Modelos in vivo fornecem insights sobre padrões de expressão em tecidos específicos.
- Este método permite avaliação rápida da atividade gênica comparada a abordagens tradicionais.
Objetivo do Estudo
- Criar um ensaio eficiente para visualizar a atividade do enhancer em um organismo vivo.
- Facilitar avaliação rápida da expressão gênica reporter no cérebro de camundongos.
- Permitir localização precisa da expressão dirigida por enhancers.
Métodos Usados
- O protocolo utiliza uma abordagem de transdução baseada em rAAV.
- Modelos de cérebro de camundongos são usados para avaliar padrões de expressão após a entrega viral.
- Etapas-chave incluem clonagem de construtos reporter e realização de injeções in vivo.
- A análise de padrões de expressão gênica ocorre apenas dias após a injeção.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida da expressão EGFP dirigida por enhancers em camadas corticais específicas.
- Diferenciação clara entre os efeitos de construtos de controle positivo e negativo.
- Validação dos padrões de expressão indica avaliação eficaz da atividade do enhancer.
Conclusões
- Este protocolo demonstra um novo método para avaliar a função do enhancer in vivo.
- Permite avaliação rápida e localizada da expressão gênica, melhorando nossa compreensão dos mecanismos regulatórios.
- A abordagem é valiosa para estudos futuros explorando a regulação gênica em contextos neurais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, in vivo assessment of enhancer activity in the mouse brain, providing spatial and temporal resolution of gene regulation without requiring transgenic models. It supports target validation by linking non-coding DNA elements to functional expression patterns in disease-relevant neural circuits. The approach accelerates mechanistic de-risking in early discovery by delivering quantitative, imaging-based readouts of enhancer function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate enhancer sequences can drive gene expression in specific brain regions.
- Operational Value: Uses standard cloning and AAV packaging to generate enhancer-reporter libraries for high-throughput screening of regulatory elements.
- Predictive Value: Enables biological de-risking by linking enhancer activity to cell-type-specific expression patterns in the cortex and other neural structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative fluorescence readouts (EGFP intensity) that correlate with enhancer strength and activity patterns across developmental stages.
- Operational Value: Leverages expanding AAV serotypes and standardized imaging workflows for reproducible, scalable enhancer testing across multiple constructs.
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (transduced mouse brain) suitable for downstream applications like immunohistochemistry or single-cell RNA sequencing to define enhancer-active cell types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping enhancer activity to specific cortical layers and developmental timepoints (P0 to P7).
- Translational Continuity: Enables cross-functional collaboration by providing standardized, spatially resolved expression data that can inform biomarker alignment and target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing active enhancers from negative controls through normalized green-to-red fluorescence ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing of non-coding regulatory elements prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing where enhancers drive expression in the mouse brain, linking genotype to phenotype in neural tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized virus production, equitized titers, and co-injection with control reporters to distinguish true enhancer activity from delivery failure.
- Analytics: Enables quantitative comparison of enhancer activity via integrated density measurements and background-subtracted fluorescence imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing follow-up with RNA FISH or immunohistochemistry to determine cell-type specificity of enhancer-driven expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer library screening, leveraging low-cost AAV production and standard microscopy for repeated campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in enhancer function through direct in vivo visualization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled virus titers, background subtraction protocols, and normalized cell counting.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of enhancer candidates without generating and maintaining transgenic lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing clear, imaging-based evidence of enhancer activity in disease-relevant brain regions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for Gibson assembly and viral vector preparation.
- Depends on AAV purification and titration infrastructure for consistent enhancer-reporter delivery.
- Necessitates stereotaxic injection skills and neonatal mouse handling for accurate intracranial delivery.
- Relies on fluorescence microscopy and image analysis tools (e.g., background subtraction, channel splitting) for reliable readout.
- Limited by enhancer context-dependency; activity may vary across developmental stages, brain regions, or disease models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
