Name: Síntese e Caracterização de Gotículas de Porfirina multimodal de mudança de fase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a síntese e caracterização de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase usando condensação de microbolhas por resfriamento. Este método simples permite criar droplets sem pressurização para aplicações em neurociência e ciência de materiais.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Brandon Helfield por ajudar a construir o trocador de gás e o Dr. Miffy Hok Yan Cheng por discussões técnicas. Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: Ontário Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute e Princess Margaret Cancer Foundation.

<ol><li>Gramiak, R., Shah, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiography+of+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Radiology%22%5BJournal%5D)">Echocardiography of the aortic root.</a> Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).</li>
<li>Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble+contrast+agents%3A+fundamentals+and+application+to+gene+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).</li>
<li>Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+%28BBB%29+disruption+using+a+diagnostic+ultrasound+scanner+and+Definity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).</li>
<li>Helfield, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+accumulation+of+submicron+phase-change+droplets+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891(2020).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Ultrasonics%2C+Ferroelectrics%2C+and+Frequency+Control%22%5BJournal%5D)">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).</li>
<li>Yoo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+encapsulation+on+in+vitro+and+in+vivo+performance+of+volatile+nanoscale+phase-shift+perfluorocarbon+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+ultrasound+characterization+of+volatile+sub-micron+phase-shift+droplets+in+the+20-40+MHz+frequency+range%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+bubbles%3A+creating+phase-shift+droplets+from+commercially+available+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+with+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+using+acoustically-activated+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets.</a> Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).</li>
<li>Wu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-enhanced+siRNA+delivery+using+magnetic+nanoparticle-loaded+chitosan-deoxycholic+acid+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246(2017).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+release+from+phase-changeable+nanodroplets+triggered+by+low-intensity+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound.</a> Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).</li>
<li>Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregate+enhanced+trimodal+porphyrin+shell+microbubbles+for+ultrasound%2C+photoacoustic%2C+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).</li>
<li>Dhaliwal, A., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+accessibility+of+EPR-insensitive+tumor+phenotypes+using+EPR-adaptive+strategies%3A+Designing+a+new+perspective+in+nanomedicine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery.</a> Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).</li>
<li>Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+size+distribution+measurements+of+Definity+and+manipulated+Definity+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376(2007).</li>
<li>Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold-dependent+nonlinear+scattering+from+porphyrin+nanobubbles+for+vascular+and+extravascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001(2018).</li>
<li>Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+collapse+and+microbubble+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer collapse and microbubble stability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).</li>
<li>Overchuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtherapeutic+Photodynamic+Treatment+Facilitates+Tumor+Nanomedicine+Delivery+and+Overcomes+Desmoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia.</a> Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).</li>
<li>Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li>
<li>Paproski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+nanodroplets%3A+Sub-micrometer+ultrasound+and+photoacoustic+contrast+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents.</a> Small. 12 (3), 371-380 (2016).</li>
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<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A imagem de ultrassom é uma forma não invasiva, não ionizante de imagens médicas que utiliza ondas acústicas. Embora os scanners de ultrassom sejam mais portáteis e possam fornecer imagens em tempo real, a imagem de ultrassom pode sofrer de baixo contraste, tornando difícil para os sonografistas distinguir de forma confiável características patológicas ecogênicas. Para neutralizar essa limitação, microbolhas podem ser injetadas no hospedeiro para melhorar o contraste vascular. Microbolhas são agentes de contraste do tamanho de micron que são altamente ecogênicos às ondas acústicas e podem fornecer contraste aprimorado do vaso1,2. As conchas e núcleos de gás de microbolhas podem ser adaptados para diferentes aplicações, como imagem, trombiolise, permeabilização da membrana celular ou abertura vascular transitória2.
