Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento
June 1st, 2021
Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.
Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo que revela detalhes moleculares sobre a atividade dos ribossomos dentro da célula. Essa técnica permite que os usuários obtenham as informações valiosas fornecidas por um perfil de polissomos, que não têm acesso a sistemas automatizados de fracionamento de gradiente. Tome seu tempo ao preparar os gradientes e armazene os gradientes em um local onde eles não serão interrompidos por um compressor ou outras operações mecânicas à medida que se estabelecem em um gradiente linear.
Para começar, preparar soluções-estoque de 7 e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose. Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 mícron. Preparar 14 mililitros de soluções de 17, 27% e 37% de sacarose, dispensando e misturando as soluções de estoque de 7 e 47%.
Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno em um rack de tubo de ensaio de visão completa. Certifique-se de que há espaço suficiente entre os tubos para que as ações com um tubo não perturbem os outros. Anexe uma agulha de nove polegadas, calibre 22 com uma ponta romba a uma seringa de três mililitros e execute um enchimento e dispense de teste para garantir que a seringa possa segurar a solução de sacarose sem qualquer gotejamento antes de configurar os gradientes.
Adicione dois mililitros de sacarose a 7% ao fundo de cada tubo de centrífuga. Em seguida, adicione dois mililitros de sacarose a 17% abaixo da solução a 7%, posicionando a ponta da agulha nas imediações do fundo do tubo. Dispense a solução com cuidado e lentamente.
Repita o procedimento com dois mililitros cada uma das soluções de 27, 37 e 47% de sacarose, garantindo que cada camada seja distinguível da outra por uma linha que marque a separação das densidades. Armazene os gradientes a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que eles se instalem em uma porcentagem contínua e crescente de sacarose. Após o crescimento e colheita de leveduras, as células de Saccharomyces cerevisiae, ressuspendem as células em 700 microlitros refrigerados de tampão de extração de polissomos.
Adicione 100 unidades de inibidor de RNAse. Em seguida, adicione 400 microlitros de contas de vidro pré-refrigeradas com um tamanho aproximado de 425 a 600 mícrons. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com as contas de vidro e interrompa as células de levedura por agitação vigorosa em um batedor de contas por cinco minutos.
Depois de interromper as células, esclareça o lisado por centrifugação. Determine a concentração do RNA no lisado clarificado medindo a absorbância a 260 nanômetros, usando um sistema de detecção de RNA baseado em fluorescência. Certifique-se de que a concentração de RNA é de 0,5 a um micrograma por microlitro.
Se a concentração de RNA for muito baixa, reduza o volume de tampão de extração usado para ressuspender as células. Carregue cuidadosamente o lisado na parte superior dos gradientes. Coloque a ponta da pipeta contra a parede interna na parte superior do tubo de polipropileno.
Incline o tubo e dispense lentamente o lisado no topo do gradiente, pingando contra a parede. Coloque suavemente os tubos nos baldes pré-resfriados de um rotor de balde oscilante e centrifugar os gradientes. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da caçamba oscilante e coloque-os em um suporte de tubo.
Rotule as placas de 96 poços para armazenar as frações e pré-resfrie no gelo. Colete frações de 100 ou 200 microlitros a partir do topo do gradiente, inserindo cuidadosamente uma ponta de pipeta na parte superior do gradiente e coletando as frações até que todo o gradiente seja alíquotado. Medir a absorvância de cada fração a 254 nanômetros com um espectrofotômetro contra as soluções de 7 e 47% de sacarose em branco.
Crie o perfil de polissomo plotando o número de frações versus a absorvência. Três perfis de polissomas representativos da levedura S.Cerevisiae, são mostrados. A crista de cada subunidade ribossomal e pico de polissomo é aparente em cada perfil.
Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado aqui. Este perfil foi produzido a partir de um perfil de absorbância contínua à medida que o gradiente de sacarose era deslocado de baixo para cima por uma solução de perseguição, através de uma célula de fluxo detectora e coletado em frações. O perfil de polissomo gerado pelo fracionamento manual de amostras de 200 e 100 microlitros é mostrado aqui.
