Name: Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a bioimpressão 3D de astrócitos corticais de murinos para engenharia de tecido neural. Este método permite criar modelos in vitro que simulam características bioquímicas e mecânicas dos tecidos, auxiliando no estudo de doenças neurológicas.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), números de bolsas 2018/23039-3 e 2018/12605-8; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), números de bolsas 465656/2014-5 e 309679/2018-4; e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), código financeiro 001.

Todos os procedimentos envolvendo animais seguiram diretrizes internacionais para uso de animais em pesquisa (http://www.iclas.org) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019/9292090519).
1. Dissecção cerebral de camundongos
<ol><li>Transfira 10 mL de solução de sal tampão hanks frio (HBSS) para um prato de cultura de 100 mm e 1 mL para um microtubo de 1,5 mL. Prepare um microtubo por animal. NOTA: Tanto o prato de cultura quanto o microtubo precisam ser mantidos no gelo.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura dos astrócitos utilizando DMEM F12 + 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), 2% glutamina e 1% Penicilina-Estreptomicina (P/S). Esterilize o meio filtrando usando um filtro de 0,2 μm.</li>
	<li>Euthanize filhotes de camundongos C57Bl/6 (pós-natal dia 1) por decapitação usando uma tesoura de operação afiada. Usando fórceps, puxe a pele e exponha o crânio. Certifique-se de que tanto a tesoura quanto as fórceps estão esterilizadas com 70% de etanol.</li>
	<li>Corte o crânio do forame magnum até o topo da cabeça ao longo do plano sagital usando uma tesoura de ponta curva afiada. NOTA: Certifique-se de que o tecido encefálico não está danificado.</li>
	<li>Usando uma espátula previamente esterilizada com etanol 70%, levante o cérebro da cavidade craniana e coloque-o no prato de cultura contendo 10 mL de HBSS frio.</li>
	<li>Coloque o prato de cultura contendo o cérebro sob o estereóscópio, e usando dois fórceps de ponta sem corte, remova as meninges do cérebro(Figura 1).</li>
	<li>Separe os cortices do resto do cérebro, enrolando-os suavemente para longe da linha mediana do cérebro usando uma espátula.</li>
	<li>Colete os dois cortices e transfira-os imediatamente para o mesmo microtubo contendo 1 mL de HBSS frio.</li>
</ol>2. Isolamento e cultura de astrócitos
<ol><li>Sob o fluxo laminar, corte o tecido cortical em pequenos pedaços usando uma micro tesoura curvada, e lave-os com 1 mL de HBSS por tubulação para cima e para baixo 3x. Espere o tecido se acalmar. Remova o HBSS e adicione HBSS fresco, repetindo o processo mais duas vezes.</li>
	<li>Retire o HBSS e incuba o tecido com 1 mL de trippsina de 0,05% a 37 °C por 5 min. NOTA: Apenas a digestão de trippsina é suficiente neste momento.</li>
	<li>Dissociar mecanicamente o tecido, encanar suavemente para cima e para baixo 15x. NOTA: A dissociação completa do tecido é observada pelo aumento da turbidez da suspensão e pela ausência de grandes fragmentos de tecido na suspensão.</li>
	<li>Transfira a solução para um tubo cônico de 15 mL, neutralize a atividade de trippsina adicionando um volume igual de FBS e transfira a solução em um filtro de filtro de filtro de célula de 0,4 μm para remover fragmentos não dissociados.</li>
	<li>Lave o filtro com 1 mL de meio de astrócitos, colete a suspensão celular que passou pelo coador e centrífugue por 5 min a 200 x g e 25 °C. Após a centrifugação, descarte o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL de meio de cultura de astrócitos.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura T25, compor o volume do médio para 3,5 mL e incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Certifique-se de que depois de 24 horas, as células são aderentes. Em seguida, substitua o meio e troque-o a cada 3 dias.</li>
	<li>Após 7 dias, remova microglia e oligodendrócitos da cultura lavando as células com 2 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Substitua a solução PBS pelo meio de cultura de astrócitos e deixe o frasco de cultura em um agitador orbital a 180 rpm durante a noite. NOTA: Os astrócitos formam uma monocamada confluente em aproximadamente 10-12 dias de cultura.</li>
</ol>3. Síntese de gelatina methacryloyl (GelMA)
<ol><li>Pese 10 g de gelatina obtida da pele suína e dissolva em 100 mL de PBS deixando a solução mexer em uma placa de aquecimento a 240 rpm e 50 °C até a dissolução completa.</li>
