Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

O método auxilia no estudo da sinalização mecânica das células da crista neural e sua interação com sinais químicos. Também pode ajudar nos mecanismos moleculares e genéticos do desenvolvimento da crista neural em doenças. Transferir os deslizamentos de tampa de vidro é o mais desafiador, por isso, transfira-os lentamente e atentamente para evitar quebrá-los e derrubá-los.

Demonstrando o procedimento, seremos eu e a Dra. Comece colocando o número desejado de deslizamentos de tampa de vidro em um pedaço de limpeza de laboratório. Em seguida, esterilize cada deslizamento de cobertura passando-o para frente e para trás através da chama do queimador de álcool.

Quando a tampa se esfriar, cubra o deslizamento de cobertura de 12 milímetros com aproximadamente 200 microliters e deslizamento de cobertura de 25 milímetros com 800 microliters de 0,1 hidróxido de sódio molar. Após cinco minutos, aspire hidróxido de sódio e deixe a tampa secar por cinco minutos para formar um filme uniforme. Uma vez que os deslizamentos de cobertura são secos, adicione aproximadamente 18 microliters de triexisilano aminopropil ou APTS em um deslizamento de cobertura de 12 milímetros e 150 microliters de APTS em um deslizamento de cobertura de 25 milímetros.

Acesso de acesso APTS para permitir que o APTS residual seque por cinco minutos. Mais tarde, enxágue os deslizamentos de cobertura três vezes submergindo-os em água deionizada estéril por cinco minutos cada vez. Mova os deslizes de cobertura lavadas para uma placa de Petri fresca com o lado reativo voltado para cima.

E trate os deslizamentos de cobertura encharcando bastante 0,5% glutaraldeído por 30 minutos. Depois de aspirar o glutaraldeído, enxágue os deslizamentos de cobertura uma vez com água desionizada por três minutos e seque o ar os deslizamentos de cobertura com o lado reativo para cima. Para preparar os deslizamentos de cobertura siliconizados, coloque o mesmo número de deslizamentos de cobertura como que a capa revestida de aminosilano desliza em uma placa de Petri forrada com para filme.

Em seguida, trate os deslizamentos de cobertura de 12 milímetros com 40 microliters e deslizamentos de cobertura de 25 milímetros com 150 microliters de siltano diclorometano ou DCMS por cinco minutos. Lave os deslizamentos de cobertura com água deionizada estéril uma vez por um minuto antes de colocar os deslizamentos de cobertura reativa de frente para cima em um lenço de laboratório. Para preparar os hidrogéis, pipeta recém-preparada solução de gel de acrilamida sobre os deslizamentos de cobertura revestidos de aminosilano secos.

Utilizando pinças curvas, transfira imediatamente o deslizamento de cobertura tratada DCMS em cima da solução de gel com o lado tratado tocando a solução de gel, assim, a solução de gel entre dois deslizamentos de cobertura. Uma vez que o gel seja polimerizado, separe o deslizamento de tampa tratada dcms com pinças curvas, deixando o gel preso ao deslizamento revestido de aminosilano. Em seguida, submergir o deslizamento de cobertura de 12 milímetros com o hidrogel anexado em uma placa pré-determinada de 4-well ou 24 poços coberto com 500 microliters de PBS estéril ou água desionizada e a cobertura de 25 milímetros em uma placa de 6 poços coberta com dois mililitros de PBS estéril ou água desionizada por 30 minutos.

Depois de remover a solução de acrilamida em excesso, armazene os hidrogéis em PBS estéreis ou água deionizada à temperatura ambiente por 30 minutos. Mais tarde, aspire PBS ou água deionizada da placa do poço antes de adicionar solução Sulfo-succinimydyl ou Sulfo-SUNPAH para cobrir o gel inteiramente. E coloque os géis com a solução sob uma luz ultravioleta de 15 watts e 365 nanômetros descoberta por 10 minutos.

Colete o máximo possível do Sulfo-SANPAH por solução inclinando a placa. E depois lave o gel duas a três vezes com HEPES de 15 milimões. Adicione 15 miligramas por mililitro Colágeno 1 diluído em ácido acético de 0,2% a cada poço contendo o hidrogel.

E incubar os géis durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, realize a lavagem como descrito no manuscrito antes de incubar os hidrogéis com PBS contendo 10% de serum de cavalo e 5%FBS a 37 Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após duas horas de incubação, adicione 500 microliters de DMEM filtrado estéril com 10% FBS e estreptomicina de penicilina de 1%a cada poço e armazene os géis a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Quando a cultura celular estiver pronta, a placa aproximadamente 1,5 vezes 10 a quarta células 09-1 por centímetro quadrado no meio bazell. Use pinças para transportar os deslizamentos de cobertura para uma nova placa para minimizar sinais falsos das células cultivadas diretamente na placa. Em seguida, fixar as células usando 500 microliters de 4% paraformaldeído por 10 minutos antes de tratar as células com 500 microliters de 0,1%Triton X-100 à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, caminhe pelas células com 250 microliters de 10% de soro de burro. Colora as células para F-actin com felodipina em uma diluição de 1 a 400 em 250 microliters de soro de burro de 10%, seguido de incubação com DAPI por 10 minutos. Lave as células com PBS por dois minutos antes de adicionar três a quatro gotas de meio de montagem para cada poço.

Em um microscópio de fluorescência, capture as imagens de pelo menos três quadros aleatórios por amostra de hidrogel produzindo canais individuais e mesclados. Na avaliação da rigidez do hidrogel através da microscopia da força atômica ou AFM, a inclinação da curva de força foi suave para hidrogéis macios, pois a força necessária da sonda AFM era menor. No entanto, em hidrogéis rígidos, a inclinação gerada era muito mais íngreme.

As medidas afm foram então utilizadas para calcular a rigidez média dos hidrogéis do módulo elástico de Young em quilopascals. As características de crescimento das células P19 e 09-1 foram observadas em um hidrogéis quilopascal e 40 kilopascals de sistemas de controle e gel modificado. As células 09-1 cultivadas nos sistemas originais de gel resultaram em um maior número de células mortas.

Em contraste, as células 09-1 cultivadas nos sistemas de gel modificados apresentaram crescimento celular saudável e apego suficiente ao substrato de hidrogéis com pequeno deck celular indicado por células redondas mínimas. As células P19 banhadas em ambos os sistemas de hidrogel apresentaram um excesso de células flutuantes redondas e a falta de anexos de substrato celular. A compatibilidade das células da crista neural ou NCCs com o sistema de hidrogel modificado foi avaliada por coloração imunofluorescente para AP-2.

Observou-se aumento significativo da expressão AP-2 em células 09-1 banhadas no sistema de hidrogel modificado. Além disso, as células 09-1 apresentaram diferentes morfologias baseadas nos hidrogéis de baixa ou alta rigidez através de quantidades variadas das fibras de estresse. A expressão anti-vinculina em células 09-1 cultivadas no hidrogel de 40 quilopascal foi maior do que aquelas cultivadas no hidrogel quilopascal refletindo que as células cultivadas em substratos mais suaves formam complexos mínimos de adição focal do que o substrato rígido.

O tempo de espera adequado é crucial para a polimerização dos hidrogéis, pois os acrilamidas são tóxicos para as células. Submergir os hidrogéis em PBS ou água desionizada por pelo menos 30 minutos para garantir melhores resultados.