Uma desvantagem dos microbolhas é sua meia-vida de curta circulação. Por exemplo, microesferas lipídicas perflutrenas clinicamente disponíveis têm apenas uma meia-vida de 1,3 minutos3. Para longas sessões de imagem, são necessárias múltiplas injeções de microbolhas. Outra desvantagem dos microbolhas são seus grandes diâmetros. Enquanto as microesferas lipídicas perflutren têm cerca de 1 a 3 μm de diâmetro, pequenas o suficiente para circular em vasculatura, elas são muito grandes para extravasar e se acumulam passivamente em tecidos de interesse, como tumores4. Uma estratégia para superar essas limitações é condensar as microbolhas do núcleo de gás em gotículas menores e líquidas5,6. Embora as gotículas não sejam ecogênicas em seu estado líquido, elas podem ser vaporizadas em microbolhas após a exposição ao ultrassom com pressão negativa de pico suficientemente alta, recuperando sua capacidade de fornecer contraste. Isso permite que a gotícula aproveite a farmacocinética mais favorável de um pequeno núcleo líquido, mantendo a capacidade de proporcionar contraste quando inssonado e sem alterar a composição química4,7.
O decafluorobutano é um composto perfluorocarbono ideal para a mudança de fase entre estados gasosos e líquidos5,6,7. O decafluorobutano permite a condensação de microbolhas em gotículas apenas com redução de temperatura, enquanto perfluorocarbonos menos densos requerem pressurização adicional5. Este método suave minimiza a destruição de bolhas durante a condensação7,8,9. Como seus núcleos são líquidos, gotículas não são ecogênicas e invisíveis ao ultrassom. No entanto, com a aplicação de energia acústica ou térmica suficiente, os núcleos líquidos podem vaporizar de volta em um estado gasoso, gerando microbolhas ecogênicas8. Essa vaporização permite o controle de quando e onde gerar microbolhas.
Embora as gotículas sejam úteis para acumulação passiva, vaporização in situ ou melhoria da permeabilidade celular4,gotículas (e seus fragmentos) não podem ser imagens ou ex vivoquantificadas . Portanto, o agente de diagnóstico companheiro quantificável, como fluorescente4,10,11, partículas magnéticas12, agentes opticamente absorventes13, são utilizados como um análogo para medir a entrega de gotículas a tecidos de interesse. Por exemplo, Helfield et al. usaram uma co-injeção de nano-contas fluorescentes para quantificação de imagem histologia de órgãos do rato, pois gotículas não podiam ser detectadas fluorescentemente4. A desvantagem dos agentes diagnósticos companheiros é que o componente rastreável pode agir independentemente da gotícula, dependendo do seu perfil farmacocinético individual.
Felizmente, a casca de microbolhas e gotículas pode ser personalizada. Por exemplo, Huynh et al. demonstraram agentes de contraste de ultrassom com conchas porphyrin-lipídicas, criando microbolhas multimodais14. Porfirinas são uma classe de compostos orgânicos com uma estrutura macrocílica aromática14,15. Eles são opticamente absorventes, fluorescentes, e podem ser quelados a uma grande variedade de metais para radioterapia, imagens baseadas em radionuclídeos ou quantificação baseada em metal de rastreamento14. Um exemplo de porfirina é o piropheophorbida (Pyro). Ao conjugar Pyro em lipídios, incorporar piro-lipídios em microbolhas ou gotículas permitem que sejam imagens e rastreadas através de múltiplas modalidades: acústica, fluorescente e através da absorvância14. Este agente de contraste multimodal poderia ser usado para rastrear e quantificar o acúmulo. Isso poderia eliminar a necessidade de agentes de diagnóstico companheiros, uma vez que o componente quantificável é agora conjugado na concha, permitindo uma quantificação de entrega mais precisa16.
Aqui, um protocolo para a criação de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase é delineado. Como os agentes de contrastes de ultrassom podem ser usados como plataforma para o fornecimento de medicamentos a tecidos de interesse, como tumores2,4, estender sua detectabilidade além do ultrassom pode ser útil para quantificação da eficácia do parto. O objetivo dessas gotículas é fornecer agentes de contraste de ultrassom rastreáveis capazes de acumulação passiva in vivo, in situ vaporização e acústica, e com o potencial de quantificar a bio distribuição ou acúmulo de órgãos ex vivo sem a dependência de sensores secundários. Métodos de caracterização também são delineados para mostrar o potencial das gotículas de porfirina como sensores de bio-distribuição. Os efeitos do carregamento piro-lipídide na casca (0% a 50% pela razão molar) também são discutidos.