	<li>Sob um capô, adicione 2 mL de anidrido de metacríclico (MA) para um baixo grau de funcionalização, e deixe a emulsão de gelatina mexer a 240 rpm e 50 °C por 2h. ATENÇÃO: Declaração de risco ma: H302 + H332 (prejudicial se engolido ou inalado), H311 (tóxico em contato com a pele), 314 (causa queimaduras graves na pele e danos oculares), 315 (causa irritação na pele), H317 (pode causar reação alérgica à pele), H318 (causa danos oculares graves), 331 (tóxico se inalado), H332 (prejudicial se inalado), H335 (pode causar irritação respiratória). Orientações de manuseio: P261 (evite respirar poeira/vapor/gás/névoa/vapores/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (IF IN EYES: Enxágue com cautela com água por vários minutos. Remova as lentes de contato, se estiver presente e fácil de fazer. Ligue imediatamente para um CENTRO/MÉDICO DE VENENO), P301 + P312 + P330 (SE ENGOLIDO: Ligue para um CENTRO/médico de veneno se você se sentir mal. Enxágüe a boca). NOTA: Adicione MA muito lentamente, gota a gota.</li>
	<li>Diluir a solução gelatin-MA em 100 mL de PBS pré-aquecido (50 °C) para obter 200 mL de volume final e deixar a solução mexer a 240 rpm e 50 °C por 10 min.</li>
	<li>Corte ~20 cm de membrana de diálise (corte molecular de 12-14 kDa) e mergulhe-a em água deionizada até ficar macia. NOTA: Encha as membranas com água desionizada para certificar-se de que não há orifícios ou defeitos.</li>
	<li>Usando um funil, transfira a solução gelatina-MA para as membranas. NOTA: Feche ambos os lados deixando espaço extra dentro para permitir a mistura.</li>
	<li>Coloque as membranas que contêm a solução gelatina-MA em um recipiente com 2 L de água destilada para diálise, deixando-as mexer a 40 °C por 5 dias (500 rpm). NOTA: Cubra o recipiente para evitar a evaporação da água.</li>
	<li>Troque a água destilada duas vezes por dia. Cada vez, vire as membranas de cabeça para baixo para homogeneizar.</li>
	<li>No quinto dia, misture 200 mL de água ultrauso pré-aquecido (40 °C) à gelatina dialisada-MA, e deixe mexer por 15 min a 40 °C.</li>
	<li>Transfira a solução gelatin-MA para tubos cônicos de 50 mL até 25 mL e deixe os tubos permanecerem a -80 °C por 2 dias. NOTA: Armazene os tubos horizontalmente para facilitar a liofilização.</li>
	<li>Lyophilize as soluções congeladas por 3-5 dias e armazene o GelMA liofilizado protegido da umidade.</li>
</ol>4. Preparação de bioink
NOTA: Para obter 1 mL de bioink, recomenda-se fabricar pelo menos 3 mL de solução biomaterial, pois pode haver perdas durante a filtragem.
<ol><li>Preparação da solução fibrinogênio<ol>
<li>Prepare a solução salina (NaCl 0,9%) em água deionizada e dissolva 10 mg de fibrinogênio do plasma bovino em 1 mL da solução salina para obter uma concentração de 10 mg/mL. NOTA: Como adsorbs fibrinogen para vidro, não use frascos de vidro para preparar a solução fibrinogênio.</li>
		<li>Deixe a solução em agitação a 37 °C até a dissolução completa da fibrinogênio. NOTA: Para dissolução de fibrinogênio, utilize um sistema rotativo colocado dentro de um forno a 37 °C. A agitação magnética (180 rpm) de fibrinogênio em uma placa quente a 37 °C também é adequada. Nesta condição, o fibrinênio de 10 mg/mL leva aproximadamente 40 minutos para dissolver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução gelatina/GelMA<ol>
<li>Pesar 0,12 g de gelatina e adicioná-la a 1,9 mL de PBS pré-aquecido (40 °C) para obter uma concentração final de 4% (w/v) gelatina. Vórtice para facilitar a dissolução.</li>
		<li>Mantenha a emulsão a 40 °C até a dissolução completa.</li>
		<li>Pese 0,06 g de GelMA liofphilizado e transfira para a solução de gelatina para obter uma concentração final de 2% (w/v) GelMA. Vórtice para facilitar a dissolução.</li>
		<li>Mantenha a solução a 40 °C até a dissolução completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de gelatina carregada de astrócitos/GelMA/bioink fibrinogen<ol>
<li>Pipeta 0,9 mL da solução fibrinogênio de 10 mg/mL e transferência para a solução gelatina/GelMA para obter uma concentração final de 3 mg/mL de fibrinogênio.</li>
		<li>Pese 0,015 g de fotoinitiador (PI) e transfira para a solução gelatina/GelMA/fibrinogênio para obter uma concentração final de 0,5% (w/v) PI. Misture a solução lançando o tubo para cima e para baixo e mantenha-o a 40 °C protegido da luz para evitar a degradação da PI. NOTA: Estoque de bioinque a 4 °C para máxima de 24 horas.</li>
		<li>Sob o fluxo laminar, filtre a solução usando um filtro de 0,2 μm em um tubo cônico estéril de 15 mL. NOTA: A solução de biomateriais deve estar em 37-40 °C para permitir a filtragem.</li>
		<li>Transfira 980 μL da solução biomaterial para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Diluir laminina em solução salina para obter uma solução de estoque de 100 μg/mL.</li>
		<li>Pipeta 20 μL de laminina e transferência para o tubo contendo o bioink para obter uma concentração final de 2 μg/mL laminina.</li>
		<li>Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo, evitando bolhas. Se alguma bolha persistir, centrifugar o tubo cônico a 200 x g por 2 min. Mantenha o bioink a 37 °C até misturar com as células.</li>
		<li>Trypsinize astrócitos primários com 0,05% de trippsina por 5 min. NOTA: Use astrócitos das passagens 1 a 3.</li>
