Name: Crescimento, Purificação e Titulação do Vírus Herpes Simplex Oncolítico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda a cultivar, purificar e titular vírus herpes simplex oncolítico para imunoterapia do câncer. Este método simplificado permite produzir estoques virais de alta qualidade em laboratórios de biossegurança nível dois.

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A pesquisa no laboratório Saha foi apoiada em parte por fundos do DOD (W81XWH-20-1-0702) e da Fundação Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey foram parcialmente apoiados pelo NIH (R01 CA160762).

1) crescimento do OHSV
NOTA: Garantir a aprovação do comitê de biossegurança institucional antes de trabalhar com o OHSV. Este estudo foi realizado sob o Protocolo IBC aprovado nº 18007. Mantenha as precauções BSL2: alvejante todas as tubulações, pontas, tubos e outros materiais que entram em contato com o vírus. Luvas de spray com 70% de álcool isopropílico antes que as mãos deixem o capô de cultura celular BSL2. Lave sempre as mãos com água com sabão depois de trabalhar com um vírus.
<ol><li>No dia -1, as células vero de baixa passagem em 20 frascos T-150 cm2 a uma densidade de 7-8 × 106 células/frascos em meio de célula vero regular. NOTA: O meio Vero é preparado suplementando o meio de águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com soro de bezerro fetal inativado a calor de 10% (IFCS).</li>
	<li>No dia 0 (as células são 80-90% confluentes), adicione ohsv inóculo nas células Vero.<ol>
<li>Preparação do vírus inóculo<ol>
<li>Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 (MOI pode variar de 0,01 a 0,1, dependendo da capacidade de replicação do vírus) para amplificação do vírus. Use a fórmula (1) para calcular a quantidade de vírus (mL) para 20 frascos. Quantidade de vírus (mL) para 20 frascos = quantidade de vírus necessária (pfu)/titer de estoque de vírus (pfu/mL)(1)</li>
			<li>Use a solução salina tamponada de fosfato de alta glicose Dulbecco (DPBS) suplementada com 1% de IFCS para preparar o inóculo do vírus (7 mL por frasco T-150 cm2, ou seja, ~140 mL para 20 frascos). Adicione a quantidade necessária de oHSV a 140 mL de solução DE ALTA glicose DPBS/1% IFCS, vórtice por 1 min, e mantenha a mistura pronta para adição às células Vero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave os frascos T-150 cm2 2x com DPBS de alta glicose suplementados com 1% de IFCS (10 mL/lavagem). Aspire o DPBS/1% IFCS e adicione 7 mL de vírus inóculo/T-150 cm2 frasco.</li>
		<li>Balance suavemente os frascos por 5 min usando um roqueiro de frasco para distribuição adequada do inóculo sobre a monocamadoreira Vero, e, em seguida, incubar os frascos a 37 °C por 1,5-2 h. Certifique-se de que a prateleira da incubadora esteja nivelada.</li>
		<li>Remova o inóculo e adicione DMEM suplementado com 1% de IFCS (25 mL/frasco). Incubar os frascos por 2-4 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verifique os frascos diariamente para 90-100% CPE (ver Figura 2).</li>
	<li>Colher as células vero infectadas pelo OHSV.<ol>
<li>Colete a cultura supernante (~20 mL) de cada frasco (deixe ~5 mL em cada frasco) em tubos de centrífuga cônica de 50 mL ou recipiente de mídia.</li>
		<li>Use um raspador de células para raspar as células do fundo dos frascos suavemente. NOTA: As células devem sair rapidamente dos frascos.</li>
		<li>Adicione ~15 mL da supernasa cultura (coletada na etapa 1.4.1) a cada frasco (que traz o volume de ~20 mL em cada frasco, ou seja, 400 mL para 20 frascos) e lave suavemente o fundo dos frascos algumas vezes usando um tubo serológico estéril de 10 mL. NOTA: Não encosto vigorosamente. Procure manter todas as células intactas.</li>
		<li>Colete as células (+ média) em tubos de centrífuga cônica de 50 mL no gelo (use 8 tubos para conter 400 mL de células colhidas de 20 frascos).</li>
