Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Macrófagos associados ao tumor anti-inflamatório estão ligados à progressão e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo é um guia para diferenciar e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Atualmente não existe um modelo estabelecido para a polarização anti-inflamatória do THP-1.

Este protocolo utiliza períodos de descanso adequados e um processo de polarização prolongado para criar um subtipo de macrófago distinto semelhante ao M2. O desenvolvimento tumoral, por exemplo, no câncer de cólon e na remodelação de tecidos, são controlados por macrófagos anti-inflamatórios. Entre os estudos que investigam sua função, a criação padronizada de um subtipo distinto semelhante ao M2 garante achados reprodutíveis.

Comece definindo um temporizador por 150 segundos. Remova o frasco congelado contendo a linha celular THP-1 do nitrogênio líquido e descongele o frasco imediatamente a 37 graus Celsius em um banho de água limpa, iniciando o temporizador assim que o frasco for colocado no banho de água. Solte a tampa para liberar a pressão acumulada devido ao processo de descongelamento, garantindo que a abertura do tubo não entre em contato com a água para evitar contaminação.

Descongele a suspensão da célula até que um chip de gelo de cerca de quatro milímetros de tamanho seja deixado dentro do frasco e prossiga para o próximo passo imediatamente. Transfira a fase líquida da suspensão celular para um tubo de 15 mililitros contendo nove mililitros de mídia de crescimento quente. Em seguida, transfira um mililitro desta suspensão celular média quente para o frasco THP-1 e volte para o tubo de 15 mililitros para derreter o chip de gelo restante, e lave o frasco para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás.

Misture a suspensão suavemente, escoando-a para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Remova aproximadamente 10 microliters da amostra para contar as células para viabilidade usando o azul trypan. As células com citoplasma claro são viáveis, um citoplasma azul indica morte celular.

Enquanto estiver contando, gire a suspensão da célula quente a 200 vezes G por sete minutos a 37 graus Celsius. Remova o supernatante completamente e resuspende as células em meio de crescimento para alcançar uma densidade celular de 500.000 células por mililitro. Misture a suspensão suavemente e transfira 22 mililitros em frascos de cultura celular T75 cada um.

Armazene os frascos em pé em uma incubadora a 37 graus Celsius com uma concentração de dióxido de carbono de 5% e troque a mídia de crescimento a cada três ou quatro dias. Prepare a suspensão celular para semear as células a uma densidade de 300.000 por mililitro por poço em placas de cultura celular de 24 poços. Misture o meio suavemente e uma alíquota de 26 mililitros em tubos de 50 mililitros.

Transfira um mililitro do meio contendo células em cada poço de uma placa de 24 poços. Misture a mídia suavemente, encalhando-a para cima e para baixo entre as transferências. Mantenha a solução de trabalho recém-preparada de PMA no gelo e adicione 100 nanogramas de PMA por poço.

Incubar as placas na incubadora sem qualquer tratamento adicional por 72 horas. Após 72 horas, retire o meio de crescimento e substitua-o por um mililitro de meio de crescimento fresco, garantindo não tocar na parte inferior dos poços com pontas de pipeta. Deixe as células descansarem por mais 96 horas na incubadora.

Remova o meio de crescimento e substitua-o por um mililitro de meio de crescimento fresco. Adicione 20 nanogramas de interleucina 4 e 20 nanogramas de interleucina 13 por poço. Em seguida, deixe as células descansarem por 48 horas na incubadora.

Repita todo o processo após 48 horas e deixe as células descansarem por mais 48 horas na incubadora. Remova o meio de crescimento e substitua-o por um mililitro de meio de crescimento fresco. Em seguida, deixe as células descansarem por 48 horas na incubadora.

Remova o meio celular quente de cada poço e substitua-o por uma mistura de um mililitro de PBS gelado sem cálcio e magnésio e 5%FBS. Em seguida, coloque imediatamente a placa de célula no gelo por 45 minutos. Depois de 45 minutos no gelo, raspe as células usando mini raspadores de células.

Transfira suavemente os macrófagos separados para PBS frio e 5% FBS em um tubo de 15 mililitros mantidos no gelo. Os macrófagos derivados do método de polarização mostram a expressão do CD14, bem como marcadores CD11b. Os marcadores monócito e macrófago CD14 e CD11b foram expressos em 70,9% e 74,7% das células, respectivamente.

As células apresentaram baixos níveis de superfície do marcador M1 CD80 em 0,2% das células, e altos níveis de superfície do marcador M2-like CD206 em 62,6% das células. Como as células THP-1 em média tendem a afundar-se ao fundo de um frasco e são fáceis de ativar através de estresse mecânico, a mistura suave e o manuseio das células é importante. Macrófagos semelhantes a M2 são criados de forma reprodutivelmente, e foram caracterizados usando QR-TPCR, ELISA e citometria de fluxo.

Esta é a base para investigar mecanismos anti-inflamatórios no desenvolvimento do câncer ou remodelação de tecidos.