		<li>Neutralizar a atividade de trippsina com FBS a uma proporção de 1:1 e transferir as células para um tubo cônico de 15 mL. Centrifusá-lo a 200 x g por 5 min.</li>
		<li>Conte as células e transfira 1 x 106 células para um tubo cônico diferente. Centrifusá-lo a 200 x g por 5 min.</li>
		<li>Remova o supernatante deixando um pequeno volume (~200 μL) para suspender a pelota celular, tocando suavemente a parte inferior do tubo cônico.</li>
		<li>Transfira 1 mL de solução de gelatina/GelMA/fibrinogênio para o tubo contendo as células e pipeta suavemente para cima e para baixo para homogeneizar, obtendo uma concentração final de 1 x 106 células/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparação da solução crosslinker
<ol><li>Reconstituição de trombina<ol>
<li>Prepare uma solução de estoque de trombina 100 U/mL em água desionizada estéril com albumina de soro bovino de 0,1% (w/v) (BSA) em um tubo cônico de 15 mL. Estoque em microtubos a -20 °C. NOTA: Como adsorbs de trombo ao vidro, não use frascos de vidro para preparar a solução de estoque ou armazenar as alíquotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução thrombin-CaCl2<ol>
<li>Pipeta 100 μL de solução de estoque de trombina e transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 8,9 mL de água deionizada estéril para obter uma concentração final de 1 U/mL de trombina.</li>
		<li>Prepare uma solução CaCl2 de 10% (w/v) em água desionizada e esterilize usando um filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Transfira 1,1 mL da solução cacl2 de 10% para o tubo cônico contendo trombina, a fim de obter uma razão final de 1:9 (CaCl2 para trombina). NOTA: Prepare a solução crosslinker no volume a ser utilizado no experimento, evitando o armazenamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bioink carregado de astrócitos bioimpressos com uma bioimpressora baseada em extrusão
<ol><li>Projeto do tecido neural<ol>
<li>Utilizando o código G: construa uma grade de 6 x 6 mm (forma quadrada) com 1 mm de distância entre cada linha bioimpressora no eixo X e Y, e 6 camadas no eixo Z (0,2 mm entre cada linha); definir a extrusão (E) para 0,01 mm, aumentando 0,001 mm em cada nova camada do eixo Z; e definir a velocidade de impressão (F) para 400 mm/min(Informações Suplementares).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioimpressora configurada<ol>
<li>Exponha a máquina à luz UV por 15 minutos e, em seguida, limpe-a com etanol 70%.</li>
		<li>Ligue a bioimpressora usando o interruptor de alimentação. Conecte a máquina ao computador através de um cabo USB. Abra o software de controle para conectá-lo ao bioimpressor e carregar o design do arquivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da seringa bioimpressora<ol>
<li>Transfira o bioink de gelatina/GelMA/fibrinogen carregado de astrócitos para uma seringa plástica de 5 mL usando uma pipeta de 1.000 μL. NOTA: Transfira lentamente para evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Conecte uma agulha estéril de 22 G à seringa. NOTA: Deixe a seringa a 4 °C por 2 minutos.</li>
		<li>Conecte a seringa ao cabeçoteiro bioimpressor e lave manualmente o bioink para remover as bolhas restantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioimpressão NOTA: A bioimpressão foi realizada fora do capô laminar.<ol>
<li>Coloque um prato de cultura de 35 mm na mesa bioimpressora e posicione a agulha 0,1 mm longe da superfície do prato de cultura para permitir o movimento da agulha. NOTA: Use um prato de cultura de 35 mm para cada bioimpressão.</li>
		<li>Pressione o botão Imprimir. </li>
		<li>Uma vez que a bioimpressão sobre, certifique-se de que a seringa se afasta do prato. Em seguida, feche o prato de cultura e prepare-se para o processo de crosslinking. NOTA: A bioimpressão de uma construção leva aproximadamente 1 min e 10 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crosslinking a construção bioimpressora e cultura<ol>
<li>Coloque o prato de cultura sob luz UV a 2 mW/cm2 para 2 x 60 s (para cima e para baixo) para o crosslinking gelma.</li>
		<li>Sob o fluxo laminar, transfira a construção bioimpressora para uma placa de 24 poços usando uma espátula estéril.</li>
		<li>Adicione 500 μL de solução thrombin/CaCl2 e deixe por 30 minutos para permitir a ligação cruzada de fibrinas.</li>
		<li>Remova a solução de crosslinking e lave a construção com 2 mL de PBS 1x. Em seguida, substitua o PBS por 1 mL de cultura de astrócitos médio e incubar a 37 °C e 5% de CO2. Troque o meio a cada 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Avaliação da viabilidade dos astrócitos
<ol><li>Viabilidade de astrócitos bioimpressas<ol>
<li>Transfira a construção bioimpressora para um prato de cultura de 35 mm usando uma espátula.</li>
