Name: Implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprenda a implantar andaimes de colágeno tridimensional para regeneração hepática em modelo animal fibrotico. Este método promove restauração tecidual sem comprometer a função hepática.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem ao pessoal do Laboratório de Instalação Animal da Unidade experimental de Medicina, enfermeira Carolina Baños G. pelo apoio técnico e cirúrgico, Marco E. Gudiño Z. pelo apoio em microfotografias, e Erick Apo pelo apoio na histologia hepática. O Conselho Nacional apoiou esta pesquisa de Ciência e Tecnologia (CONACyT),o número de subvenção SALUD-2016-272579 e o PAPIIT-UNAM TA200515.

A presente pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina (DI/115/2015) da Universidade Nacional Autónoma de México (UNAM) e pelo comitê de ética do Hospital Geral do México (CI/314/15). A instituição cumpre todas as especificações técnicas para a produção, cuidado e uso de animais de laboratório e é legalmente certificada por lei nacional (NOM-062-ZOO-1999). Ratos Wistar machos pesando 150-250 g (6-8 semanas de idade) foram obtidos do Laboratório de Instalações Animais da Faculdade de Medicina da UNAM, para este estudo.
1. Obtenção de andaimes de matriz de colágeno a partir do fêmur bovino
<ol><li>Obtenha o condíle do fêmur bovino de um matadouro certificado pelas autoridades sanitárias e agrícolas do México.<ol>
<li>Disseca cuidadosamente a gordura, músculo e cartilagem com um instrumento cirúrgico. Corte os fragmentos de condíle em fragmentos de 3 cm x3 cm usando um cortador de serra e limpe a gordura e o sangue com uma toalha. Lave os fragmentos de condíle com água.</li>
		<li>Ferva (92 °C) os fragmentos com 1 L de detergente aniônico (10 g/L) por 30 min. Lave os fragmentos de condíle duas vezes para remover quaisquer restos do detergente aniônico.</li>
		<li>Seque os fragmentos de condíle por 3 h usando papel filtro (0,5 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare um triangular (1 cm x1 cm x1 cm) CMS de espessura 0,5 cm dos fragmentos mencionados na etapa 1.1 (Figura 1A).<ol>
<li>Desmineralize os fragmentos em 100 mL de 0,5 M HCl por 10 min com agitação constante. Remova o HCL. NOTA: Neutralizar o HCl com hidróxido de sódio (10 M).</li>
		<li>Enxágüe os fragmentos três vezes com 100 mL de água destilada, 15 min cada vez, com agitação constante. Seque o CMS com papel filtro (0,5 mm) por 1h.</li>
		<li>Use um microscópio estéreo15 para analisar as propriedades estruturais do CMS (tamanho dos poros, formação de poros e interconexão porosa)(Figura 1B).</li>
		<li>Use um microscópio eletrônico de varredura16 para analisar a superfície áspera da trabecula cms(Figura 1C).</li>
		<li>Utilize o instrumento de dissecção para mistura e alongamento para avaliar as alterações mecânicas (plasticidade e flexibilidade) do CMS(Figura 1D).</li>
		<li>Embale o CMS na bolsa de esterilização e esterilize-o com plasma de peróxido de hidrogênio por 38 minutos. Armazene o CMS estéril na embalagem original em uma área seca a 20-25 °C até usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação da área cirúrgica e manuseio e preparação do modelo animal
<ol><li>Higienize a área cirúrgica, mesa de trabalho, microscópio de microcirurgia e assento com solução de clorexidina de 2%. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, esponja cirúrgica, cotonetes e cortina cirúrgica descartável através da esterilização térmica (121 °C/30 min/100 kPa)</li>
	<li>Atribua os ratos (n=5) em três grupos de cinco ratos por grupo: 1. sham, 2. hepatectomia e 3. hepatectomia mais CMS, e siga todos os grupos nos dias 3, 14 e 21 dias.<ol>
<li>Administrar cetamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro. NOTA: O período sedativo normalmente dura de 30-40 min.</li>
		<li>Raspe a pele abdominal (5 cm x 2 cm) usando sabão cirúrgico e uma lâmina de dois gumes, e desinfete a pele usando solução tópica de 10% de povidona-iodo em três rodadas17.</li>
		<li>Coloque o animal em uma placa quente na posição decúbito dorsal, com o pescoço hiperextendido para manter uma via aérea permeável(Figura 2).</li>
		<li>Avalie a profundidade da anestesia através do padrão respiratório e perda do reflexo de abstinência nos membros.</li>