<table><tbody><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-5000] (sal de amônio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880220</td><td>Também conhecido como "DSPE-PEG5K"</td></tr><tr><td>1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>855775</td><td>Também conhecido como "DSPC"</td></tr> <tr><td>Folha de alumínio</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selos de alumínio, Tear-Off</td><td>VWR</td><td>16171-840</td><td>Alumínio padrão, 13 mm de diâmetro externo</td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Capaz de&nbsp; sonicar e aquecer até 70 &deg; C,</td></tr> <tr><td>Frascos com tampa de rosca Bio-Stor</td><td>National Scientific</td><td>BS20NABP</td><td>Plástico, 2 mL com rodapé, com anel O</td></tr><tr><td>Frascos de soro transparente de vidro borossilicato</td><td>VWR</td><td>16171-285</td><td>3 mL, 7 mm de diâmetro interno da boca, 13 mm de diâmetro externo da boca</td></tr><tr><td>Frasco de amostra de vidro borossilicato com tampa de rosca fenólica</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>1,85 mL, estilo de forma curta, 12 mm de diâmetro externo, 35 mm de altura, tamanho</td></tr> <tr><td>da tampa 8-425Frasco de Vidro Borosilicato com Tampa de Rosca</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Os tamanhos dependerão dos volumes desejados</td></tr><tr><td>Clorofórmio&nbsp;</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de relha Diluente de Elctrolyte</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Compatível com Contador de relha</td></tr><tr><td>Decafluorobutano (C4F10)</td><td>FluoroMed</td><td>355-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Água Deionizada</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelo seco (Dióxido de carbono)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analisador de partículas de dispersão de luz dinâmica (DLS)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Capaz de controle de temperatura</td></tr><tr><td>E-Z Crimper, 13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225302</td><td>13 mm Vedações de alumínio padrão</td></tr><tr><td>E-Z Decapper, 13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225352</td><td>13 mm Vedações de alumínio padrão</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro fluorescente</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Capaz de 400 a 600 excitação e 300 a 800 nm de detecção de emissão, detector perpendicular à fonte de laser</td></tr><tr><td>Cubeta Compatível com Espectrofotômetro Fluorescente</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Pode conter pelo menos 2 mL, capaz de 300 a 800 nm, todos os quatro lados são janelas ópticas.</td></tr><tr><td>Trocador de gás</td><td>feito internamente</td><td></td><td>Consulte Informações Suplementares - "Outros Protocolos e Dados" para obter instruções de montagem.</td></tr><tr><td>Seringas de vidro</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Os tamanhos dependerão dos volumes desejados</td></tr><tr><td>GLWR Custom Aperture Tube 10 um</td><td>Beckman Coulter</td><td>B42812</td><td>10 &micro; m de abertura, compatível com Beckman Coulter MultiSizer 4e</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes isolados de Styrofaom com tampas</td><td>Qualquer marca</td> Isopropanol Qualquer marca <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rolhas de borracha estilo liofilização</td><td>VWR</td><td>71000-060</td><td>7 mm de diâmetro interno da boca, 13 mm de diâmetro externo da boca, 2 pernas, membrana de clorobutilo</td></tr><tr><td> Bomba de vácuo Diaphram</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16694-1-60-06</td><td>Pinças de metal de pressão ajustável</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 21 MHz Transdutor de ultrassom de matriz linear</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>21 MHz, capaz de modo B e imagens não lineares.</td></tr><tr><td>MultiSizer 4e</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Capaz de dimensionar de 0,2&micro; m a 6 &micro; m</td></tr><tr><td>Unidades de Filtro a Vácuo Estéril de Uso Único de Fluxo Rápido Nalgene</td><td>Thermo Scientific</td><td>567-0010</td><td>Membrana de Polietersulfona (PES), 0.1&mu; m tamanho do poro, volume de 1000 mL. Como o Isoton II é não estéril, pode usar unidades de filtro várias vezes</td></tr><tr><td>Agulhas, BD convencional</td><td></td><td>305176</td><td>calibre 20, comprimento de 1,5 polegada</td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Certifique-se de que existem válvulas reguladoras e tubos para direcionar o fluxo. A configuração dependerá da marca e da fonte.