		<li>Lave a construção com 1 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Deposite 100 μL do reagente Vivo/Morto sobre a construção e mantenha-o a 37 °C por 30 min, mantendo-o protegido da luz.</li>
		<li>Remova o reagente Vivo/Morto e lave o construto com 1 mL de PBS 1x.</li>
		<li>Transfira a amostra para um prato confocal usando uma espátula, e observe as células dentro do construto sob um microscópio confocal usando excitação de 488 e 570 nm para aquisição de imagens. NOTA: Use uma ampliação de 10x para uma visualização geral das células dentro da construção.</li>
		<li>Certifique-se de que a amostra está sentada plana. Se necessário, coloque uma mancha de cobertura sobre a amostra para aumentar o achatamento. NOTA: Durante a imagem, certifique-se de que o prato confocal está bem selado para evitar que a amostra seque.</li>
		<li>Calcule o número de viável (verde) e morto (vermelho) usando um software computacional.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Viabilidade da cultura de astrócitos 2D<ol>
<li>Semente 0,5 x 106 astrócitos (passagem 1-3) em um prato confocal de 35 mm, adicione astrócitos médios e incuba-los a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Quando as células estiverem confluentes, remova o meio de cultura e lave com 1 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Deposite 200 μL do reagente Vivo/Morto e mantenha o prato a 37 °C por 30 min, protegido da luz.</li>
		<li>Remova o reagente Vivo/Morto e lave as células com 1 mL de PBS 1x.</li>
		<li>Leve o prato para um microscópio confocal juntamente com uma câmera digital, e use excitação de 488 e 570 nm para aquisição de imagem.</li>
		<li>Calcule o número de viável (verde) e morto (vermelho) usando um software computacional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Imunostaining de astrócitos
<ol><li>Coloração ácida fibrilar gliana (GFAP) de astrócitos bioimpressos bioimpressos 3D NOTA: Para investigar a presença de outros marcadores celulares, altere o anticorpo primário de acordo.<ol>
<li>Retire o meio do poço e lave o construto com 1 mL de PBS 3x.</li>
		<li>Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) no PBS ao poço até que a construção esteja completamente coberta e deixe-a por 2h a 4 °C.</li>
		<li>Retire o PFA e lave o construto com 1 mL de PBS 3x. NOTA: Este procedimento pode ser pausado por vários meses se armazenado a 4 °C em PBS. Certifique-se de que a placa do poço está selada para evitar a evaporação do PBS.</li>
		<li>Trate a amostra com glicina 0,1 mol/L por 5 min.</li>
		<li>Lave com 1 mL de 1x PBS por 5 min.</li>
		<li>Permeabilize a amostra com PBS contendo 0,1% Triton X-100 e 10% FBS por 1 h a 25 °C sob agitação orbital.</li>
		<li>Incubar a construção com frango anti-GFAP (diluição de anticorpos primários 1:500) a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Aspire o anticorpo primário e lave a amostra com 1 mL de PBS por 5 minutos e 3 vezes. NOTA: O anticorpo primário pode ser reutilizado várias vezes quando armazenado a 4 °C.</li>
		<li>Incubar a amostra com fluor Alexa 488-conjugado anti-frango (diluição secundária de anticorpos 1:500) e 1 μg/mL DAPI por 1 h a 25 °C sob agitação orbital. NOTA: Mantenha a amostra protegida contra a luz.</li>
		<li>Lave a amostra com 1 mL de PBS por 5 min, 3 vezes.</li>
		<li>Transfira a construção para um prato confocal de 35 mm. NOTA: Certifique-se de que o prato está bem lacrado para evitar que a amostra seque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração ácida fibrilar gliana (GFAP) da cultura de astrócitos 2D<ol>
<li>Semente 0,5 x 106 astrócitos (passagem 1-3) em um prato confocal de 35 mm, adicione astrócitos médios e incuba-los a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Quando as células estiverem confluentes, remova o meio de cultura e lave-as com 1 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Repetição de passos 8.1.2-8.1.10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração de citrócitos de citoesqueleto<ol>
<li>Repetição passos 8.1.1-8.1.6.</li>
		<li>Adicione 200 μL de 50 μg/mL de solução de faloidagem conjugada fluorescente em PBS e 1 μg/mL de DAPI sobre a construção.</li>
		<li>Incubar por 1h a 25 °C sob agitação orbital, mantendo a amostra protegida da luz.</li>
		<li>Lave a amostra com 1 mL de PBS por 5 min 3 vezes e transfira a construção para um prato confocal usando uma espátula. NOTA: Certifique-se de que o prato está bem lacrado para evitar que a amostra seque.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Imagem confocal
<ol><li>Leve os pratos para um microscópio confocal aliado a uma câmera digital para imagem (359, 488 e 570 nm de excitação).</li>
	<li>Use ampliação de 10x para uma visualização global e 40 ou 63x para imagens ampliadas de células. NOTA: Certifique-se de que a amostra está sentada plana. Se necessário, coloque uma mancha de cobertura sobre a amostra para aumentar o achatamento.</li>
</ol>

