Name: Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprenda a gerar perfis de polissomas sem sistemas automatizados de fracionamento de gradiente. Este método manual permite analisar a atividade ribossomal em células de Saccharomyces cerevisiae com precisão.

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Os autores agradecem ao Dr. Percy Tumbale e à Dra. Melissa Wells por sua leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).

1. Preparação de 7% - 47% de gradientes de sacarose
NOTA: O intervalo linear do gradiente de sacarose pode ser modificado para obter uma melhor separação, dependendo do tipo de célula utilizada. Este protocolo é otimizado para perfis polissômicos para S. cerevisiae.
<ol><li>Preparar soluções-estoque de 7% e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 1 mM TDT). Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 14 mL de soluções de sacarose a 17%, 27% e 37%, dispensando e misturando as soluções-estoque de sacarose a 7% e 47% da maneira descrita na Tabela 1.</li>
	<li>Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno (14 x 89 mm) em um rack de tubo de ensaio de visão completa. Garanta espaço suficiente entre os tubos para que as ações com um tubo não perturbem os outros.</li>
	<li>Ligue uma agulha longa a uma seringa de 3 ml. Para este protocolo, use uma agulha de 9 pol e 22 G com uma ponta contundente (Figura 1), mas qualquer agulha longa o suficiente para atingir o fundo do tubo de centrífuga será suficiente. NOTA: Efectuar um enchimento e dispensação de ensaio para garantir que a seringa pode conter a solução de sacarose sem qualquer gotejamento antes de configurar os gradientes.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de sacarose a 7% ao fundo de cada tubo de centrífuga.</li>
	<li>Adicionar 2 ml de sacarose a 17% por baixo da solução a 7%, posicionando a ponta da agulha nas imediações do fundo do tubo e dispensando a solução lenta e cuidadosamente.</li>
	<li>Repita com 2 mL cada uma das soluções de sacarose a 27%, 37% e 47%. Certifique-se de que cada camada seja distinguível uma da outra por uma linha que marque a separação das densidades (Figura 2). NOTA: Se os gradientes não forem utilizados no prazo de 48 horas, então, neste momento, antes da sua fixação num gradiente contínuo, congelar os tubos com soluções de sacarose em camadas em azoto líquido e conservar num congelador de -80 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Armazenar gradientes a 4 °C durante a noite para permitir que os gradientes se instalem em uma porcentagem contínua e crescente de sacarose. Leva 8-12 h para que as soluções de sacarose em camadas se estabeleçam em um gradiente linear de sacarose. Os gradientes lineares são estáveis por até 48 h. O armazenamento durante a noite a 4 °C proporciona tempo suficiente para o descongelamento e a deposição num gradiente linear para a utilização de soluções de sacarose congeladas e em camadas. Use um densitômetro para avaliar a qualidade do gradiente. NOTA: É fundamental armazenar os gradientes em um local estável onde eles não serão perturbados, pois quaisquer movimentos ou vibrações interromperão o gradiente.</li>
</ol>2. Preparação de extratos de células de levedura
<ol><li>Inocular a cepa de levedura de interesse em 50 mL de extrato de levedura peptona dextrose (YPD) e crescer durante a noite a 30 °C em uma incubadora agitada para a fase estacionária. NOTA: A temperatura pode variar dependendo dos requisitos de cepa de levedura.</li>
	<li>Transfira 10 mL de cultura de fase estacionária para 1 L de meio YPD fresco. Incubar as células com agitação vigorosa a 30 °C (ou outra temperatura adequada) até que a cultura atinja a fase de crescimento exponencial médio (OD600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>Na fase de crescimento exponencial médio, adicionar cicloheximida à cultura a uma concentração final de 0,1 mg/mL. Incubar no gelo por 5 min.</li>
	<li>Colher as células por centrifugação a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C. NOTA: Neste ponto, as células podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C.</li>
	<li>Ressuspender as células em 700 μL refrigerados de tampão de extração de polissomas (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/mL de cicloheximida, 0,2 mg/mL de heparina). Adicione 100 unidades de inibidor de RNase e transfira-o para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione ~400 μL de grânulos de vidro pré-resfriados com uma faixa de tamanho de 425-600 μm ao tubo de centrífuga. Interrompa as células de levedura por agitação vigorosa em um batedor de contas por 5 min.</li>
	<li>Clarificar o lisado por centrifugação a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Determinar a concentração do ARN no lisado clarificado medindo a absorvância a 260 nm com um espectrofotómetro ou utilizando um sistema de detecção de ARN baseado em fluorescência. NOTA: Para medições de concentração de RNA muito precisas, use kits de detecção de RNA baseados em fluorescência.</li>
	<li>Certifique-se de que a concentração de RNA é de 0,5-1 μg/μL. Se a concentração de RNA for muito baixa, reduza o volume de tampão de extração de polissomas usado para ressuspender as células em experimentos futuros. NOTA: Carregue o lisado nos gradientes imediatamente após a lise e a quantificação do RNA. Se necessário, congelar rapidamente os lisados em azoto líquido e conservar a -80 °C durante alguns dias.</li>
</ol>3. Centrifugação de gradientes
<ol><li>Carregue cuidadosamente o lisado na parte superior dos gradientes. Coloque a ponta da pipeta contra a parede interna, na parte superior do tubo de polipropileno. Incline suavemente o tubo e distribua lentamente o lisado no topo do gradiente pingando contra a parede. Tome muito cuidado para não interromper ou perturbar o gradiente ao carregar o lisado. NOTA: A quantidade de lisado carregado irá variar de acordo com o tipo de célula. O conteúdo do RNA também varia. Pode ser necessário realizar uma série de experimentos para determinar a quantidade de lisado necessária para gerar um perfil de polissomo ideal. Para leveduras, 300 μg de RNA é um bom ponto de partida para otimização.</li>
	<li>Coloque suavemente os tubos nos baldes pré-resfriados de um rotor de balde oscilante. NOTA: Cada tubo de centrífuga de polipropileno deve ter volumes iguais de gradiente e a quantidade de lisado carregada. Isso pode variar de tubo para tubo. Certifique-se de que a variação não cause um erro de desequilíbrio durante a ultracentrifugação.</li>
	<li>Centrifugar os gradientes a 260,110 x g durante 150 min a 4 °C.</li>
</ol>4. Fração e coleta de dados
<ol><li>Remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da caçamba oscilante e coloque-os em um suporte de tubo.</li>
	<li>Rotule as placas de 96 poços para armazenar as frações e pré-resfrie no gelo. NOTA: Use uma placa de 96 poços adequada para um espectrofotômetro que tenha uma janela óptica de até 230 nm para determinações de ácido nucleico a 260 nm/280 nm.</li>
	<li>Colete frações de 100 μL ou 200 μL a partir do topo do gradiente, inserindo cuidadosamente uma ponta de pipeta na parte superior do gradiente. Colete frações até que todo o gradiente seja alíquotado. O número de frações dependerá do volume total do gradiente. Observação : colete as frações de uma maneira que não interrompa o restante do gradiente. Certifique-se de que todas as frações tenham volume igual. Além do fracionamento manual, outro método de baixo custo para o fracionamento é usar uma pequena bomba peristáltica.</li>
	<li>Transfira cada fração para a placa de 96 poços para alcançar o fundo do tubo de centrífuga. Mantenha as frações coletadas no gelo em todos os momentos.</li>
	<li>Medir a absorvância de cada fracção a 254 nm com um espectrofotómetro. Use as soluções de sacarose a 7% e 47% como espaços em branco. NOTA: Ao medir a absorbância de frações, tenha em mente que, para a maioria dos espectrômetros e colorímetros, a faixa de absorvância mais eficaz é de 0,1-1. Se as medições de absorbância estiverem fora do intervalo (≥1,0), as frações têm muito material. Dilua a amostra, recolha novamente os dados e, em seguida, tenha em conta o factor de diluição ao plotar o perfil.</li>
	<li>Crie o perfil de polissomo plotando o número de frações versus a absorvência.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui um método para criar perfis de polissomas sem o uso de sistemas de fracionamento automatizados caros foi descrito. A vantagem desse método é que ele torna o perfil de polissomas acessível a laboratórios que não possuem sistemas de fracionamento automatizados. As principais desvantagens deste protocolo são o tedioso fracionamento manual e a sensibilidade reduzida em comparação com o sistema de fracionamento de densidade dedicado.
Este protocolo envolve a preparação cuidadosa de gradientes ...