</td></tr><tr><td>Parafilme</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Chamado de "filme de cera" no protocolo.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>1X, 7.4 pH</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Os tamanhos dependerão dos volumes desejados</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Os tamanhos dependerão dos volumes desejados</td></tr><tr><td>Seringas de plástico</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>1 mL, 3 mL e 30 mL. Com conexões Luer Lock</td></tr><tr><td>Filtro de Membrana de Polietersulfona (PES)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>0.2 &micro; m tamanho dos poros</td></tr><tr><td>Propilenoglicol</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirofeoforbida conjugada 1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td>Também conhecido como "Pyro-SPC". Consulte "Informações Suplementares - Outros Protocolos e Dados" para síntese.</td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Qualquer marca</td><td></td> <td>(-20 a 100 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Também conhecida como "2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol"</td></tr><tr><td>Água Ultrapura</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Tipo 1 Pureza</td></tr><tr><td>Ultravioleta&ndash; Espectrofotômetro Visível (UV-Vis)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Capaz de absorver de 300 a 800 nm, pelo menos 0,5 nm de resolução</td></tr><tr><td>Ultravioleta&ndash; Cubeta Compatível com Espectrofotômetro Visível (UV-Vis), 1 cm de Comprimento do Caminho</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Pode conter pelo menos 2 mL, capaz de 300 a 800 nm</td></tr><tr><td>Dessecador a Vácuo</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de Imagem de Ultrassom Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>Sistema de imagem de ultrassom pré-clínico</td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Bristol-Myers-Squibb</td><td></td><td>Chamado de "agitador mecânico" no protocolo. Agita por 45 s.</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntese e caracterização de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase

Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

As gotículas de mudança de fase são uma classe de agentes de contraste de ultrassom que podem se converter em microbolhas ecogênicas in situ com a aplicação de energia acústica suficiente. As gotículas são menores e mais estáveis do que suas contrapartes de microbolhas. No entanto, os agentes tradicionais de contraste de ultrassom não são rastreáveis além das medidas de feedback acústico, o que dificulta a quantificação da bio-distribuição ou acúmulo de agentes de contraste. Os pesquisadores podem ter que contar com partículas de diagnóstico companheiro fluorescente ou opticamente absorventes para inferir a bio-distribuição. O objetivo deste protocolo é detalhar etapas para a criação de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase usando um método de condensação. Porfirinas são moléculas fluorescentes com faixas de absorção distintas que podem ser conjugadas em lipídios e incorporadas em gotículas para ampliar a versatilidade de gotículas, permitindo uma bio-distribuição mais robusta, mantendo propriedades acústicas. Sete formulações com diferentes conteúdos de porfirina-lipídica e lipídio base foram feitas para investigar distribuições de microbolhas e tamanho de gotícula. Caracterizações adequadas às estruturas contendo porphyrin também são descritas no protocolo para demonstrar sua versatilidade analítica em solução. O dimensionamento mostrou que os diâmetros médios pós-condensados foram 1,72 a 2,38 vezes menores do que as populações precursoras. A caracterização da absorvência mostrou que os conjuntos intactos tinham um pico de banda Q de 700 nm, enquanto as amostras interrompidas tinham um pico de absorção de 671 nm. A caracterização da fluorescência mostrou que os conjuntos de porfirina-lipídico foram extintos fluorescentemente (>97%), com recuperação de fluorescência alcançada após a interrupção. A vaporização acústica mostrou que as gotículas de porfirina não eram ecogênicas a pressões mais baixas e podiam ser convertidas em microbolhas ecogênicas com pressões suficientes. Essas caracterizações mostram o potencial de gotículas porfiliais para eliminar a necessidade de absorção ou estratégias de diagnóstico companheiro baseadas em fluorescência para quantificar a bio-distribuição de agentes de contraste de ultrassom para aplicações de entrega ou terapêutica in vivo ou ex vivo.