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<li>Ye, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+gelatin+methacrylate-based+nerve+guidance+conduits+with+multiple+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Design%22%5BJournal%5D)">3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels.</a> Materials and Design. 192, 108757(2020).</li>
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<li>Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+hydrogels+induce+mixed+dorsal%2Fventral+spinal+neuron+identities+during+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).</li>
<li>Arulmoli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+scaffolds+of+salmon+fibrin%2C+hyaluronic+acid%2C+and+laminin+for+human+neural+stem+cell+and+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).</li>
<li>Brenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GFAP+in+CNS+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience.+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of GFAP in CNS Injuries.</a> Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos para revelar.

A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma alternativa de biofabricação que permite a engenharia de construtos refinados que se assemelham estrutural e fisiologicamente aos tecidos nativos22, incluindo o cérebro23. A biofabricação de tecidos neurais permite a modelagem in vitro de microambientes nativos, sendo uma importante ferramenta para a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares associados ao desenvolvimento e tratamento de muitas doenças que afe...

Os astrócitos são o tipo celular mais abundante no Sistema Nervoso Central (SNC) e desempenham um papel fundamental na homeostase cerebral. Além do suporte neuronal duradouro, os astrócitos são responsáveis por modular a absorção de neurotransmissores, manter a integridade da barreira hematoencefálica e regular a sinapstogênese neuronal1,2. Os astrócitos também têm um papel essencial na inflamação do SNC, respondendo a lesões no cérebro em um processo que leva à reatividade astrocativa ou astrogliose reativa3,4, formando uma cicatriz gliar que impede a exposição saudável do tecido aos agentes degenerativos5. Este evento resulta em mudanças na expressão genética dos astrócitos, morfologia e função6,7. Portanto, estudos envolvendo a funcionalidade dos astrócitos são úteis para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos.
Modelos in vitro são cruciais para estudar mecanismos relacionados a lesões neurológicas, e embora o isolamento bem sucedido e a cultura bidimensional (2D) dos astrócitos cortical tenham sido estabelecidos8,este modelo não fornece um ambiente realista que imita o comportamento celular nativo e para reproduzir a complexidade do cérebro9 . Em condição 2D, o fraco suporte mecânico e bioquímico, as interações de células baixas e matriz celular e o achatamento celular, levando à ausência de polaridade basal-apical, afetam a dinâmica de sinalização celular e os desfechos experimentais levando à alteração da morfologia celular e expressão genética, que comprometem a resposta aos tratamentos10. Por isso, é fundamental desenvolver alternativas que proporcionem um ambiente neural mais realista, visando traduzir os resultados para a clínica.
A cultura celular tridimensional (3D) representa um modelo mais avançado que recapitula com características de fidelidade aumentadas de órgãos e tecidos, incluindo o CNS11. Em relação à cultura gliana, os modelos 3D contribuem para a manutenção da morfologia dos astrócitos, polaridade basal-apical celular e sinalização celular12,13. A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma poderosa ferramenta para biofabritor tecidos vivos 3D de forma controlada, usando células e biomateriais para recriar a estrutura e propriedades dos tecidos nativos. O uso dessa tecnologia levou a uma melhoria substancial da previsão de resultados e contribuiu para a medicina regenerativa aplicada ao CNS14,15,16.
O protocolo descrito aqui detalha o isolamento e a cultura dos astrócitos cortical. O protocolo também detalha um método reprodutível para bioimpressão de astrócitos embutidos em gelatina/gelatina methacryloyl (GelMA)/fibrinogen, complementado com laminina. Neste trabalho, uma bioimpressora baseada em extrusão foi usada para imprimir a composição biomaterial contendo astrócitos cortical a uma densidade de 1 x106 células/mL. O estresse da tesoura de bioimpressão foi minimizado pelo controle da velocidade de impressão, e os astrócitos apresentaram alta viabilidade após o processo. Construções bioimpressadas foram cultivadas por 1 semana, e os astrócitos foram capazes de se espalhar, anexar e sobreviver dentro do hidrogel, mantendo a morfologia astróctica e expressando um marcador específico de proteína ácida fibrilar (GFAP)4.
Este procedimento é compatível com bioimpressoras baseadas em extrusão orientadas por pistão e pode ser usado para bioimpressão de astrócitos derivados de diferentes fontes. O modelo bioimpresso 3D proposto aqui é adequado para uma ampla gama de aplicações de engenharia neural, como estudos dos mecanismos envolvidos na funcionalidade de astrócitos em tecidos saudáveis e compreensão da progressão de patologias neurológicas e desenvolvimento do tratamento.