		<li>Gire as células a 300 g por 10 min a 4 °C e aspire o supernasce.</li>
		<li>Adicionar 1,25 mL (50%) de Tampão de Vírus (VB) e 1,25 mL (50%) de supernante de cultura (coletado na etapa 1.4.1) a cada tubo de centrífuga e re-suspender cada pelota completamente. Transfira as células re-suspensas de oito tubos de centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. NOTA: Consulte a preparação da solução VB na Tabela 1. Esterilize a solução VB por meio de um filtro de esterilização de mídia. Use 0,5 mL de VB + 0,5 mL de supernadante por frasco T-150 cm2 para re-suspensão, ou seja, para 20 frascos (20 mL), use 10 mL de VB e 10 mL de supernanato cultural.</li>
		<li>Congele as células re-suspensas usando gelo seco/100% etanol e armazene a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2) purificação oHSV
<ol><li>Snap-freeze (em gelo seco e 100% etanol)/degelo (em um banho de água morna de 37 °C) as células seguidas por sônica de banho de água por 1 min para um total de 3 ciclos para garantir a lise adequada das células para liberar vírus no supernante. NOTA: Realize a sonicação por 1 min usando 40 kHz, 120 V de potência. Se um sônico tunable não estiver disponível, use um sonicator de banho de água ultrassônico. Tome uma alíquota de 50 μL para titulação na seção 3, o que ajudará a identificar qual das etapas seguintes é responsável pela perda potencial do vírus durante o procedimento de purificação.</li>
	<li>Trate o nuclease celular com Benzonase Nuclease (175 unidades/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M de estoque = 2 μL/mL), vórtice e incubar por 30 min a 37 °C. Coloque o tubo no gelo e realize as seguintes etapas a 4 °C.</li>
	<li>Pelota os detritos celulares por centrifugação de baixa velocidade.<ol>
<li>Gire a célula lysate a 300 g por 10 min.</li>
		<li>Colete o supernante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (suspenda a pelota celular em 0,5 mL de VB, designe-o como pelota-1 e armazene a 4 °C para uso na etapa 2.3.5; veja a Figura 1).</li>
		<li>Gire o supernante (obtido na etapa 2.3.2) novamente a 500 g por 10 min.</li>
		<li>Colete o supernante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (suspenda a pelota celular em 0,5 mL de VB, designe-o como pelota-2 e armazene a 4 °C para uso na etapa 2.3.5; veja a Figura 1).</li>
		<li>Misture a pelota-1 re-suspensa (de 2.3.2) e a pelota-2 (de 2.3.4) em um novo tubo de centrífugo de 1,7 mL, vórtice/sonicato (banho de água) 2x e gire a 400 g por 10 minutos. Recolher o supernante e combiná-lo com o supernacido obtido na etapa 2.3.4; ver Figura 1). NOTA: Realize a sonicação por 1 min usando 40 kHz, 120 V de potência para evitar a agregação viral antes do procedimento de filtragem na etapa 2.4. Tome uma alíquota de 50 μL do supernatante combinado para titulação na seção 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtre o supernante combinado (~21 mL, ou seja, 20 mL de 1,4,6, 0,5 mL de 2,3,2 e 0,5 mL de 2,3,4) utilizando o seguinte método de filtragem de 3 etapas.<ol>
<li>Desenhe 21 mL do supernadante usando uma seringa de 10 mL (5-7 mL cada vez para fácil passagem através do filtro) e passe-a através de um filtro de membrana de difluoreto de polivinida de 5 μm estéril (PVDF) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 1).<ol>
<li>Adicione 1 mL de VB a um tubo de centrífuga cônica de 50 mL esvaziado em 2,4,1 (para coletar a quantidade restante de vestígios de supernascido do vírus), vórtice, e passar pelo mesmo filtro PVDF de 5 μm colocado no TUBE 1 (elevando o total para 22 mL de filtrado). Prossiga para a etapa 2.4.2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Retire 22 mL do filtro do TUBE 1 (como em 2.4.1) e passe-o através de um filtro de membrana estéril de 0,8 μm de ester de celulose mista (MCE) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 2).<ol>