		<li>Coloque uma cortina cirúrgica descartável ao redor da pele raspada e faça uma incisão (2,5 cm) na linha albous com um bisturi, usando o processo xifoide como ponto de referência. Evite o vaso sanguíneo da parede abdominal para evitar sangramento.</li>
		<li>Coloque o retítil abdominal no lugar e observe a cavidade abdominal. Utilizando as fórceps de dissecção, extraia o lobo hepático esquerdo e coloque-o na placa metálica(Figura 3A). NOTA: No grupo falso, apenas extraia o lobo hepático esquerdo e depois devolva o fígado para a cavidade abdominal. Sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0.</li>
		<li>Nos grupos experimentais com e sem CMS, utilize uma lâmina de bisturi e lâmina de bisturi estéril (nº 15) para realizar hepatectomia (aproximadamente 40%) com dois cortes. Use um modelo metálico triangular (1 cm x 1 cm x 1 cm) para realizar a hepatectomia(Figura 3B).</li>
		<li>Para evitar sangramento no fígado, mantenha a compressão cirúrgica com um cotonete na borda do fígado por 5 minutos.</li>
		<li>Hidrate o CMS em solução salina estéril por 20 minutos antes do procedimento cirúrgico. Implante o CMS no sítio de hepatectomia com quatro suturas de pontos entre o tecido hepático e o CMS para evitar o deslocamento do bioma material. Use 7-0 suturas de polipropileno não absorvíveis(Figura 3C). NOTA: Não remova as suturas em uma segunda cirurgia; as suturas podem ser usadas como referência para identificar o local de implantação de CMS.</li>
		<li>Devolva o fígado à cavidade abdominal e sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0. Limpe a incisão cirúrgica com uma esponja cirúrgica encharcada de iodo em duas rodadas. Observe e monitore os sinais vitais dos animais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cuidados pós-operatórios
<ol><li>Administre a flunixina de meglumina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro. Administrar analgésicos conforme aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.</li>
	<li>Para recuperação da anestesia, coloque os animais em caixas individuais de policarbonato com cama de animal de laboratório em uma área livre de ruídos com controle de temperatura (23 °C).</li>
	<li>Observe a recuperação dos animais e monitore seu consumo de água e alimentos por 2h. Monitorar animais postados operativamente conforme aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.</li>
</ol>4. Avaliação da função hepática no soro
<ol><li>Coletar amostras de sangue (500 μL) das veias traseiras laterais dos animais anestesiados antes do procedimento cirúrgico (valores de linha de base) e nos dias de avaliação 3, 14 e 21.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de sangue a 850 × g/10 min em temperatura ambiente (23 °C); separe o soro e armazene-o a -80°C até usar.</li>
	<li>Realize um painel de testes de função hepática: albumina s sorocabana (ALB), fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT), aminotransferase aspartate (AST), bilirrubina total (TB) e bilirrubina direta (DB)(Tabela 1).</li>
</ol>5. Eutanásia e manejo de tecidos
<ol><li>Anestesiar os animais para cada avaliação (dias 3, 14 e 21) seguindo o protocolo descrito acima.</li>
	<li>Eutanize através de métodos aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.</li>
	<li>Realize uma incisão (5-6 cm) na linha albous com um bisturi para observar os órgãos da cavidade abdominal e tirar fotografias da área de hepatectomia da farsa e dos grupos experimentais, com e sem o CMS.</li>
	<li>Pegue amostras hepáticas (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) de todos os animais do grupo de estudo e coloque-as em uma solução de formaldeído de 4% para 24h para avaliação histológica subsequente.</li>
</ol>6. Análise histológica
<ol><li>Preservar os tecidos hepáticos em 4% de formaldeído e desidratar o tecido usando uma série de concentrações de álcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); colocá-los em xileno (1h) e incorporá-los na parafina16.</li>
	<li>Corte os blocos de parafina com um microtome em seções de 4 μm de espessura para a preparação de oito slides.</li>
	<li>Executar h&E e masson's tricromo mancha16.</li>
	<li>Observe as seções manchadas sob um microscópio leve para selecionar as áreas representativas do fígado, com e sem CMS. Obtenha fotomicrografias em 4x, 10x e 40x de ampliação e processe as imagens usando o software apropriado18 (ver a Tabela de Materiais).</li>
</ol>