<table><tbody><tr><td>Bioimpressora 3D</td> Soluções <td></td> de <td>biotecnologia 3D</td><td>Bioimpressora baseada em extrusão</td></tr><tr><td>Pinça de ponta romba</td><td>Integra Miltex</td><td>6--30</td><td>Fórceps para dissecção cerebral Albumina</td></tr><tr><td>de soro bovino</td> previamente esterilizada <td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Sem protease, sem ácidos graxos, essencialmente livre de globulina</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>156340</td><td>Frasco de cultura T25</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>Filtro de células 40 &micro; m</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>Confocal TCS SP8 microscopia acoplada a um sistema confocal Olympus FluoView 300</td></tr><tr><td>Tubos cônicos</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651, 339652</td><td>Tubos estéreis de 15 mL e 50 mL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab224589</td><td>Solução de coloração DAPI</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco; Corporação de Tecnologias de Vida</td><td>12500062</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. De Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) com L-glutamina</td></tr><tr><td>Tubo de Dyalisis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Corte de peso molecular = 14 kDa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-15-5</td><td>Grau reagente</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12657011</td><td>Fibrinogênio de Grau de Pesquisa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-32-5</td><td>Fibrinogênio cristalino em pó de plasma bovino</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td>Gelatina em pó de pele suína</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-40-6</td><td>Glicina em pó</td></tr><tr><td>Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>14175095</td><td>Sem cálcio, sem magnésio, sem fenol vermelho</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-85-9</td><td>L-Glutamina pó cristalino</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td>Laminina 1-2 mg/mL L em 50 mM Tris-HCl</td></tr><tr><td>Kit de imagem de células mortas</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37601</td><td>Fluorescência verde em células vivas (ex/em 488 nm/515 nm). Fluorescência vermelha em células mortas (ex/em 570 nm/602 nm)</td></tr><tr><td>Anidrido metacrílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>760-93-0</td><td>Para preparação de GelMA</td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Corning Incorporated</td><td>MCT-150-C</td><td>Microtubos de 1,5 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Agulha Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>22G</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1362045</td><td>Agulha romba estéril</td></tr><tr><td>Operação tesoura</td><td>Integra Miltex</td><td>05--02</td><td>Tesoura afiada para dissecção cerebral previamente esterilizada</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldeído em pó</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15070063</td><td>Estreptococos para caneta (5.000 unidades/ mL de penicilina; 5.000 ug/mL de estreptomicina)</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Corning Incorporated</td><td>430591, 430588</td><td>Placas de Petri estéreis de 35 e 100 mm</td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>iFluor 488 reagente</td></tr><tr><td>Fotoiniciador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106797-53-9</td><td>2-Hidroxi-4&prime;-(2-hidroxietoxi)-2- metilpropiofenona</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina (PBS)</td> <td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>10010023</td><td>PBS 1 x, grau de cultura, sem cálcio, sem magnésio</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Hidrobrometo de poli-L-lisina mol peso 30,000-70,000</td></tr><tr><td>Antocorpo primário</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>Frango policlonal para GFAP</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td>Alexa fluor 594 anti-frango</td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Miltex</td><td>V973-70</td><td>Espátula de cimento número 24 previamente esterilizada</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>3000038</td><td>Microscópio para dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Seringa 5 mL</td><td>BD</td><td>1222C84</td><td>Seringa estéril</td></tr><tr><td>Filtro de seringa 2 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-105</td><td>Filtro de polipropileno para esterilização</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002--04-4</td><td>Trombina cristalina em pó de plasma bovino</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td> Gibco de grau laboratorial<td>; Life Technologies Corporation</td><td>15400054</td><td>Tripsina sem vermelho de fenol 1 x diluído em solução PBS</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15040066</td><td>Versene Solution (0,48 mM) formulado como 0,2 g EDTA (Na4) por litro de PBS Placa de</td></tr><tr><td>poço</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td>Placa estéril de 24 poços</td></tr></tbody></table>

bioimpressão 3d de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Os astrócitos são células gliais com um papel essencial no sistema nervoso central (SNC), incluindo suporte neuronal e funcionalidade. Essas células também respondem a lesões neurais e agem para proteger o tecido de eventos degenerativos. Estudos in vitro da funcionalidade dos astrócitos são importantes para elucidar os mecanismos envolvidos nesses eventos e contribuir para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos. Este protocolo descreve um método para biofabricar uma estrutura de tecido neural rica em astrócitos por bioimizades 3D carregados de astrócitos. Uma bioimpressora 3D baseada em extrusão foi usada neste trabalho, e os astrócitos foram extraídos dos cortices cerebrais dos filhotes de C57Bl/6. O bioink foi preparado pela mistura de astrócitos cortical de até a passagem 3 para uma solução biomaterial composta de gelatina, gelatina-methacryloyl (GelMA) e fibrinogênio, complementado com laminina, que apresentava condições ótimas de bioimpressão. As condições de bioimpressão 3D minimizaram o estresse celular, contribuindo para a alta viabilidade dos astrócitos durante o processo, em que 74,08% ± 1,33% das células eram viáveis logo após a bioimpressão. Após 1 semana de incubação, a viabilidade dos astrócitos aumentou significativamente para 83,54% ± 3,00%, indicando que o construto 3D representa um microambiente adequado para o crescimento celular. A composição do biomatélmico permitiu o apego celular e estimulou o comportamento astrócito, com células expressando os astrócitos específicos marcador de proteína ácida fibrilar glicial (GFAP) e possuindo morfologia astróctica típica. Este protocolo reprodutível fornece um método valioso para biofabricar tecido neural 3D rico em astrócitos que se assemelha ao microambiente nativo das células, útil para pesquisadores que visam entender a funcionalidade dos astrócitos e sua relação com os mecanismos envolvidos em doenças neurológicas.