A coisa mais importante a lembrar com este procedimento é não interromper os gradientes. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar ou interromper o gradiente dispensando a solução muito rapidamente. Após este procedimento, o RNA pode ser extraído dos gradientes para análise adicional para determinar mRNAs que estão se associando a ribossomos ativos
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Visão Geral
Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo que revela detalhes moleculares sobre a atividade dos ribossomos dentro da célula. Esta técnica permite aos usuários obter informações valiosas sem sistemas automatizados de fracionamento de gradiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
Fundo
- O perfil de polissomo é crucial para entender a atividade ribossômica.
- Fornece insights sobre tradução e expressão gênica.
- Sistemas automatizados nem sempre são acessíveis aos pesquisadores.
- Este protocolo oferece um método alternativo para preparação de gradiente.
Propósito do Estudo
- Fornecer um método detalhado para gerar perfis de polissomo.
- Facilitar a análise da atividade ribossômica em vários ambientes de pesquisa.
- Permitir que pesquisadores sem sistemas automatizados realizem esta análise.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções de gradiente de sacarose.
- Filtragem de soluções estoque de sacarose.
- Mistura gradual de diferentes concentrações de sacarose.
- Armazenamento cuidadoso dos gradientes para manter a estabilidade.
Principais Resultados
- Geração bem-sucedida de um gradiente linear de sacarose.
- Capacidade de analisar a atividade ribossômica sem sistemas automatizados.
- Fornecimento de um método confiável para perfil de polissomo.
- Insights sobre os mecanismos moleculares de tradução.
Conclusões
- Este protocolo é um recurso valioso para pesquisadores.
- Democratiza o acesso às técnicas de perfil de polissomo.
- Estudos adicionais podem se basear neste método para várias aplicações.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Polysome profiling enables mechanistic de-risking of target validation by revealing translational activity of specific mRNAs, supporting predictive confidence in early discovery. This protocol provides a cost-effective, reproducible method for generating ribosome profiles using standard laboratory equipment, expanding access to translational biomarker analysis in resource-constrained settings. It supports workflow positioning from hypothesis testing to lead identification by enabling quantitative assessment of ribosomal engagement without reliance on expensive fractionation systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying mRNAs actively engaged with ribosomes under experimental conditions.
- Operational Value: Enable functional target validation through direct measurement of translational output in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Support portfolio triage by correlating polysome shifts with pathway modulation and target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline translational profiles.
- Reproducibility: Generate consistent sucrose gradients without specialized equipment, ensuring reliable fractionation for comparative analysis.
- Quantitative Output: Measure absorbance at 254 nm to produce quantifiable polysome profiles enabling hit validation and dose-response assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Adapt the protocol to various cell types to study translational dysregulation in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Link target modulation to changes in ribosome profiling, reducing ambiguity in mechanism of action.
- Translational Continuity: Support biomarker alignment by extracting RNA from fractions to identify mRNAs associated with active ribosomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling ribosome profiling as a functional readout prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing which transcripts are translationally active, clarifying pathway involvement beyond transcriptional changes.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible gradient generation, allowing reliable comparison of compound effects on translational output.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (absorbance at 254 nm) that allow teams to compare ribosomal engagement across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling extraction of polysome-associated RNA for further analysis of translationally regulated biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for ribosomal activity analysis across projects, reducing dependency on centralized core facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct measurement of translational activity, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of gradient preparation using accessible laboratory equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement at the translational level.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on polysome profiling data, reducing late-stage biological risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in gradient preparation and careful handling to avoid disruption of sucrose layers.
- Needs access to swinging bucket rotor, spectrophotometer, and bead-beater for lysate preparation.
- Demands cross-team standardization in fraction collection and absorbance measurement protocols.
- Requires adaptation considerations when applying to mammalian or plant cell types due to differences in lysis and polysome stability.
- Practical limitation: Manual fractionation is lower throughput than automated systems, suited for validation rather than high-volume screening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Preparation of 7 to 47% Sucrose Gradients
2:14
Preparation of Yeast Cell Extracts
3:21
Centrifugation of Gradients
3:49
Fraction and Data Collection
4:36
Results: Polysome Profiling Without Gradient Makers or Fractionation Systems
5:19
Conclusion
