Name: Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a avaliar a toxicidade de radiação UV e produtos químicos em células epiteliais da córnea humana primárias e imortalizadas. Este método in vitro reduz testes em animais na avaliação de segurança de produtos oftálmicos.

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Os autores não receberam financiamento para este trabalho.

1. Cultura de pHCECs e iHCECs
<ol><li>Cultivar os pHCECs e iHCECs em meio epitelial ocular humano (HOEM) com os seguintes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de meio celular O (Tabela de Materiais), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% de suplemento de mídia celular P (Tabela de Materiais), 5 μg/mL de insulina rh, 5 μg/mL de apo-transferrina e 100 ng/mL de hidrocortisona hemisuccinato em frascos de cultura revestidos com colágeno-1 (18 mL em um frasco de cultura de 75 cm2 ).</li>
	<li>Troque o meio nos frascos a cada 2-3 dias, removendo o meio depois que as células crescerem até ~80% de confluência. Adicionar solução de dissociação sem vermelho de fenol e incubar o balão a 37 °C até que as células estejam completamente separadas. Neutralizar a solução de dissociação com DMEM/F12 com soro e, em seguida, centrifugar as células a 500 × g. Remova o meio sobrenadante e ressuspenda as células em meio HOEM.</li>
</ol>2. Determinação do tamanho celular por microscopia confocal
<ol><li>Semeando tanto pHCECs quanto iHCECs em placas de Petri revestidas de colágeno com lamínulas de fundo de vidro na concentração de 1 × 105 com 1 mL de HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs, um conjunto de culturas por 24 horas e outro conjunto de culturas por 48 h, em estufa a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após o período de incubação, corar as células com 500 μL de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína (4 μM), homodímero de etídio-1 (8 μM) e anexina V (5 μL em 500 μL de tampão Alexa Fluor 647 conjugado) por 20 min a 37 °C. Após a coloração das células, ajustar o microscópio para capturar os comprimentos de onda de excitação/emissão de 488/515 nm para calceína-AM, 543/600 nm para homodímero de etídio-1 e 633/665 nm para anexina V usando um microscópio confocal de varredura a laser.</li>
	<li>Obtenha as imagens e pegue pilhas Z para avaliar o tamanho da célula em três dimensões.<ol><li>Para adquirir as imagens bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D), encontre a área a ser fotografada com uma objetiva de água apócromática 40x/1.2. Com os lasers Argônio (488) (primeira varredura), HeNe1 (543) (segunda varredura e HeNe2 (633) (terceira varredura), digitalize em três canais separados usando os divisores de feixe, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis, e NFT 545 LP560, LP505.</li>
		<li>Use a varredura sequencial de várias faixas para reduzir o crosstalk. NOTA: LP505 é usado para o canal 2 com o laser 488 para capturar a emissão do corante de calceína. A LP560 é utilizada no canal 3 com o laser 543 para captar a emissão do homodímero de etídio 1. NFT 635 é usado com o laser 633 para capturar a emissão da anexina V. O objetivo do HFT é separar a excitação e a emissão de luz. O NFT divide a luz refletindo a luz < comprimento de onda especificado para um canal separado, deixando a luz > um comprimento de onda especificado até um segundo canal. Os filtros LP bloqueiam comprimentos de onda mais curtos do que o comprimento de onda especificado e deixam passar os comprimentos de onda mais longos.</li>
		<li>Para criar imagens em 3D, defina o confocal como Z-stack e digitalize pelo menos 20 quadros.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Exposição das células à radiação UV