<ol><li>Li, N., Hua, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Immune cells in liver regeneration.</a> Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).</li>
<li>Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering.</a> Science. 260 (5110), 920-926 (1993).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Shafiee, A., Atla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Toward+a+new+era+of+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Toward a new era of medicine.</a> Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).</li>
<li>Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+derivatives+effectively+promotes+liver+regeneration+to+attenuate+acetaminophen-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).</li>
<li>Sancho-Bru, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+possibilities+of+stem+cells+in+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterologia+y+Hepatologia%22%5BJournal%5D)">Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases.</a> Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).</li>
<li>Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Identification%2C+phenotypic+characterization%2C+biological+properties+and+potential+for+regenerative+medicine+through+biomaterial+micro-engineering+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche.</a> Methods. 99, 62-68 (2016).</li>
<li>Freedman, B. R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+to+mimic+and+heal+connective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials to mimic and heal connective tissues.</a> Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+collagen+based+biomaterials+and+the+resulting+materials+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties.</a> Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).</li>
<li>El Baz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplant+of+hepatocytes%2C+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%2C+and+in+vitro+hepatocyte-differentiated+mesenchymal+stem+cells+in+a+chronic+lver+failure+experimental+model%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).</li>
<li>Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+multiple+osteogenic+differentiation+pathways+of+mesenchymal+stem+cells+through+different+scaffold+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).</li>
<li>Chan, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+collagen+scaffold+promotes+intrinsic+vascularisation+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications.</a> PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).</li>
<li>Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+for+whole+organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularization for whole organ bioengineering.</a> Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).</li>
<li>Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+decellularized+extracellular+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).</li>
<li>Gacek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+microscope%2C+neglected+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochemii%22%5BJournal%5D)">Stereo microscope, neglected tool.</a> Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).</li>
<li>Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+survivable+liver+biopsy+procedure+in+mice+to+assess+non-alcoholic+steatohepatitis+%28NASH%29+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).</li>
<li>The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Use+of+Chemical+Depilatory+Agents+on+Laboratory+Animals%22">Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://research.utexas.edu">https://research.utexas.edu</a> (2021).</li>
<li>Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+learning+in+neural+net+models+with+Poisson+and+Gauss+connectivities%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%22%5BJournal%5D)">The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities.</a> Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).</li>
<li>León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterization+of+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).</li>
<li>León, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematological+and+biochemical+parameters+in+Sprague+Dawley+laboratory+rats+breed+in+CENPALAB%2C+Cenp%3ASPRD%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Electronica+de+Veterinaria%22%5BJournal%5D)">Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD.</a> Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapies+for+liver+cirrhosis%3A+MSCs+as+%22conducting+cells%22+for+improvement+of+liver+fibrosis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Universidad+Nacional+Aut%C3%B3noma+de+M%C3%A9xico%22">Universidad Nacional Autónoma de México</a>. , Specialty of Urology thesis (2011).</li>
<li>Montalvo-Jave, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+bioprosthesis+for+the+treatment+of+bile+duct+injury+in+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model.</a> International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Benjamín León-Mancilla é doutorando pelo Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu bolsa DGAPA-UNAM.

O transplante de órgãos é o pilar do tratamento em pacientes com fibrose hepática ou cirrose. Alguns pacientes se beneficiam desse procedimento, tornando necessário fornecer alternativas terapêuticas para os pacientes na lista de espera. A engenharia de tecidos é uma estratégia promissora que emprega andaimes e células com potencial regenerativo2,4,13. A remoção de uma porção do fígado é um passo crítico neste procedimento devid...