Amostras de microbolhas pré-condensadas e selecionadas em tamanho(n = 3) e amostras de gotículas pós-condensadas(n = 3) foram dimensionadas em um Contador coulter (CC) com abertura de 10 μm. Uma limitação da abertura de 10 μm é que não pode medir partículas menores que 200 nm, o que pode influenciar o tamanho médio e a concentração. A Figura 4 mostra os dados de dimensionamento para cada uma das formulações de conteúdo piro-lipída. A Tabela 1 apresenta estatísticas com base nos dados de dimensionamento. Utilizando uma razão de diâmetros médios pré e pós-condensados, os resultados mostraram que a formulação piro-lipídica de 0% teve a menor mudança média de diâmetro em 1,72 ± 0,02. A formulação piro-lipídica de 50% apresentou o maior diâmetro médio em 2,38 ± 0,08. A amostra de gotícula piro-lipídica de 1% apresentou a maior concentração observada em (2,71 ± 0,13) × 1010 /mL, enquanto a amostra de gotícula piro-lipídica de 40% apresentou a menor concentração observada em (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Os dados de dimensionamento mostraram que a amostra de gotícula piro-lipídica de 10% tinha o menor diômetro de pico em 261 ± 13 nm, enquanto a amostra de gotícula piro-lipídica de 50% tinha a maior em 390 ± 55 nm. Geralmente, à medida que o teor piro-lipídide aumentava, a concentração diminuiu e o diâmetro médio aumentou. Como as amostras pós-condensadas são baseadas na amostra precursora de microbolhas, a tendência ocorreu para ambos os tipos de agentes de contraste de ultrassom. À medida que o teor piro-lipídide aumentava, uma subpopulação de microbolhas (com um tamanho de pico de aproximadamente 2000 μm) começou a se formar. Este pico secundário não estava presente na amostra de microbolhas piro-lipídicas de 0% e mais aparente nas populações de 40% e 50% de piro-lipídios.
A Figura 5 mostra medidas representativas de absorvência da amostra de gotícula piro-lipídica de 30%. O pico da amostra intacta na PBS foi de 700 nm, enquanto a amostra interrompida em Triton mudou o pico para 671 nm. Isso mostrou que as montagens intactas têm propriedades ópticas diferentes em comparação com os componentes lipídudos individuais e desmontados.
A Figura 6A mostra medidas representativas de fluorescência da amostra de microbolhas pré-condensadas, enquanto a Figura 6B mostra amostra de gotícula pós-condensada com 30% de piro-lipídio. A amostra intacta na PBS teve um pico de fluorescência de 704 nm, enquanto a forma interrompida teve um pico de 674 nm. Subtrair a área rompida sob a curva com a área intacta sob a curva, e dividir a diferença pela área interrompida sob a curva dá a eficiência de saciamento, que resulta em 98,61% e 98,07% para a amostra de microbolça piro-lipídica de 30%, respectivamente.