Os ribossomos são complexos ribonucleoproteicos mega-Dalton que realizam o processo fundamental de tradução de mRNA em proteínas. Os ribossomos são responsáveis por realizar a síntese de todas as proteínas dentro de uma célula. Os ribossomos eucarióticos compreendem duas subunidades designadas como a pequena subunidade ribossomal (40S) e a grande subunidade ribossomal (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. O ribossomo totalmente montado é designado como o monossomo dos anos 80. Os polissomos são grupos de ribossomos envolvidos na tradução de uma única molécula de mRNA. O fracionamento de polissomas por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é um método poderoso usado para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos associados à tradução de ribossomos e analisar fatores associados a polissomos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica é frequentemente usada para separar polissomos de ribossomos únicos, subunidades ribossomais e partículas de ribonucleoproteína mensageiras. Os perfis obtidos a partir do fracionamento podem fornecer informações valiosas sobre a atividade de tradução dos polissomos14 e o status de montagem dos ribossomos15,16,17.
A montagem do ribossomo é um processo muito complexo facilitado por um grupo de proteínas conhecido como fatores de montagem do ribossomo 18,19,20,21. Esses fatores desempenham uma ampla gama de funções durante a biogênese do ribossomo por meio de interações com muitas outras proteínas, incluindo ATPases, endo e exonucleases, GTPases, helicases de RNA e proteínas de ligação ao RNA22. O fracionamento de polissomos tem sido uma ferramenta poderosa usada para investigar o papel desses fatores na montagem de ribossomos. Por exemplo, esse método tem sido utilizado para demonstrar como mutações na polinucleotídeo quinase Grc3, um fator de processamento pré-rRNA, podem afetar negativamente o processo de montagem do ribossomo17,23. O perfil de polissomas também destacou e mostrou como os motivos conservados dentro da ATPase Rix7 são essenciais para a produção de ribossomos16.
O procedimento para o fracionamento de polissomos começa com a produção de lisados celulares solúveis a partir de células de interesse. O lisado contém RNA, subunidades ribossomais e polissomos, bem como outros componentes celulares solúveis. Um gradiente de sacarose contínuo e linear é feito dentro de um tubo ultracentrífugo. A fração solúvel do lisado celular é suavemente carregada no topo do tubo de gradiente de sacarose. O tubo de gradiente carregado é então submetido à centrifugação, que separa os componentes celulares por tamanho dentro do gradiente de sacarose pela força da gravidade. Os componentes maiores viajam mais para dentro do gradiente do que os componentes menores. A parte superior do gradiente abriga os componentes celulares menores e mais lentos, enquanto os componentes celulares maiores e mais rápidos são encontrados na parte inferior. Após a centrifugação, o conteúdo do tubo é coletado como frações. Este método efetivamente separa subunidades ribossomais, monossomos e polissomos. A densidade óptica de cada fração é então determinada medindo a absorvância espectral a um comprimento de onda de 254 nm. A plotagem da absorbância vs. número de frações produz um perfil polissômico.
Gradientes lineares de densidade de sacarose podem ser gerados utilizando um fabricante de gradientes. Após a centrifugação, os gradientes são frequentemente fracionados e as absorvâncias medidas usando um sistema automatizado de fracionamento de densidade 3,7,13,24,25. Embora esses sistemas funcionem muito bem para produzir perfis de polissomos, eles são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para alguns laboratórios. Aqui é apresentado um protocolo para gerar perfis de polissomas sem o uso desses instrumentos. Em vez disso, este protocolo utiliza equipamentos normalmente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular.