O fígado é um dos órgãos mais importantes envolvidos na manutenção da homeostase e da produção deproteínas 1. Infelizmente, a doença hepática é a principal causa de morte em todo o mundo. Em estágios avançados de dano hepático, que incluem cirrose e carcinoma hepatocelular, o transplante de fígado é o procedimento clinicamente recomendado. No entanto, devido à escassez de doadores e à baixa taxa de transplantes bem sucedidos, novas técnicas em engenharia de tecidos (TE) e medicina regenerativa (RM) foram desenvolvidas2,3.
O TE envolve o uso de células-tronco, andaimes e fatores de crescimento4 para promover a restauração de órgãos e tecidos inflamados, fibrosos e edematosos1,5,6. Os biomateriais utilizados em andaimes imitam o ECM nativo, fornecendo as pistas físicas, químicas e biológicas para remodelação celular guiada7. O colágeno é uma das proteínas mais abundantes obtidas a partir da dermis, tendão, intestino e pericárdio8,9. Além disso, o colágeno pode ser obtido como biopolímero para produzir andaimes bi e tridimensionais através de bioimpressão ou eletropinning10,11. Este grupo é o primeiro a relatar o uso de colágeno de uma fonte óssea para a regeneração do tecido hepático. Outro estudo relata o uso de andaimes sintetizados a partir de colágeno bovino, obtido a partir da pele, com poros homogêneos e situados de perto, sem qualquer comunicação entre eles12.
A descelularização preserva o ECM nativo, permitindo a posterior incorporação de células com potencial de células-tronco13,14. No entanto, este procedimento ainda está em fase experimental no fígado, coração, rim, intestino delgado e bexiga urinária de camundongos, ratos, coelhos, porcos, ovelhas, bovinos e cavalos3,14. Atualmente, o volume de massa hepática ressectado não é substituído em nenhum dos modelos de hepatectomia animal. No entanto, o uso de suporte adicional ou rede (biomateriais) que permita a proliferação celular e a angiogênese pode ser essencial para a pronta restauração das funções paramicírmicas hepáticas. Assim, os andaimes poderiam ser empregados como abordagens alternativas para regenerar ou reparar tecidos em doenças hepáticas crônicas, eliminando limitações devido à doação e às complicações clínicas do transplante hepático.

<table><tbody><tr><td>Detergente aniônico</td><td>Alconox</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>de biópsia</td><td>Leica</td><td>3802453</td><td></td></tr><tr><td>Câmera DMX</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de clorexidina 4%</td> <td>BD</td><td>372412</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura 25 mm x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-224</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200-M</td><td>CAS 17372-87-1</td></tr><tr><td>Álcool etílico, puro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>CAS 64-17-5</td></tr><tr><td>Flunixina meglumida</td><td>MSD</td><td>Q-0273-035</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro 75 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>101081022</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Merck</td><td>H9627</td><td>CAS 571-28-2</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico 37%</td><td>Merck</td><td>339253</td><td>CAS 7647-01-0</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Pisa agropecuária</td><td>Q-7833-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Nikon</td><td>Microphoto-FXA</td><td></td></tr><tr><td>Microcirurgia estereomicroscópio</td><td>Zeiss</td><td>OPMI F170</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer capa amarela</td><td>Beckton Dickinson</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM2125</td><td></td></tr><tr><td>Animal modelo: ratos Wistar</td><td>Universidad Nacional Aut&oacute; noma de M&eacute; xico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon 3-0 (Dermalon)</td><td>Covidien</td><td>1750-41</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno 7-0</td><td>Atramat</td><td>SE867/2-60</td><td></td></tr><tr><td>Povidona-iodo10% solução cutânea</td><td>Diafra SA de CV</td><td>1.37E+86</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>Zeiss</td><td>DSM-950</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, pellets</td><td>J. T. Baker</td><td>3722-01</td><td>CAS 1310-73-2</td></tr><tr><td>Software ACT-1</td><td>Nikon</td><td>Ver 2.70</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>EZ4Stereo 8X-35X</td><td></td></tr><tr><td>Sterrad 100S</td><td>Johnson and Johnson</td><td>99970</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Synringe de 1 mL com agulha (27G x 13 mm)</td><td>SensiMedical</td><td>LAN-078-077</td><td></td></tr><tr><td>Processador de tecidos ( Histokinette)</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 (Incorporador de tecidos)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração tricrômica</td><td>Analisador Sigma-Aldrich</td><td>HT15</td><td></td></tr><tr><td>Unicell DxC600</td><td>Beckman Coulter</td><td>BC 200-10</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Pisa agropecuária</td><td>Q-7833-099</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>CAS 1330-20-7</td></tr></tbody></table>

implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Doenças hepáticas são a principal causa de morte em todo o mundo. O consumo excessivo de álcool, uma dieta rica em gordura e a infecção pelo vírus da hepatite C promovem fibrose, cirrose e/ou carcinoma hepatocelular. O transplante de fígado é o procedimento clinicamente recomendado para melhorar e prolongar a vida útil dos pacientes em estágios avançados da doença. No entanto, apenas 10% dos transplantes são bem-sucedidos, com disponibilidade de órgãos, procedimentos pré-cirúrgicos e pós-cirúrgicos, e custos elevados diretamente correlacionados com esse resultado. Andaimes de matriz extracelular (ECM) surgiram como uma alternativa para a restauração tecidual. A biocompatibilidade e a aceitação do enxerto são as principais características benéficas desses biomateriais. Embora a capacidade de restaurar o tamanho e a função correta do fígado tenha sido avaliada em modelos de hepatectomia hepática, o uso de andaimes ou algum tipo de suporte para substituir o volume da massa hepática extirpada não foi avaliado.
A hepatectomia parcial foi realizada em um fígado de rato com a xenoimplantação de um andaime de matriz de colágeno (CMS) de um condíle bovino. O tecido do lobo hepático esquerdo foi removido (aproximadamente 40%), e uma proporção igual de CMS foi implantada cirurgicamente. Os testes de função hepática foram avaliados antes e depois do procedimento cirúrgico. Após os dias 3, 14 e 21, os animais foram eutanizados, e foram realizadas avaliações macroscópicas e histópicas. Nos dias 3 e 14, observou-se tecido adiposo em torno do CMS, sem evidência clínica de rejeição ou infecção, assim como a neoformação do vaso e a reabsorção de CMS no dia 21. Havia evidências histológicas de um processo de inflamação insignificante e migração de células adjacentes para o CMS, observadas com a hematoxilina e eosina (H&E) e a coloração tricrômica de Masson. O CMS mostrou-se ter um bom desempenho no tecido hepático e pode ser uma alternativa útil para estudar a regeneração tecidual e a reparação em doenças hepáticas crônicas.

A desmineralização óssea afeta as propriedades mecânicas do CMS sem alterar a forma original ou a interconexão de seusporos. O CMS pode ter qualquer forma e, portanto, pode ser ajustado ao tamanho e forma do órgão ou tecido selecionado19. No presente protocolo, utilizamos um CMS triangular (Figura 1A-D). Foi utilizado um modelo de rato para avaliar a capacidade regenerativa do xenoimplant CMS no fígado. Embora o fíga...

Doenças hepáticas são induzidas por muitas causas que promovem fibrose ou cirrose. O transplante é a única opção para recuperar a saúde. No entanto, dada a escassez de órgãos transplantáveis, alternativas devem ser exploradas. Nossa pesquisa propõe a implantação de andaimes de colágeno no tecido hepático a partir de um modelo animal.

Implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Este método envolve colocar um implante de matriz de colágeno como um andaime no fígado para promover a regeneração hepática. Este método de implantação abriu a porta para um estrategista que explora a restauração da forma e do balão dos tecidos ressecados, reduzindo assim anestesia, duração cirúrgica e tempo de recuperação. Este método pode ser usado para promover a regeneração envolvendo modelos de fibrose hepática, bem como outras espécies de mamíferos.Este método é baseado na engenharia de tecidos e medicina regenerativa para promover a restauração do tecido lesionado. Comece higienizando a mesa de trabalho da área cirúrgica, microscópio de microcirurgia e assento com uma solução de 2% de clorexidina, depois hidrate o andaime da matriz de colágeno obtido de um condíle bovino em solução salina estéril por 20 minutos. Em seguida, usando sabão cirúrgico e uma lâmina de dois gumes, raspe a pele abdominal de um rato Wistar macho anestesizado de seis a oito semanas de idade, e depois desinfete a pele três vezes usando uma solução de iodo de 10% povidone.Coloque o animal em uma placa quente na posição dorsal do decúbito com o pescoço hiperextendido para manter uma via aérea permeável. Avalie a profundidade da anestesia através do padrão respiratório e perda de reflexo de abstinência nos membros. Em seguida, coloque uma cortina cirúrgica descartável ao redor da pele raspada e usando o processo xifoide como ponto de referência, faça uma incisão de 2,5 centímetros na linha dos alpis com fórceps de dissecção, tomando cuidado para evitar o vaso sanguíneo da parede abdominal para evitar sangramento.Depois de colocar o retítil abdominal, observe a cavidade abdominal. Usando as fórceps de dissecção, extraia o lobo hepático esquerdo e coloque-o na placa metálica. Usando um modelo metálico triangular estéril por um centímetro, realize uma hepatectomia.Para evitar sangramento no fígado, mantenha a compressão cirúrgica com um cotonete na borda do fígado por cinco minutos. Em seguida, utilizando suturas de polipropileno não absorvíveis 7-O, implante o andaime hidráulico da matriz de colágeno no sítio de hepatectomia com quatro pontos entre o tecido hepático e o andaime para evitar o deslocamento do bioma material. Devolva o fígado à cavidade abdominal e sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0.Limpe a incisão cirúrgica duas vezes com uma esponja cirúrgica encharcada de iodo e monitore os sinais vitais do animal. Em seguida, coloque o animal na posição de decúbito lateral. Após a administração de um analgésico, coloque o animal em uma caixa individual de policarbonato com cama animal de laboratório em uma área livre de ruídos com controle de temperatura.Observe a recuperação da anestesia e monitore o consumo de água e alimentos por duas horas. Não houve diferença na função hepática entre o grupo SHAM e os grupos experimentais com e sem o andaime da matriz de colágeno em três, 14 e 21 dias, indicando que o andaime da matriz de colágeno não interrompe a função hepática. A análise histológica no terceiro dia mostra que a presença do andaime da matriz de colágeno no fígado não promoveu uma reação do corpo estranho e a presença visível de tecido conjuntivo frouxo é observada.Nos dias 14 e 21, o tecido conjuntivo frouxo é mais abundante com a matriz de colágeno trabeculae cercada por hepatócitos sugerindo que os hepatócitos migraram para o andaime da matriz de colágeno. Áreas de hepatócitos irrigadas por um vaso podem ser vistas e os hepatócitos aderindo à matriz de colágeno trabeculae são às vezes cercados por tecido conjuntivo frouxo. Durante a realização da hepatectomia, use técnica asséptica para evitar infecções e aplique compressão depois para evitar sangramento no fígado.Além disso, use suturas 7-O para implantação de andaime de matriz de colágeno para evitar rasgos. Após a implantação do andaime da matriz de colágeno em um modelo animal fibroso, as vantagens da implantação sinogênica para a regeneração hepática podem ser avaliadas. O uso de andaime de matriz de colágeno para substituir a massa extubada hepática não foi avaliado até agora.Esses materiais genogênicos abrem caminho como outra opção terapêutica no campo das doenças hepáticas crônicas.