Para demonstrar gotículas convertendo-se em microbolhas, gotículas diluídas foram imagens e vaporizadas em um fantasma de fluxo de 37 °C com um sistema de ultrassom. A Figura 7 mostra imagens representativas de ultrassom da amostra de gotícula piro-lipídica de 30% imagemdas em diferentes pressões. Em baixas pressões(Figura 7A), havia muito pouco sinal, apenas sinal de fundo de bolhas de ar presos a partir da síntese de ágar. Isso ocorre porque as gotículas não são ecogênicas e não espalham ultrassom. Em uma potência ligeiramente alta, foram gerados alguns microbolhas (Figura 7B), como mostrado pelo aparecimento de manchas brilhantes. À medida que a pressão aumentava, mais microbolhas foram geradas(Figura 7C e 7D). Isso também demonstrou que as gotículas não vaporizarão espontaneamente a 37 °C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> Figura 1: Imagens dos passos para formar a solução 30% piro-lipídica. A) Pó lipídico mais Pyro-SPC em clorofórmio. B) Solução de dissolução adicionada. C) Filme lipídido seco e revestido na parede interna do frasco. D) Frasco lipídeco embrulhado em papel alumínio (papel alumínio exterior colado para reutilização). E) Solução lipídica hidratada. F) Solução lipídica em frasco de soro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> Figura 2: O trocador de gás de 10 coletores. As válvulas referenciadas no protocolo são rotuladas. Consulte arquivo suplementar "Outros Protocolos e Dados" para obter instruções sobre como montar o Trocador de Gás. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> Figura 3: A) As soluções lipídicas das 7 formulações (0% a 50% Pyro-SPC) em frascos de amostra. As figuras B a D mostram imagens das medidas tomadas para fazer gotículas piro-lipídicas de 30%. B) solução piro-lipídica de 30% em frasco de amostra. C) Pós-agitação. D) tamanho 15 min selecionado. E) Partição inferior transferida para frasco de decafluorobutano. D) Pós-condensação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> Figura 4: Coulter Counter (CC) dimensionamento de dados das amostras de microbolhas e gotículas selecionadas com diferentes teor de casca piro-lipídica(n = 3). As linhas verdes sólidas representam microbolhas e as linhas de ciano pontilhadas representam gotículas. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) As concentrações totais observadas de amostras de microbolhas e gotículas do CC com base no conteúdo Pyro-SPC no shell. Todas as barras de erro indicam desvio padrão. Todas as medições foram realizadas utilizando-se uma abertura de 10 μm que tem uma faixa de tamanho de 200 nm a 6000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> Figura 5: Medições de absorvância de espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis) representativas de 300 a 800 nm da amostra de gotícula piro-lipídica pós-condensada diluída em PBS e em 1% Triton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> Figura 6: Emissão representativa de fluorescência de 600 a 750 nm animado a 410 nm. A) Amostra de microbolhas piro-lipídica selecionada em 30% em PBS e em 1% triton. B) Amostra de gotícula piro-lipídica pós-condensada de 30% na PBS e em 1% tritão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> Figura 7: Imagens representativas de ultrassom de um fantasma de fluxo de ágar de 37 °C tiradas com um transdutor de matriz linear pré-clínico de 21 MHz no modo B (ver Tabela de Materiais). A coluna esquerda (Figuras A, C, E,&amp; G) mostra os controles pbs. A coluna direita (Figuras B, D, F,&amp; H) mostra 20 μL de amostra de gotícula piro-lipídica pós-condensada diluída em 50 mL de 37 °C PBS. Cada linha representa pressões negativas de pico de campo livre, que foram estimadas a partir do trabalho feito por Sheeran et al.8 Os triângulos amarelos indicam profundidade de foco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Método</td>
			<td>Agente</td>
			<td>Pyro Shell %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolhas</td>
			<td>Conc. [/mL]</td>
			<td>(2,76 ± 0,28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1.91 ± 0.22) × 10^10</td>
			<td>(1,47 ± 0,05) × 10^10</td>
			<td>(8.47 ± 0,95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0,15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolhas</td>
			<td>Pico [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolhas</td>
			<td>Média [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolhas</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotículas</td>
			<td>Conc. [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0,07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1,75 ± 0,18) × 10^10</td>
			<td>(1,72 ± 0,13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0,01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0,81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotículas</td>
			<td>Pico [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotículas</td>
			<td>Média [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gotículas</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Dimensionamento das estatísticas de dados das amostras de microbolhas e gotículas com diferentes conteúdos Pyro-SPC do Coulter Counter (CC) (n = 3). Todos os erros indicam desvio padrão.