<table><tbody><tr><td>Fracionador Automático</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Leitor de Placas Multimodo</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Vidro, lavadas com ácido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425-ndash; 600 &mu; m</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio, 1 M</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>Agulha, 22 G, Cubo de Metal</td><td>Hamilton Company</td><td>7748-08</td><td>comprimento personalizado 9 polegadas, estilo de ponta 3</td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de Polipropileno</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de polipropileno Peg Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Kit de ensaio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNAse</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor de Balde Oscilante Pkg</td> Seringa <td>331336</td><td></td><td>Coulter Beckman</td></tr><tr><td>, 3 mL</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M,&nbsp; pH 7.4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Microplaca, 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

O fracionamento de polissomos por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos sendo traduzidos por ribossomos e analisar fatores associados a polissomos. Embora os fabricantes automatizados de gradientes e os sistemas de fracionamento de gradientes sejam comumente usados com essa técnica, esses sistemas geralmente são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para laboratórios que têm recursos limitados ou não podem justificar a despesa devido à sua necessidade infrequente ou ocasional de executar esse método para suas pesquisas. Aqui, um protocolo é apresentado para gerar perfis de polissomo de forma reprodutível usando equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular sem instrumentos de fracionamento especializados. Além disso, uma comparação de perfis de polissomas gerados com e sem um sistema de fracionamento de gradiente é fornecida. Estratégias para otimizar e produzir perfis de polissomos reprodutíveis são discutidas. Saccharomyces cerevisiae é utilizado como organismo modelo neste protocolo. No entanto, este protocolo pode ser facilmente modificado e adaptado para gerar perfis de ribossomos para muitos organismos e tipos de células diferentes.

Três perfis de polissomas representativos são mostrados na Figura 3. Todos os perfis são da mesma cepa de levedura. Um perfil típico de polissomas terá picos bem resolvidos para as subunidades ribossômicas dos anos 40, 60 e 80, bem como polissomos. A crista de cada subunidade ribossomal e o pico do polissomo serão aparentes em cada perfil (Figura 3). Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado na <strong class="xf...