<ol><li>Semeando as células a 5 × 104/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Após o período de incubação, reduzir o volume do meio nos poços para 300 μL. Em seguida, exponha as células à radiação UV (UVA a 6,48 W/m 2 e UVB a 1,82 W/m2, pois os tubos UVA e UVB são ligados na incubadora ao mesmo tempo) em uma incubadora de 37 °C por 5 e 20 minutos em experimentos separados.</li>
	<li>Após a radiação UV, adicionar 200 μL de HOEM fresco a cada poço e incubar durante 20 h a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, coletar o sobrenadante celular em cada poço e transferi-lo para tubos estéreis de polipropileno de 2 mL. Congelar a -80 °C. Para determinar os níveis de citocinas liberados pelos pHCECs e iHCECs após exposição aos raios UV, use um ensaio de citocinas multiplex e siga as instruções do kit para quantificar as quatro citocinas a seguir: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.</li>
	<li>Adicionar reagente de ensaio metabólico às células dos poços.</li>
	<li>Preparar reagente de ensaio metabólico a 10% em DMEM/F12. Substitua o meio de cultura em cada poço por 1 mL da solução de ensaio metabólico a 10% e incube a 37 °C com CO2 a 5% por 4 h.</li>
	<li>Medir a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes em comprimentos de onda de excitação/emissão de 530/590 nm.</li>
</ol>4. Exposição das células a toxinas químicas
<ol><li>Células de sementes a 5 × 104/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubam a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Após o período de incubação, retirar o meio e expor as células a 1 mL de toxinas químicas (BAK 0,001%, H 2O2 0,01% e SDS 0,0025% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) por 5 e 15 min.</li>
	<li>Após a exposição às toxinas químicas, remova as toxinas dos poços, enxágue com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de HOEM a cada poço. Após 20 h de incubação, realizar um ensaio metabólico substituindo o meio com 1 mL de uma solução de ensaio metabólico a 10% e incubando a 37 °C com CO2 a 5% por 4 h. Meça a fluorescência usando um leitor de placas multipoços de fluorescência em comprimentos de onda de excitação/emissão de 530/590 nm.</li>
	<li>Transferir os sobrenadantes celulares dos poços após a incubação de 20 h para tubos de polipropileno estéreis separados de 2 mL e congelar a -80 °C. Quantificar as citocinas liberadas pelos pHCECs e iHCECs após a exposição aos produtos químicos. Use a mesma plataforma multiplex usada para avaliar as citocinas das células tratadas com UV. Use um ensaio de citocinas multiplex seguindo as instruções do kit para quantificar as quatro citocinas a seguir: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.</li>
</ol>5. Exame de células expostas a várias concentrações de BAK
<ol><li>Células de sementes a 1 × 10 5/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubar a 37 °C com5% de CO2 por 24 h. Após o período de incubação, retirar o meio e expor as células a 1 mL de toxinas químicas (BAK 0,001%, BAK 0,005% e BAK 0,01% em PBS) por 5 min.</li>
	<li>Após a exposição, remova as toxinas químicas, lave os poços com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de HOEM a cada poço. Após 20 h de incubação, corar as células com 500 μL de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína (4 μM), homodímero de etídio-1 (8 μM) e anexina V (5 μL em 500 μL de tampão Alexa Fluor 647 conjugado) por 20 min a 37 °C. Ajustar o microscópio para medir intensidades de coloração de anexina V, calceína AM e etídio-1 nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 630/675 nm, 495/515 nm e 528/617 nm, respectivamente. Imagem das células usando o microscópio de fluorescência</li>
</ol>6. Análise dos dados
<ol><li>Realizar um teste de normalidade e um teste para variâncias iguais antes de realizar uma análise de variância (ANOVA), ANOVA de Welch ou teste de Kruskal-Wallis. Use o teste post-hoc apropriado para comparar cada grupo testado. Definir p < 0,05.</li>
</ol>