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um tecido neural usando a tecnologia de bioimpressão 3D para depositar gelatina carregada de astrócitos primários de camada por camada/GelMA/fibrinogen bioink. Os astrócitos foram extraídos e isolados do córtex cerebral de filhotes de camundongos(Figura 1),adicionados a uma composição biomaterial, permitindo a biofabricação de uma construção 3D viva.
O design auxiliado por computador (CAD) foi desenvolvido utilizando-se...

Aqui relatamos um método de bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para biofabricagem de tecidos neurais para estudar a funcionalidade dos astrócitos no sistema nervoso central e os mecanismos que envolvem células gliais em doenças neurológicas e tratamentos.

Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

A bioimpressão 3D de astrócitos representa um avanço na engenharia de tecidos neurológicos, permitindo a biofabariação de modelos in vitro que são úteis para entender os mecanismos envolvidos em doenças neurológicas. A principal vantagem da bioimpressão 3D é biofabritar estruturas adjuntas celulares que imitam as características bioquímicas e mecânicas dos tecidos, proporcionando uma melhor compreensão da dinâmica celular em saúde e doenças. Este protocolo pode ser aplicado à biofabização de outros tecidos moles, pois é baseado na bioimpressão 3D de uma bioind tinta composta de polímeros naturais e componentes de matriz extracelular.Para começar, corte o tecido cortical isolado do rato eutanizado em pequenos pedaços com uma micro tesoura curvada. Lave os pedaços de tecido três vezes com um mililitro de HBSS, encanar para cima e para baixo. Depois de remover o HBSS adicionado pela terceira vez, adicione um mililitro de 0,05% de trippsina e incuba o tecido por cinco minutos a 37 graus Celsius.Para dissociação de tecido mecânico, pipeta suavemente a mistura de trippsina tecidual para cima e para baixo 15 vezes. Em seguida, transfira a mistura dissociada para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione um volume igual de FBS para neutralizar a atividade de trippsina. Filtre a suspensão através de um filtro de coador de células de 0,4 micrômetros para remover fragmentos não dissociados.Lave o filtro com um mililitro de meio de astrócito. Pelota para baixo a suspensão celular filtrada por centrifugação. Depois de descartar o supernatante, suspenda a pelota celular em um mililitro do meio de cultura de astrócitos.Transfira a suspensão da célula para um frasco de cultura T25. Compõem o volume médio total de 3,5 mililitros e incubam as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para obter o fibrinogênio na concentração final de três miligramas por mililitro, transfira 0,9 mililitros de 10 miligramas por solução de fibrinogeniliter para a solução de methacryloyl gelatina-gelatina.Para obter o iniciador fotográfico na concentração final de 0,5% de peso em volume, adicione 0,015 gramas de iniciador fotográfico à solução preparada de fibrinogen de gelatina-gelatina. Após o vórtice, mantenha a solução a 40 graus Celsius, protegida da luz para evitar a degradação do PI. Em seguida, filtre a solução através de um filtro de 0,2 micrômetros em um tubo cônico estéril de 15 mililitros.Transfira 980 microliters da solução biomaterial para um tubo cônico de 15 mililitros. Para obter a laminina na concentração final de dois microgramas por mililitro, adicione 20 microliters de laminina diluída ao tubo contendo biointa. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo, evitando bolhas e mantenha a solução de bio tinta a 37 graus Celsius até ficar pronta para se misturar com as células.Trypsinize os astrócitos primários com 0,05% de trippsina por 5 minutos e neutralize a atividade de trippsina com FPS em uma proporção de um para um. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos. Após contar as células, transfira 1 vezes 10 para as 6 células para um tubo cônico diferente e centrífuga como demonstrado.Deixe apenas 200 microlitres do supernatante no tubo e suspenda a pelota celular tocando suavemente o fundo do tubo cônico. Para obter uma concentração final de 1 vezes 10 a 6 células por mililitro, transfira um mililitro de solução de fibrinogen de gelatina-gelatina para o tubo contendo as células e homogeneize-se gentilmente tubos para cima e para baixo. Use uma pipeta de 1000 microliter para transferir lentamente os astrócitos colocados em gelatina-gelatina fibrinogen biobrinogen bio-ink solução para uma seringa plástica de cinco mililitros, evitando a formação de bolhas.Conecte uma agulha cega estéril de calibre 22 à seringa. Exponha a bioimpressora à luz UV por 15 minutos e, em seguida, limpe a bioimpressora com 70% de etanol, em seguida, conecte a seringa à cabeça de impressão bioimpressora e lave manualmente a tinta biológica para remover as bolhas restantes. Para realizar a bioimpressão, coloque em um prato de cultura de 35 milímetros na mesa bioimpressora, posicione a agulha a 0,1 milímetros da superfície do prato de cultura para permitir o movimento da agulha e pressione o botão Imprimir".Uma vez que a bioimpressão acabou, certifique-se de que a seringa se afasta do prato e feche o prato de cultura. Coloque o prato de cultura sob luz UV para gelatina methacryloyl cross-linking. Use uma espátula estéril para transferir a construção bioimpressora para uma placa de 24 poços.Adicione 500 microliters de solução de cloreto de cálcio de trombina e deixe por 30 minutos para permitir a ligação cruzada de fibrinas. Depois de remover a solução de ligação cruzada, lave a construção com dois mililitros de PBS e substitua o PBS por um mililitro de meio de cultura de astrócitos. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e alterar o meio a cada três dias.Use uma espátula para transferir a construção bioimpressora para um prato de cultura de 35 milímetros. Lave a construção com um mililitro de PBS. Deposite 100 microlitres do reagente morto vivo sobre a construção e mantenha-o a 37 graus Celsius por 30 minutos, mantendo-o protegido da luz.Depois de remover o reagente morto vivo, lave a construção com PBS como demonstrado. Transfira a amostra para um prato confocal e observe as células dentro do construto sob um microscópio confocal usando excitação de 488 e 570 nanômetros para aquisição de imagem. Após a bioimpressão 3D, a integridade do andaime bioimpresso foi estimada e a formação de uma estrutura bem definida foi observada com células presas dentro do biomamaterial.Após a bioimpressão e os processos de ligação cruzada, a maioria das células apresentava morfologia redonda quando a construção era incubada com um meio de astrócito. Os andaimes bioimpressos mantiveram a integridade após sete dias de incubação, e embora algumas células redondas tenham sido observadas, muitos astrócitos se espalharam por toda a construção, apresentando morfologia astróctica e interconexão. A viabilidade celular foi avaliada logo após a bioimpressão e os resultados mostraram que, na velocidade mais baixa, as células viáveis representavam até 74% do total das células, sendo significativamente maiores do que as células bioimpressionadas em maior velocidade.A viabilidade dos astrócitos bioimpressados foi normalizada para astrócitos cultivados em 2D e os resultados indicaram que, no sétimo dia, os astrócitos bioimpressos tiveram significativamente maior viabilidade. Imediatamente após a bioimpressão, os astrócitos mostraram morfologia redonda e ensaio morto vivo. Após uma semana, os astrócitos se espalharam por toda a construção e apresentaram uma morfologia distinta das células, idêntica à cultura 2D.Os astrócitos bioimpressados 3D foram caracterizados por imunofluorescência. Após sete dias de incubação na construção bioimpressora, foram observados astrócitos altamente densos com uma morfologia semelhante a uma estrela. As células astrócitos bioimpressas expressas os astrócitos específicos marcador gliais fibrillary acidic protein indica retenção de fenótipo astrócito após sete dias de bioimpressão, e esses resultados indicam que a composição da bioinkina forneceu um microambiente biocompatível para promover a adesão, disseminação e crescimento dos astrócitos.A avaliação de genes específicos e marcadores celulares expressados pelos astrócitos bioimpressas forneceria evidências da função neuro tecido, como a reatividade do astrocito após estímulos específicos. Este protocolo abre caminho para a biofabização de estruturas neurogênicas mais complexas compostas de diferentes tipos de células em biomoléculas, permitindo a imitação de nichos neurogênicos específicos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra um método para gerar andaimes tridimensionais de astrócitos dentro de microcolunas de hidrogel. O interior das microcolunas é revestido com colágeno. São introduzidos astrócitos, que aderem ao colágeno e, com posterior incubação, se automontam em um andaime tridimensional.