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo que revela detalhes moleculares sobre a atividade dos ribossomos dentro da célula. Essa técnica permite que os usuários obtenham as informações valiosas fornecidas por um perfil de polissomos, que não têm acesso a sistemas automatizados de fracionamento de gradiente. Tome seu tempo ao preparar os gradientes e armazene os gradientes em um local onde eles não serão interrompidos por um compressor ou outras operações mecânicas à medida que se estabelecem em um gradiente linear.Para começar, preparar soluções-estoque de 7 e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose. Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 mícron. Preparar 14 mililitros de soluções de 17, 27% e 37% de sacarose, dispensando e misturando as soluções de estoque de 7 e 47%.Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno em um rack de tubo de ensaio de visão completa. Certifique-se de que há espaço suficiente entre os tubos para que as ações com um tubo não perturbem os outros. Anexe uma agulha de nove polegadas, calibre 22 com uma ponta romba a uma seringa de três mililitros e execute um enchimento e dispense de teste para garantir que a seringa possa segurar a solução de sacarose sem qualquer gotejamento antes de configurar os gradientes.Adicione dois mililitros de sacarose a 7% ao fundo de cada tubo de centrífuga. Em seguida, adicione dois mililitros de sacarose a 17% abaixo da solução a 7%, posicionando a ponta da agulha nas imediações do fundo do tubo. Dispense a solução com cuidado e lentamente.Repita o procedimento com dois mililitros cada uma das soluções de 27, 37 e 47% de sacarose, garantindo que cada camada seja distinguível da outra por uma linha que marque a separação das densidades. Armazene os gradientes a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que eles se instalem em uma porcentagem contínua e crescente de sacarose. Após o crescimento e colheita de leveduras, as células de Saccharomyces cerevisiae, ressuspendem as células em 700 microlitros refrigerados de tampão de extração de polissomos.Adicione 100 unidades de inibidor de RNAse. Em seguida, adicione 400 microlitros de contas de vidro pré-refrigeradas com um tamanho aproximado de 425 a 600 mícrons. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com as contas de vidro e interrompa as células de levedura por agitação vigorosa em um batedor de contas por cinco minutos.Depois de interromper as células, esclareça o lisado por centrifugação. Determine a concentração do RNA no lisado clarificado medindo a absorbância a 260 nanômetros, usando um sistema de detecção de RNA baseado em fluorescência. Certifique-se de que a concentração de RNA é de 0,5 a um micrograma por microlitro.Se a concentração de RNA for muito baixa, reduza o volume de tampão de extração usado para ressuspender as células. Carregue cuidadosamente o lisado na parte superior dos gradientes. Coloque a ponta da pipeta contra a parede interna na parte superior do tubo de polipropileno.Incline o tubo e dispense lentamente o lisado no topo do gradiente, pingando contra a parede. Coloque suavemente os tubos nos baldes pré-resfriados de um rotor de balde oscilante e centrifugar os gradientes. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da caçamba oscilante e coloque-os em um suporte de tubo.Rotule as placas de 96 poços para armazenar as frações e pré-resfrie no gelo. Colete frações de 100 ou 200 microlitros a partir do topo do gradiente, inserindo cuidadosamente uma ponta de pipeta na parte superior do gradiente e coletando as frações até que todo o gradiente seja alíquotado. Medir a absorvância de cada fração a 254 nanômetros com um espectrofotômetro contra as soluções de 7 e 47% de sacarose em branco.Crie o perfil de polissomo plotando o número de frações versus a absorvência. Três perfis de polissomas representativos da levedura S.Cerevisiae, são mostrados. A crista de cada subunidade ribossomal e pico de polissomo é aparente em cada perfil.Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado aqui. Este perfil foi produzido a partir de um perfil de absorbância contínua à medida que o gradiente de sacarose era deslocado de baixo para cima por uma solução de perseguição, através de uma célula de fluxo detectora e coletado em frações. O perfil de polissomo gerado pelo fracionamento manual de amostras de 200 e 100 microlitros é mostrado aqui.A coisa mais importante a lembrar com este procedimento é não interromper os gradientes. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar ou interromper o gradiente dispensando a solução muito rapidamente. Após este procedimento, o RNA pode ser extraído dos gradientes para análise adicional para determinar mRNAs que estão se associando a ribossomos ativos

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

O protocolo aqui apresentado envolve o perfil polissômico para isolar translatome, mRNAs associados a ribossomos, em RNAs não polissomais e polissomais de Arabidopsis por meio de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. Este método demonstra a eficiência de tradução de Arabidopsis estressada pelo calor.

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Aprenda a gerar perfis de polissomas sem sistemas automatizados de fracionamento de gradiente. Este método manual permite analisar a atividade ribossomal em células de Saccharomyces cerevisiae com precisão.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

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