three-dimensional-collagen-matrix-scaffold-implantation-as-liver

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Neste trabalho, apresentamos uma técnica para a fabricação rápida de tecidos vasculares vivos por cultura direta de colágeno, células musculares lisas e células endoteliais. Além disso, um novo protocolo para a caracterização mecânica de tecidos vasculares projetados é descrito.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

A engenharia de tecidos muitas vezes inclui expansão in vitro, a fim de criar auto-enxertos para regeneração de tecidos. Neste estudo, um método para a expansão do tecido, a regeneração, e a reconstrução in vivo, foi desenvolvida de modo a minimizar o processamento de materiais biológicos e as células fora do corpo.

O tecido triturado em Compressed Collagen: Um BioTransplant contendo celular para o reparo Reconstructive Single-encenado

Uma técnica inovadora de biofabricação foi desenvolvida para projetar construções tridimensionais que se assemelham às características arquitetônicas, componentes e propriedades mecânicas do tecido in vivo. Esta técnica apresenta um material de sacrifício recém-desenvolvido, a borracha BSA, que transfere características espaciais detalhadas, reproduzindo as arquiteturas in vivo de uma ampla variedade de tecidos.

Tridimensional Tecnologia Biomimético: Novel Biorubber Cria Definido micro e macro-escala Arquitecturas em colágeno hidrogéis

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a fabricação de uma plataforma emergente de cultura de hepatócitos tridimensionais, o andaime de cristal coloidal invertido e as técnicas concomitantes para avaliar o comportamento dos hepatócitos. Os poros controláveis por tamanho, a interconectividade e a capacidade de conjugar proteínas da matriz extracelular ao andaime de poli (etilenoglicol) (PEG) aumentam o desempenho das células Huh-7.5.

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Os organoides revolucionam a modelagem personalizada de tecidos para desenvolvimento de órgãos, descoberta de medicamentos e pesquisa de doenças. A engenharia organoide avança na criação de tecidos sintéticos intrincados. O objetivo é integrar morfogênese, tecnologia de assembloides e biomatrizes para avançar na engenharia de tecidos. Este protocolo auxilia na modelagem da organogênese hepática e no estabelecimento de diretrizes para a construção de tecidos sintéticos.

Técnicas de cultivo in vitro para modelar a organogênese hepática, construir assembleides,

Aprenda a implantar andaimes de colágeno tridimensional para regeneração hepática em modelo animal fibrotico. Este método promove restauração tecidual sem comprometer a função hepática.

Implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática

Explorar mais vídeos