<li>Adicione 1 mL de VB ao TUBE 1 esvaziado na etapa 2.4.2, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro MCE de 0,8 μm colocado no TUBE 2 (elevando o total para 23 mL de filtrado). Prossiga para a etapa 2.4.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Desenhe 23 mL de filtrado do TUBE 2 (como em 2.4.1) e passe-o através de um filtro PVDF de 0,45 μm estéril colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 3).<ol>
<li>Adicione 1 mL de VB ao TUBE 2 esvaziado na etapa 2.4.3, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro PVDF de 0,45 μm colocado no TUBE 3 (elevando o total para 24 mL de filtrado). NOTA: Tome uma alíquota de 50 μL do filtrado para titulação na seção 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugação de alta velocidade usando o método de gradiente de sacarose NOTA: Um rotor F13-14x50cy de ângulo fixo foi usado neste protocolo. Tanto o rotor quanto a centrífuga devem estar a 4 °C antes de prosseguir com as etapas seguintes.<ol>
<li>Adicione 10 mL de uma solução de sacarose filtrada 25% filtrada estéril (preparada dissolvendo 25 g de pó de sacarose em 100 mL da Solução de Sal Balanceado da Hank) em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL.</li>
		<li>Lentamente (3 mL/min) adicione 24 mL do filtrado do vírus (obtido a partir da etapa 2.4.3.1) em cima da camada de sacarose. Tome cuidado para manter camadas separadas do vírus filtrado e da solução de sacarose. NOTA: Até 30 mL da camada do vírus podem ser adicionados mais de 10 mL da solução de sacarose.</li>
		<li>Centrifugar o tubo por 90 min a 22.620 g a 4 °C.</li>
		<li>Remova o supernatante e a camada de sacarose do tubo de centrífuga cônica de 50 mL. NOTA: A pelota do vírus deve ser esbranquiçada. Tome uma alíquota de 50 μL do supernante e uma alíquota de 50 μL da camada de sacarose para titulação na seção 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspenda a pelota em solução de 10% de glicerol/PBS.<ol>
<li>Adicione 1 mL de glicerol estéril de 10% (diluído em PBS) ao tubo de centrífuga cônica de 50 mL para cobrir a pelota. NOTA: A quantidade da mistura re-suspensa pode variar (como 0,8-1,2 mL) dependendo do tamanho da pelota. Um volume menor daria uma maior concentração de vírus.</li>
		<li>Coloque o tubo de centrífuga cônica de 50 mL no gelo por 2-4 h. Durante este período, sonicato/vórtice a pelota a cada 15 minutos por 30 s para ajudar a desalojar/suspender a pelota.</li>
		<li>Recolher a pelota re-suspensa (1 mL de 10% de glicerol/PBS + o tamanho da pelota levará o volume total para ~1,3 mL) em um tubo de microcentrifusagem de 2 mL. [Opcional: Adicione mais 0,3 mL de 10% de glicerol/PBS ao mesmo tubo de centrífuga cônica de 50 mL para coletar a quantidade restante de traço da pelota, pipeta para cima e para baixo, e combine com a pelota re-suspensa na etapa 2.6.3 para levar o volume total a ~1,6 mL.]<ol>
<li>Se a suspensão na etapa 2.6.3 for turva ou nublada (devido a detritos celulares), centrifugar o tubo a 500 g por 10 min, transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL e prossiga para a etapa 2.6.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tome uma alíquota de 50 μL para titulação oHSV na seção 3. Aliquot o resto da solução (250 μL/aliquot) em tubos de microcentrifusagem estéril com tampas de parafuso (selada bem para armazenamento a longo prazo), snap-freeze e armazenar a -80 °C até o uso (pronto para estudos experimentais uma vez que o oHSV é determinado). NOTA: Todos os materiais que entram em contato com o vírus devem ser branqueados ou tratados com radiação ultravioleta antes da remoção do capô ou descarte.</li>
	</ol></li>
</ol>3. titulação oHSV e ensaio de placa