Um método in vitro para gerar andaimes de astrócitos dentro de microcolunas de hidrogel

O vídeo demonstra o processo de criação de uma construção bioimpressa em 3D usando astrócitos suspensos em uma solução de bioink. A construção bioimpressa, após a reticulação, facilita a adesão dos astrócitos e sua disseminação, formando tecido semelhante a neurais.

Um método para bioimpressão 3D de astrócitos corticais murinos

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

A percepção das ações complexas do cérebro requer ferramentas avançadas de pesquisa. Aqui, demonstramos um novo modelo de engenharia 3D baseado em colágeno de seda de tecido neural semelhante à arquitetura do cérebro. O modelo pode ser usado para estudar a montagem da rede neuronal, orientação axonal, interações célula-célula e atividade elétrica.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir coculturas bioimpressas em 3D de neurônios e astrócitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultura, gerado dentro de um arcabouço de hidrogel em formatos de 96 ou 384 poços, demonstra alta viabilidade pós-impressão e crescimento de neuritos em 7 dias e mostra a expressão de marcadores de maturidade para ambos os tipos celulares.

Bioimpressão Tridimensional de Coculturas Neurônio-Astrócitos Derivadas de iPSC Humanas para Aplicações de Triagem

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Métodos para criar tecidos tumorais 3D humanos como sistemas de teste são descritos. Estas tecnologias são baseadas num descelularizado Biológica vascularizada andaime (BioVaSc), células humanas primárias e uma linha de células tumorais, que podem ser cultivadas em condições estáticas, bem como sob condições dinâmicas de um bio-reactor de fluxo.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Aprenda a bioimpressão 3D de astrócitos corticais de murinos para engenharia de tecido neural. Este método permite criar modelos in vitro que simulam características bioquímicas e mecânicas dos tecidos, auxiliando no estudo de doenças neurológicas.

Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

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