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</ol>

O autor, Lyndon W. Jones, ao longo dos últimos 3 anos, através do CORE, recebeu apoio à pesquisa ou honorários de palestras das seguintes empresas: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage e Visioneering. Lyndon Jones também é consultor e/ou atua em um conselho consultivo para Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. Os demais autores não têm nada a revelar.

Diferenças potenciais no uso de dois tipos de HCECs foram avaliadas. As células foram colocadas no mesmo meio (HOEM) em concentrações idênticas de células e, em seguida, expostas a curtos e longos períodos de radiação UV e três toxinas oculares. As doses de radiação UV e produtos químicos foram selecionadas com base em seus efeitos fisiológicos, que foram prejudiciais o suficiente para as células produzirem respostas intermediárias que pudessem ser comparadas. Os tempos de exposição de 5 e 20 min para a radiação UV e 5 e...

Estudos toxicológicos in vitro são realizados para prever os efeitos tóxicos de produtos químicos e outros agentes que podem causar danos às células. Na avaliação da toxicidade para a córnea, células epiteliais corneanas humanas (HCECs) têm sido utilizadas em modelos para avaliação desses efeitos 1,2,3,4. Esses modelos tipicamente avaliam efeitos fisiológicos, como alterações na atividade metabólica da célula, proliferação celular e outras funções celulares, como a produção e liberação de citocinas inflamatórias. Para esses estudos toxicológicos, células de várias fontes foram selecionadas para avaliar os efeitos nocivos de produtos químicos e radiação UV sobre HCECs 2,3. As linhas pHCEC estão disponíveis em empresas que fornecem essas células a partir de tecidos de doadores de adultos. As células primárias podem ser tratadas com dispase e raspadas suavemente da córnea para cultura5. As células são então testadas para vírus e contaminação e, em seguida, enviadas criopreservadas em 10% de dimetil sulfóxido.
A vantagem das linhagens celulares primárias é que as células são geneticamente idênticas às células do doador. Isso é ideal, pois um modelo in vitro deve mimetizar o tecido in vivo tanto quanto possível. A desvantagem das linhagens celulares primárias é que elas têm um número limitado de divisões ou passagens celulares6. O número limitado de células disponíveis restringe o número de experimentos que podem ser conduzidos com uma única cultura primária, aumentando o custo dos experimentos.
Linhagens celulares imortalizadas também têm sido utilizadas em modelos de toxicidade em cultura celular. No entanto, ao contrário da linhagem celular primária obtida do tecido in vivo, a linhagem celular imortalizada foi geneticamente alterada. As células imortalizadas são criadas pela incorporação dos genes de um vírus ao DNA das células primárias6,7,8. Células com incorporação gênica viral bem-sucedida são selecionadas para a linhagem celular imortalizada. A vantagem da imortalização é que ela permite uma proliferação rápida indefinida, fornecendo um número ilimitado de células para realizar vários experimentos usando a mesma linhagem celular. Isso permite a consistência entre os experimentos e reduz o custo.
Além de alterações nos genes que limitavam a proliferação celular, alterações na expressão de genes de funcionalidade crítica também poderiamocorrer9. Portanto, a desvantagem do uso de células imortalizadas é que elas podem não mais representar as células originais in vivo em termos de resposta a vários estímulos externos10. Comparações envolveram a observação dos efeitos tóxicos de substâncias químicas sobre queratócitos corneanos humanos primários e imortalizados11, bem como HCECs imortalizados e células primárias epiteliais da córnea de coelhos12. A comparação entre os efeitos das toxinas sobre queratócitos humanos primários e queratócitos imortalizados não mostrou diferençassignificativas11. Usando os métodos detalhados neste artigo, a eficácia destes ensaios para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas oculares sobre pHCECs e iHCECs será determinada.
Três toxinas oculares comumente utilizadas em ensaios in vitro foram selecionadas: BAK, H 2 O2e SDS. O BAK é um conservante catiônico comumente usado em soluções oftálmicas13,14, o H 2 O2 é comumente usado para desinfetar lentes de contato 15 e o SDS é um surfactante aniônico encontrado em detergentes e xampus 14. Assim como as toxinas oculares, a radiação UV também pode causar danos significativos aos HCECs3. Além disso, a superexposição aos raios UV pode causar uma condição ocular conhecida como fotoceratite, caracterizada por sintomas de lacrimejamento, sensibilidade à luz e sensação de arenosidade16.
Há um número ilimitado de culturas de células primárias que podem ser usadas e várias linhagens celulares imortalizadas que foram desenvolvidas. Portanto, uma investigação foi realizada para comparar HCECs primários com uma linhagem imortalizada de HCEC para determinar semelhanças e diferenças entre modelos que incorporam esses tipos de células.
Esta investigação utilizou microscopia para avaliar possíveis diferenças entre pHCECs e iHCECs na resposta fisiológica celular a UV e toxinas. Os efeitos da radiação UV e de produtos químicos sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas inflamatórias para as duas linhagens celulares também foram avaliados. A importância de determinar as diferenças entre as duas linhagens celulares é entender o uso ideal dessas linhagens celulares para avaliar: 1) o efeito da radiação UV nas células, 2) os efeitos das toxinas nas células e 3) as alterações resultantes no metabolismo, viabilidade celular e liberação de citocinas celulares para estudos futuros.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Frasco Ventilado</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>Esta é a marca BioCoat, placa de</td></tr><tr><td>96 poços</td> revestida <td>com colágeno costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão de coloração de anexina</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anexina V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Microscópio Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 com um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss 510 sistema</td><td>Carl Zeiss Inc., Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de 48 poços</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>Esta é a marca BioCoat, revestida com colágeno</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>Pode ler fluorescência de 280 - 700 nm (para ensaio 540/590)</td></tr> <tr><td>Hycone</td><td></td> <td>de soro bovino fetalSH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliais da córnea humana</td><td>da Universidade de Ottawa</td><td>N / A</td><td>SV40 imortalizou células epiteliais da córnea humana do Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canadá) e foram caracterizadas Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalentes funcionais da córnea humana construídos a partir de linhagens celulares. Ciência. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>Meio de Epitélio Ocular Humano (HOEM) com os seguintes suplementos:</td> <td>Millipore, Billerica, MA, EUA</td><td>SCMC001</td><td>meio de base Epigro suplementado com 6 mM de L-Glutamina, 0,002% de EpiFactor O (suplemento de meio celular O no artigo), 1,0 &mu; M Epinefrina, 0,4% EpiFactor P (suplemento de mídia celular P no artigo), 5 &mu; g/mL rh Insulina, 5 &mu; g / mL de apo-transferrina e 100 ng / mL de hemisuccinato de hidrocortisona em frascos de cultura revestidos com colágeno-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, EUA).</td></tr><tr><td>Homodímero de calciene e etídio morto-vivo</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrumento</td><td>Rockville, MD, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Ensaio V-Plex</td><td>Rockville, MD, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>concentração de 100x, portanto, adicione 1 mL a cada 99 mL de mídia</td></tr><tr><td>Células epiteliais primárias da córnea</td><td>Millipore, Billerica, MA, EUA</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas multipoços de fluorescência SpectraMax</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (solução de dissociação celular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da toxicidade da radiação uv e produtos químicos em células epiteliais primárias e imortalizadas da córnea humana