<ol><li>Semente 1.7-1.8 x 105 células Vero/bem em uma placa de cultura celular de 6 poços no meio celular Vero (DMEM com 10% IFCS; ver passo 1.1). NOTA: Certifique-se de que as células estão distribuídas de forma homogênea por todo o poço; não gire a placa, o que pode causar acúmulo de células no meio dos poços. Para evitar rodopiar, balance lentamente a placa à mão verticalmente, depois horizontalmente, e, em seguida, coloque suavemente a placa na incubadora.</li>
	<li>No dia seguinte (quando as células atingem 70-80% de confluência), aspiram o meio cultura e adicionam 1 mL/poço de PBS de alta glicose suplementada com 1% de IFCS. Deixe a placa no capô da cultura celular até que o passo 3.3 esteja completo.</li>
	<li>Diluir o vírus em tubos de polipropileno de 5 mL usando PBS/1% IFCS(Figura 3). NOTA: Utilize a alíquota de 50 μL coletada na etapa 2.6.4 para diluição serial. No tubo 1 (10-3 diluição), adicione 2 μL do vírus em 1998 μL de PBS/1%IFCS, vórtice. No tubo 2 (10-5 diluição), tome 10 μL dotubo 1 em 990 μL de PBS/1% IFCS, vórtice. No tubo 3rd (diluição de 10-6), tome 100 μL do tubo2 em 900 μL de PBS/1% IFCS, vórtice; continuar esta diluição serial de 10 vezes até 10-9 diluição. Veja os detalhes na Figura 3.</li>
	<li>Aspirar PBS/1% IFCS e adicionar 0,7 mL/bem do vírus diluído serial (a partir de 10-5 a 10-9) às células Vero. NOTA: Não deixe as células secarem.</li>
	<li>Balance suavemente a placa em um roqueiro por 5 minutos à temperatura ambiente (para garantir a distribuição homogênea do inóculo do vírus).</li>
	<li>Incubar a placa por 1,5 h a 37 °C. NOTA: Durante este período de incubação, prepare 1:1000 diluição da imunoglobulina humana G (IgG) no DMEM complementada com 1% de IFCS. Para uma placa de 6 poços, prepare 12,5 mL para que 2 mL/bem possa ser usado na etapa 3.7. Ajuste a diluição para explicar as variações de lotes no IgG humano.</li>
	<li>Remova o inóculo do vírus dos poços e adicione 2 mL/poço de IgG humano de 0,1% (para neutralizar o oHSV no meio da cultura e evitar a formação de placas secundárias) no DMEM complementado com 1% de IFCS. Incubar a placa a 37 °C durante 3-4 dias. NOTA: Placas claras geralmente se formam em 3 dias.</li>
	<li>Placas de fixação e coloração<ol>
<li>Remova o supernasce e fixe as células em metanol puro (1 mL/bem) por 5 minutos. Retire o metanol e deixe as placas secarem ao ar.</li>
		<li>Diluir a mancha de Giemsa (1:5) com água deionizada, e adicionar 1 mL da mancha de Giemsa diluída por poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10-15 min.</li>
		<li>Retire a mancha, enxágue com água da torneira e deixe as placas secarem ao ar.</li>
		<li>Conte as placas usando um microscópio dissecando.</li>
		<li>Opcional para oHSVs com expressão lacZ:<ol>
<li>Remova o supernasce e fixe as células com glutaraldeído de 0,2% a frio/2% paraformaldeído por 5-10 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Remova a solução fixa e lave as células 3x com PBS.</li>
			<li>Adicione a solução X-gal às células (1 mL/bem) e incubar a placa a 37 °C por 2 h. NOTA: A mancha X-gal deve ser preparada recentemente no dia da coloração; armazenamento a longo prazo pode levar ao desbotamento de cor. Veja a preparação da solução X-gal na Tabela 1.</li>
			<li>Retire a mancha X-gal e lave a placa com água da torneira por 1 min.</li>
			<li>Contra-mancha com solução Vermelha Neutra (1 mL/bem) por 2 min a temperatura ambiente. NOTA: Veja a preparação da solução Vermelho Neutro na Tabela 1.</li>
			<li>Lave a placa com água da torneira por 1 min; permitir que as placas sequem ao ar.</li>
			<li>Conte placas azuis usando um microscópio de dissecação(Figura 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule o título usando fórmula (2) Titer em pfu/mL (unidades formadoras de placas) = Número de placas/0,7 mL × fator de diluição(2) NOTA: Por exemplo, se 25 placas forem encontradas no poço de diluição10 -9, o título é 25/0,7 ×10 9 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Este é o último oHSV titer de alíquotas preparadas na etapa 2.6.4.</li>
</ol>