Informações Complementares - Folha de Fórmula Lipídica: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Informações Complementares - Outros Protocolos e Dados: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

Neste protocolo, são traçados métodos para sintetizar e caracterizar gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase.

Síntese e Caracterização de Gotículas de Porfirina multimodal de mudança de fase

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Este protocolo é significativo porque fornece o procedimento completo para a criação de gotículas do filme lipídeca para solução lipídica para microbolhas e, em seguida, para gotículas. A principal vantagem dessa técnica é a simplicidade para condensar microbolhas em gotículas. Apenas resfriando e girando, gotículas podem ser feitas sem a necessidade de pressurização.Uma demonstração visual é fundamental porque um simples teste para ver se os microbolhas foram condensados com sucesso é verificando visualmente a mudança na translucência. Demonstrando o procedimento estará Kimoon Yoo, um estudante de mestrado no laboratório Gang Zheng. Usando um decapper, remova o selo de alumínio no frasco de soro e transfira um mililitro da solução lipídica para um frasco de amostra de vidro borossilicato de 1,85 mililitro com uma tampa de parafuso fenol, deixando a solução lipídica fluir pela parede interna sem criar bolhas.Com o frasco de amostra de 1,85 mililitro prepare-se para fluir em gás decafluorobutano no espaço de cabeça do frasco de amostra usando o trocador de gás. Certifique-se de que todas as válvulas do trocador de gás estejam devidamente fechadas e que a bomba esteja desligada. Abra a válvula de coletor e desemplha cuidadosamente a agulha correspondente do coletor.Abra a válvula de pressão A e a válvula de pressão B e gire a válvula do cilindro de gás aproximadamente 1/16 a 1/8 no sentido anti-horário para abri-la parcialmente. Abra a válvula de alça T e desnaça o frasco de amostra com a solução lipídica. Coloque a agulha do coletor acima da interface de ar líquido do frasco, gire lentamente a válvula reguladora de ar no sentido horário até que a agulha do medidor de regulagem de ar se mova ligeiramente de sua posição de descanso e deixe o gás perfluorocarbono fluir suavemente para o espaço de cabeça do frasco por 30 segundos, tomando o cuidado de não criar bolhas.Ajuste a válvula reguladora de ar, se necessário. Após 30 segundos, cuidadosamente e rapidamente manteve o frasco de amostra sem mover muito o frasco. Tanto a válvula do cilindro de gás, a válvula t, a válvula reguladora de ar, a válvula de pressão A, a válvula de pressão B e a válvula de coletor.Embaa por pouco a agulha, em seguida, rotulou o frasco de amostra e selar o pescoço com filme de cera indo no sentido horário. Armazene o frasco de amostra no escuro e a quatro graus Celsius por pelo menos 10 minutos ou até 24 horas. Coloque cerca de 100 gramas de gelo seco em um recipiente isolado no lugar de gelo regular em outro recipiente isolado.Recupere um frasco de soro de decafluorobutano previamente preparado para agulhas de calibre 1,5 polegadas de 20, uma seringa de plástico de um mililitro, um recipiente de 200 mililitros, pinças metálicas e um termômetro. Coloque o frasco de amostra com a solução lipídica no agitador mecânico e agitar por 45 segundos. Deve haver uma mudança de cor e translucência.Após a agitação mecânica, mantenha o frasco de amostra do lado direito para cima protegido da luz e inicie uma contagem regressiva de 15 minutos para esfriar o frasco e o tamanho selecione os microcompletos. Quando a contagem regressiva chegar a 10 minutos, encha um recipiente com cerca de 200 mililitros de isopropanol e esfrie-o a menos 20 graus Celsius com gelo seco usando pinças metálicas. Depois que os microcompletos tiverem sido selecionados por 15 minutos, procure o tamanho da partição selecionada dentro do frasco de amostra.Mantendo o frasco de amostra para cima, cuidadosamente descapou o