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Este artigo descreve os métodos de medição da toxicidade da radiação ultravioleta (UV) e toxinas oculares em culturas de células epiteliais primárias (pHCEC) e imortalizadas (iHCEC). As células foram expostas à radiação UV e a doses tóxicas de cloreto de benzalcônio (BAK), peróxido de hidrogênio (H 2O2) e dodecil sulfato de sódio (SDS). A atividade metabólica foi medida por meio de um ensaio metabólico. A liberação de citocinas inflamatórias foi medida usando um ensaio multiplex de interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e as células foram avaliadas quanto à viabilidade usando corantes fluorescentes.
Os efeitos prejudiciais dos UV sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas ocorreram em 5 min de exposição UV para iHCEC e 20 min para pHCEC. Quedas percentuais semelhantes na atividade metabólica do iHCEC e pHCEC ocorreram após a exposição a BAK, H 2 O2ou SDS, e as mudanças mais significativas na liberação de citocinas ocorreram para IL-6 e IL-8. A microscopia das células iHCEC e pHCEC expostas a BAK, coradas fluorescentemente, mostrou morte celular com 0,005% de exposição a BAK, embora o grau de coloração de etídio tenha sido maior nos iHCECs do que nos pHCECs. Utilizando múltiplos métodos de avaliação de efeitos tóxicos usando microscopia, avaliações da atividade metabólica e produção de citocinas, a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas pôde ser determinada tanto para linhagens celulares primárias quanto imortalizadas.