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</ol>

SDR é um co-inventor de patentes relacionadas a vírus herpes simplex oncolíticos, de propriedade e gerenciado pela Universidade de Georgetown e pelo Hospital Geral de Massachusetts, que receberam royalties da Amgen e ActiVec Inc. e está no Conselho Consultivo Científico da EG 427. Os outros autores não têm nada a revelar.

O protocolo começa com o crescimento do oHSV em células Vero de baixa passagem. A confluência da monocamada celular Vero deve ser ~80% no momento da inoculação do vírus, pois as células supercultivadas podem desenvolver estruturas fibrosas apertadas que podem reduzir a entrada de OHSV nas células Vero20. Uma vez observadas 90-100% CPE, a cultura sobrenante é removida, as células são colhidas, resuspended em VB/supernante (ver passo 1.4.6), congelado por snap e armazenado a -80 °C para purificação ...

Os vírus oncolíticos (OVs) são uma forma emergente e única de imunoterapia contra o câncer. Os OVs replicam-se seletivamente em células tumorais e lises (poupando células normais/saudáveis)1 ao induzir imunidade anti-tumor2. O vírus herpes simplex oncolítico (oHSV) é um dos vírus mais estudados entre todos os OVs. É mais distante na clínica, com Talimogene laherparepvec (T-VEC) sendo o primeiro e único OV a receber aprovação da FDA nos EUA para o tratamento de melanoma avançado3. Além do T-VEC, muitos outros oHSVs geneticamente modificados estão sendo testados pré-clínico e clinicamente em diferentes tipos de câncer3,4,5,6,7,8. A atual biotecnologia avançada de DNA recombinante aumentou ainda mais a viabilidade da engenharia de novos oHSVs codificação para transgenes terapêuticos3,5. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação de oHSV é fundamental antes que qualquer oHSV (recém-desenvolvido) possa ser testado para estudos in vitro e in vivo. Este artigo descreve um método simples passo-a-passo de crescimento oHSV (em células Vero), purificação (pelo método de gradiente de sacarose) e titulação (por um ensaio de placa oHSV em células Vero)(Figura 1). Pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de Nível 2 (BSL2) de Biossegurança para obter um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.
Vero, uma linha de células renais de macaco verde africano, é a linha celular mais usada para propagação oHSV9,10,11,12,13 como as células Vero têm uma via de sinalização antiviral defeituosa14. Outras linhas celulares com estimulador inativado de sinais de genes interferon (STING) também podem ser usadas para o crescimento oHSV12,13. Este protocolo utiliza células Vero para o crescimento e ensaio de placas oHSV. Após a propagação, as células infectadas pelo OHSV são colhidas, lised e submetidas à purificação, onde as células lised são tratadas pela primeira vez com nuclease de benzonase para degradar o DNA das células hospedeiras, prevenir a agregação nucleico ácido-proteína e reduzir a viscosidade do lisato celular. Como a ativação adequada da benzonase muitas vezes requer Mg2+, 1-2 mM MgCl2 é usado neste protocolo15. Os detritos de células hospedeiras do lysato celular tratado com benzonase são ainda mais eliminados pela filtragem serial antes da centrifugação de sáuera-gradiente de alta velocidade. Uma almofada viscosa de solução de sacarose de 25% ajuda a garantir uma taxa mais lenta de migração de vírus através da camada de sacarose, deixando componentes relacionados com células hospedeiras no sobrenante, melhorando assim a purificação e limitando a perda de vírus na pelota16. O oHSV purificado é então titulado em células Vero, e placas virais são visualizadas por giemsa manchando17 ou X-gal staining (para LacZ codificando oHSVs)18.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,7 mL Tubos de centrífuga</td> de polipropileno <td>Sigma</td><td>CLS3620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos</td> de polipropileno <td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubos</td><td></td> de centrífuga de polipropileno <td>Falcon</td> 352063 <td></td></tr><tr><td>50 mL Placas</td><td>de</td> cultura de células <td>Falcon</td> 352098 <td></td></tr><tr><td>6 poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato Tampolado com Solução Salina</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Mancha</td><td>Sigma</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solução Salar Balanceada (HBSS)</td> <td>Corning</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco com alto teor de glicose s Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>Imunoglobulina humana</td><td>Gamastan</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de esterilização de mídia, 250 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de esterilização de mídia, 500 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>Solução Vermelha</td><td>Neutra Sigma</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher scientific</td><td>&nbsp; 15710S</td><td></td></tr><tr><td>Balancim de placa</td><td>Fisher</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianeto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianeto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 21R Centrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Estéreis com Tampas de Rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-371</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Seringa, 0.45 PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Seringa, 0.8 MCE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLAA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa, 5 &micro; m PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150 frasco de cultura</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC 816116</td><td></td><td></td>Banho-maria</tr><tr><td>ultrassônico</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Corning</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