frasco de amostra e retire cerca de 0,7 mililitros da partição inferior com uma agulha de calibre 1,5 polegadas de 20 polegadas presa a uma seringa de plástico de um mililitro. Certifique-se de que nenhuma parte superior seja retirada e não aperte a seringa para remover os bolsões de ar. Visando o círculo central na rolha de borracha, insira uma agulha diferente de 20 bitolas em um frasco de soro de decafluorobutano, mantendo a agulha perto do topo do frasco de soro para ventilar e, em seguida, inserir a agulha com o tamanho das microbolhas selecionadas.Transfira lentamente o tamanho dos microbolhas selecionados. Deixe o líquido deslizar suavemente pela parede interna do frasco de soro de decafluorobutano. Uma vez que toda a solução de microbolhas selecionada tenha sido transferida, remova a agulha com a seringa, mas mantenha a agulha de ventilação para aliviar a pressão negativa.Adicione pequenas quantidades de gelo seco ou isopropanol de temperatura ambiente ao banho de isopropanol para garantir que a temperatura do banho esteja entre menos 15 a menos 17 graus Celsius. Com a agulha de ventilação de 20 medidores inserida perto da parte superior do frasco de soro, coloque o frasco de soro e o banho de isopropanol, mantendo o nível de microbolhas abaixo do nível do isopropanol, mas o pescoço de frasco acima dele e intermitentemente girou o frasco de soro por dois minutos para condensar as microbolhas. Não gire o frasco de soro continuamente no isopropanol e não deixe a solução congelar.Gire por cerca de cinco segundos e levante o frasco de soro para fora do isopropanol. Verifique se há nucleação de gelo e retome o giro em isopropanol. Se houver formação de gelo, gire o frasco de soro no ar até que se dissipe.Após a condensação de dois minutos, remova o frasco de soro do banho isopropanol e remova a agulha de ventilação. Os microcompletos devem ter condensado em gotículas, conforme indicado pela mudança na translucência. Limpe o frasco de soro, rotule-o e coloque-o em gelo normal em um recipiente isolado escuro até estar pronto para uso.Gotículas não abertas com uma vedação de alumínio intacta devem ser estáveis por até seis horas, desde que o gelo derretido seja substituído conforme necessário. Quando estiver pronto para usar, remova o selo de alumínio com o descafeinado. Depois de usar este protocolo, microbolhas pré-condensadas, tamanho selecionado e gotículas pós-condensadas foram dimensionadas em um contador Coulter com uma abertura de 10 mícrons.Os dados de dimensionamento para a formulação de 30% piro-lipídas são mostrados. As estatísticas baseadas nos dados de dimensionamento são mostradas aqui. Utilizando uma proporção de diâmetros médios pré e pós-condensados, os resultados mostraram que, à medida que o teor piro-lipídial aumentava, a concentração diminuía e o diâmetro médio aumentava.As medidas de absorventes representativas da amostra de gotículas piro-lipídicas de 30%. Isso mostrou que os conjuntos intactos têm diferentes propriedades ópticas refletidas por diferentes picos em comparação com os componentes lipídudos individuais desmontados. As medições representativas de floresnce da microbolhas pré-condensadas, amostra de gotícula pós-condensada com 30% piro-lipídio são mostradas aqui, demonstrando diferentes picos de fluorescência para amostras intactas na forma interrompida.Imagens representativas de ultrassom das gotículas 30% piro-lipídicas são mostradas em diferentes pressões. Em baixas pressões, apenas o sinal de fundo das bolhas de ar presas da síntese de ágar foi observado. Com um poder ligeiramente maior, foram gerados alguns microbolhas, o que é demonstrado pelo aparecimento de manchas brilhantes.Mais microbolhas foram geradas à medida que a pressão aumentava. É importante lembrar que a temperatura de condensação aqui é otimizada para esta formulação específica de concha de gotícula. Diferentes formulações de conchas podem exigir uma temperatura diferente.

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