Tamanho da célula Os HCECs primários e imortalizados foram visualizados com três corantes fluorescentes, que refletem três diferentes estágios de viabilidade celular. As células vivas são verdes (calceína-AM), as células mortas são vermelhas (homodímero etídio-1) e as células apoptóticas são amarelas (anexina V - cor ajustada por computador para melhor visualização do sinal de fluorescência). As células vivas contêm esterases no citoplasma celular e convertem calceína-AM em calceína. As células mortas...

Este artigo descreve os procedimentos utilizados para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas em uma linhagem celular primária e imortalizada.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Este método pode ser utilizado para avaliar in vitro a toxicidade de novas formulações de produtos oftálmicos. Ao refinar as concentrações de produtos químicos e formulações de produtos usando células oculares in vitro, o uso de animais para avaliar a segurança de novos produtos pode ser minimizado. Os ensaios in vitro avaliam desfechos de toxicidade que não podem ser avaliados in vivo, como determinar o efeito de uma substância química na função mitocondrial, integridade da membrana celular e atividade enzimática.Avaliar a toxicidade celular in vitro é fundamental para a compreensão dos potenciais mecanismos de toxicidade. Isto é essencial para estabelecer uma dose máxima tolerável de produtos químicos terapêuticos no olho. Quem demonstrará o procedimento será Nijani Nagaarudkumaran, pesquisadora do Laboratório Jones.Comece assentando ambos os pHCECs e iHCECs em placas de Petri revestidas de colágeno com tampa inferior de vidro deslizando em uma concentração de 1 x 10 até o 5º com 1 mililitro de meio de epitélio ocular humano, ou HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs 1 conjunto de culturas por 24 horas e outro conjunto por 48 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, corar as células com 500 microlitros de solução tampão de coloração de anexina contendo 4 calceína micromolar, 8 homodímero de etídio micromolar 1 e anexina 5 por 20 minutos a 37 graus Celsius.Após a coloração das células, ajustar o microscópio confocal de varredura a laser para capturar os comprimentos de onda de excitação e emissão, conforme descrito no manuscrito do texto. Obter as imagens bidimensionais e tridimensionais seguindo as instruções do manuscrito. Semeando as células a 5 x 10 a 4 por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 3 horas.Após a incubação, reduza o volume do meio nos poços para 300 microlitros. Em seguida, exponha as células à radiação UVA a 6,48 watts por metro quadrado e à radiação UVB a 1,82 watts por metro quadrado a 37 graus Celsius por 5 e 20 minutos em experimentos separados. Após a radiação UV, adicione 200 microlitros de HOEM fresco a cada poço e incube por 20 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, colete o sobrenadante celular em cada poço e transfira-o para tubos estéreis de polipropileno de 2 mililitros. Congele o sobrenadante a menos 80 graus Celsius. Para determinar os níveis de citocinas liberados pelos pHCECs e iHCECs após exposição aos raios UV, use um ensaio de citocinas multiplex e siga as instruções do kit para quantificar interleucina 6, interleucina 8, interleucina-1 beta e TNF-alfa.Preparar reagente de ensaio metabólico a 10% em DMEM e F12. Substitua o meio de cultura em cada poço por 1 mililitro da solução de ensaio metabólico a 10% e incube a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% por 4 horas. Meça a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes a 530 nanômetros de excitação e 590 nanômetros de comprimento de onda de emissão.Células de sementes a 5 x 10 ao quarto por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 3 horas. Após a incubação, remova o meio e exponha as células a 1 mililitro de toxinas químicas, que incluem cloreto de benzalcônio a 0,001%, ou BAK, peróxido de hidrogênio a 0,01% e dodecil sulfato de sódio a 0,0025% em PBS por 5 e 15 minutos.Após a exposição às toxinas químicas, remova as toxinas dos poços, enxágue com 1 mililitro de PBS e adicione 1 mililitro de HOEM a cada poço. Após 20 horas de incubação, realizar um ensaio metabólico substituindo o meio por 1 mililitro de uma solução de ensaio