crescimento, purificação e titulação do vírus herpes simplex oncolítico

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Os vírus oncolíticos (OVs), como o vírus herpes simplex oncolítico (oHSV), são uma estratégia de tratamento em rápido crescimento no campo da imunoterapia contra o câncer. Os OVs, incluindo oHSV, replicam-se seletivamente e matam células cancerígenas (poupando células saudáveis/normais) ao induzir a imunidade anti-tumor. Devido a essas propriedades únicas, as estratégias de tratamento baseadas em oHSV estão sendo cada vez mais utilizadas para o tratamento do câncer, preclinicamente e clinicamente, incluindo talimogene laherparevec aprovado pela FDA (T-Vec). Crescimento, purificação e titulação são três técnicas essenciais de laboratório para quaisquer OVs, incluindo oHSVs, antes que possam ser utilizados para estudos experimentais. Este artigo descreve um método simples passo a passo para amplificar oHSV em células Vero. À medida que os OHSVs se multiplicam, eles produzem um efeito citopático (CPE) nas células Vero. Uma vez que 90-100% das células infectadas apresentam um CPE, elas são colhidas suavemente, tratadas com cloreto de benzonase e magnésio (TMN2),filtradas e submetidas à purificação usando o método de suênula-gradiente. Após a purificação, o número de oHSV infecciosos (designados como unidades formadoras de placas ou PFUs) é determinado por um "ensaio de placa" em células Vero. O protocolo aqui descrito pode ser usado para preparar estoque de oHSV de alta titulação para estudos in vitro na cultura celular e experimentos in vivo em animais.

Uma breve visão geral de todo o protocolo é retratada na Figura 1, que representa as etapas críticas envolvidas no crescimento, purificação e titulação do oHSV. CPE em células Vero pode ser detectado tão cedo quanto 4 h infecção pós-HSV19. A Figura 2 demonstra cpe em células Vero em três pontos de tempo diferentes após a infecção por OHSV. O nível do CPE é aumentado ao longo do tempo. Neste protocolo, 90-100% CPE é geralmente observado de...

Neste manuscrito, descrevemos um método simples de crescimento, purificação e titulação do vírus herpes simplex oncolítico para uso pré-clínico.