metabólico a 10% e incubando a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% por 4 horas. Meça a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes a 530 nanômetros de excitação e 590 nanômetros de comprimento de onda de emissão.Transfira os sobrenadantes celulares dos poços após a incubação de 20 horas em tubos de polipropileno estéreis separados de 2 mililitros e congele-os a 80 graus Celsius negativos. Use a mesma plataforma multiplex usada para avaliar as citocinas das células tratadas com UV seguindo as instruções do kit para quantificar interleucina 6, interleucina 8, interleucina-1 beta e TNF-alfa. Células de sementes a 1 x 10 a 5ª por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços e incubam a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Após a incubação, remova o meio e exponha as células a 1 mililitro de toxinas químicas, incluindo 0,001%BAK, 0,005%BAK e 0,01%BAK em PBS por 5 minutos. Após a exposição, remova as toxinas químicas, lave os poços com 1 mililitro de PBS e adicione 1 mililitro de HOEM a cada poço. Após 20 horas de incubação, corar as células com 500 microlitros de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína, homodímero de etídio e anexina 5 por 20 minutos a 37 graus Celsius.Ajustar o microscópio para medir intensidades nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 630 e 675 nanômetros para anexina 5, 495 e 515 nanômetros para calceína AM e 528 e 617 nanômetros para coloração de etídio 1. Em seguida, adquirir imagens das células usando o microscópio de fluorescência. Os iHCECs foram encontrados para ser pequenas células que variam de 10 a 20 micrômetros e os pHCECs estavam na faixa de 20 a 50 micrômetros após 24 horas de crescimento.Diferenças semelhantes na faixa de tamanho foram observadas para iHCECs e pHCECs após 48 horas de crescimento. Em comparação com as células não expostas aos raios UV, a atividade metabólica dos pHCECs irradiados foi significativamente reduzida aos 20 minutos de exposição. Para iHCECs, a atividade metabólica diminuiu para as células irradiadas em 5 e 20 minutos.Portanto, levou um tempo de exposição maior para reduzir a atividade metabólica dos pHCECs do que os iHCECs. A liberação máxima de citocinas pelos iHCECs foi aos 5 minutos de exposição aos raios UV. A liberação máxima de citocinas para pHCECs ocorreu aos 20 minutos de exposição aos raios UV.Em termos de quantidades totais de citocinas inflamatórias liberadas, os pHCECs liberaram substancialmente mais interleucina-1 beta, interleucina 8 e TNF-alfa do que os iHCECs, enquanto os iHCECs liberaram mais interleucina 6. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs mostraram uma mudança na liberação de interleucina 6 após a exposição aos três produtos químicos. A BAK causou uma diminuição na liberação de interleucina 6 em comparação com o controle para HCECs primários e imortalizados.O peróxido de hidrogênio causou um aumento na liberação de interleucina 6 de iHCECs, e uma diminuição na liberação de pHCECs. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs foram significativamente danificados em 0,005% e 0,1% de BAK. Após a realização de avaliações in vitro da toxicidade das células oculares, outros modelos animais de toxicidade ocular poderiam ser realizados para determinar o efeito de um produto ocular nos nervos da córnea ou no sistema imunológico ocular.Essas técnicas são essenciais para determinar os mecanismos de toxicidade da formulação de produtos químicos e de produtos no olho e ajudarão a minimizar o uso de animais para testes de desenvolvimento de produtos.

determining-toxicity-uv-radiation-chemicals-on-primary-immortalized

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Ensaio alamarBlue: um método fluorométrico sensível para rastrear os efeitos citotóxicos de formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica de células epiteliais da córnea humana

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Aprenda a avaliar a toxicidade de radiação UV e produtos químicos em células epiteliais da córnea humana primárias e imortalizadas. Este método in vitro reduz testes em animais na avaliação de segurança de produtos oftálmicos.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

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