Crescimento, Purificação e Titulação do Vírus Herpes Simplex Oncolítico

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

O vírus herpes simplex oncolítico é uma forma emergente de imunoterapia contra o câncer. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação titeric do vírus é fundamental para o uso em estudos experimentais. Este método é muito simples e pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de nível dois de biossegurança para receber um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.A produção de um estoque viral puro e de alta qualidade é crucial, uma vez que é usada para estudar a resposta imune anticancerígena e desenvolver uma nova forma de imunoterapia contra o câncer baseada em vírus. Este protocolo pode ser usado para purificar qualquer vírus herpes simplex de tipo selvagem ou geneticamente modificado. Este protocolo deve ser fácil de ler e fácil de seguir para um indivíduo que nunca realizou essa técnica antes.Os materiais listados e reagentes devem estar no lugar antes de experimentar esta técnica pela primeira vez. Comece lavando os frascos de centímetros quadrados T-150 com duas vezes alta glicose DPBS suplementada com 1%IFCS. Aspire o DPBS e adicione sete mililitros de inóculo de vírus por frasco.Balance suavemente os frascos por cinco minutos e incubar a 37 graus Celsius por 1,5 a 2 horas. Em seguida, remova o inóculo e adicione 25 mililitros de DMEM suplementados com 1%IFCS a cada frasco. Após a incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias, colete 20 mililitros da cultura sobrenasal de cada frasco em tubos de centrífuga de 50 mililitros.Usando um raspador de células, raspe as células do fundo dos frascos. Adicione aproximadamente 15 mililitros da cultura anteriormente coletada sobrenatante a cada frasco para trazer o volume até 20 mililitros, em seguida, use uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros para lavar suavemente o fundo dos frascos algumas vezes. Colete as células com médio em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros colocados no gelo.Centrifugar os tubos a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda cada pelota completamente em 1,25 mililitros de tampão de vírus, ou VB, e 1,25 mililitros de supernanato de cultura previamente coletado. Misture todas as pelotas resuspended em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros.Esperte as células resuspended usando gelo seco e 100% etanol e armazene a menos 80 graus Celsius. Descongele as células congeladas anteriormente quebradas em um banho de água quente a 37 graus Celsius e sonicate por um minuto por três ciclos em um banho de água. Adicione 175 unidades de Benzonase Nuclease e dois microliters de dois cloreto de magnésio mililitro por mililitro da célula lysate e vórtice.Depois de uma incubação de 30 minutos e banho de água morna a 37 graus Celsius, coloque o tubo no gelo. Gire a célula lysate a 300 vezes G por 10 minutos. Colete o supernatante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros e resuspense a pelota celular em 500 microliters de VB. Designe-o como uma pelota.Gire o supernasal coletado novamente a 500 vezes G por 10 minutos e armazene o supernasal separadamente em um tubo de centrífuga cônica fresco de 50 mililitros para usar mais tarde. Resuspend a pelota de célula em 500 microliters de VB, designando-a como pelota dois. Combine a pelota resuspended um e pelota dois em um novo tubo de centrífugo de 1,75 mililitro e vórtice e sonicato duas vezes em um banho de água antes de girar os tubos a 400 vezes G por 10 minutos.Colete o supernasal de tubo de centrífuga de 1,7 mililitro e combine-o com o supernasal previamente coletado tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Filtre o supernatante através de um filtro de membrana PVDF de cinco micrômetros estéreis em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros chamado tubo um. Adicione um mililitro de VB ao tubo de centrífuga de 50 mililitros, esvaziado após filtrar o supernatante da etapa anterior, vórtice, e passá-lo através do mesmo filtro de membrana PVDF colocado no tubo um.Passe o filtrado do tubo um através de um filtro de membrana MCE de 0,8 micrômetros estéril colocado em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros chamado tubo dois. Adicione um mililitro de VB ao tubo esvaziado, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro MCE colocado no tubo dois. Passe o filtrado do tubo dois através de um filtro PVDF de 0,45 micrômetros estéril colocado em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros rotulado tubo três.Como descrito anteriormente, repita a lavagem do tubo dois com um mililitro de VB para adicionar filtrado ao tubo três. Nesta análise representativa, o efeito citopático pôde ser observado nas células Vero aos 36, 48 e 72 horas após a infecção por OHSV com o arredondamento das células afetadas. O nível crescente de CPE ao longo do tempo é evidente como visualizado pela expressão mCherry.Às 72 horas após a infecção, placas virais foram manchadas com X-gal para visualizar oHSVs com expressão lacZ. Esfregar suavemente as células infectadas pelo vírus e lavar suavemente a parte inferior do frasco é fundamental para manter intactas todas as células infectadas pelo HSV para que um alto estoque viral de titer possa ser obtido.

growth-purification-and-titration-of-oncolytic-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Oncolíticos vírus são promissores para o câncer de terapêutica. A capacidade de determinar a infectability de amostras de tecido vivo obtidos de pacientes antes do tratamento é uma vantagem exclusiva dessa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve como processo de tecidos...

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