Ensaio de liberação de mediador humanizado como um read-out para potência alergênico

O ensaio representa uma importante ferramenta de pesquisa para simular as degranulações de basófilos induzidos pelo cruzamento entre os pacientes e os alérgenos. Assim, o ensaio pode ser usado para imitar o tipo 1, reações alérgicas. O ensaio é robusto, reproduzível e adaptável.

Além disso, é altamente sensível, pois pode ser realizado com pequenas quantidades de alérgenos recombinantes ou purificados ou mesmo com extratos complexos de alergênicos. O método é usado para diagnosticar alergias, pois analisa a reatividade do IgE dos pacientes aos alérgenos. Além disso, este método é adequado para analisar a reatividade cruzada e monitorar a eficácia do tratamento de IH.

Comece colhendo células Ag8 do frasco de cultura celular e transfira as células para um tubo de centrifugação. Pelota para baixo das células por centrifugação por cinco minutos, a 250 vezes g à temperatura ambiente. Aspire o supernante, e resuspenme a pelota celular a uma concentração final de aproximadamente uma vez 10 a 6 células, por mililitro em humanizado, células RBL média.

Diluir sera humana de 1 a 10 em suspensão celular Ag8 para a diluição final do soro de 1 a 20 no ensaio, e incubar por uma hora a 37 graus Celsius e cinco a 7% de dióxido de carbono. Quando as células RBL humanizadas atingem 50 a 90% de confluência, aspire o meio a partir de um frasco de cultura celular T-75 cuidadosamente sem tocar nas células RBL humanizadas aderidas. Lave as células duas vezes adicionando 10 mililitros de DPBS ao lado oposto do frasco e não diretamente nas células.

DpBS aspirado, adicione cinco mililitros de pré-aquecidos uma vez trypsin-EDTA para descolamento celular e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Bata suavemente no frasco para desprender as células. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 15 milímetros e encha o tubo com meio de célula RBL humanizado ou DPBS para diluir a trippsina-EDTA.

Centrifugar as células a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o supernasce, e resuspende a pelota em cinco mililitros de meio celular RBL humanizado para contagem celular. Após a contagem das células, dilui as células em meio celular RBL humanizado para obter uma concentração final de duas vezes 10 a sexta células por mililitro.

Adicione 50 microliters de suspensão celular RBL humanizada, por bem, equivalente a uma vezes 10 às quintas células por poço em uma placa estéril de 96 poços. Centrifugar a suspensão do soro Ag8 pré-incubado e transferir 50 microliters da suspensão do soro Ag8 centrifuada para cada poço contendo células RBL humanizadas, sem perturbar a pelota de célula Ag8. Use células sensibilizadas sem antígeno como controle de antígeno para indicação do platô ou fundo do sinal inferior, e não sensibilize os poços de controle de fundo e máxima lise.

Cubra a placa com a tampa e incuba durante a noite a 37 graus Celsius e de 5 a 7% de dióxido de carbono. Aspire a sera contendo meio celular, inverta e bata a placa no papel absorvente para esvaziar a placa para lavar células RBL humanizadas. Lave as células três vezes adicionando 200 microliters do buffer de Tyrode por poço, e incubar por aproximadamente 30 segundos por lavagem para as duas primeiras lavagens.

Depois de adicionar o buffer de Tyrode pela terceira vez, aspire o buffer e deixe a solução nos poços até estar pronto para adicionar a diluição do antígeno. Transfira 100 microliters de solução de antígeno para cada poço contendo as células RBL humanizadas pré-sensibilizadas, mas não estimule as células de fundo máxima e não sensibilizadas com antígeno. Adicione 100 microliters do buffer de Tyrode nos poços de controle máximo de lise, poços de controle de fundo não sensibilizados e poços de não-antígeno sensibilizados.

Incubar as células por uma hora a 37 graus Celsius e 5 a 7% de dióxido de carbono. Trate os poços máximos de controle de lise com 10 microlitadores de 10% Triton X-100 por poço, e misture corretamente para lise as células completamente para 100% de liberação de beta-hexosaminidase. Adicione 50 microliters de solução de substrato em uma nova placa de 96 poços não vinculante.

Transfira 50 microlitres de supernascer dos poços de células RBL humanizadas contendo placa na nova placa contendo a solução do substrato e incubar a placa por uma hora a 37 graus Celsius para permitir a conversão do substrato fluorogênico. Adicione 100 microliters de solução de parada por poço e meça a fluorescência conforme descrito no manuscrito do texto. A curva em forma de sino obtida no ensaio de atividade beta-hexosaminidase, indicando a ocupação monovalente de epítopos de antígeno de imunoglobulina E devido ao excesso de alérgeno, que inibe a imunoglobulina alérgena E intercambiando em altas concentrações de antígeno.

A concentração de antígeno necessária para a metade máxima da liberação do mediador foi calculada utilizando-se a análise de regressão linear. O ensaio de viabilidade celular foi realizado para excluir os efeitos citotóxicos derivados do soro sensibilizador ou do antígeno utilizado para estimulação. Cinco soros humanos diferentes foram usados para o ensaio de atividade beta-hexosaminidase, e quatro em cada cinco soros derivados da alergia ao pólen de bétula responderam à estimulação bet v 1, demonstrando que Bet v 1 é um potente alérgeno responsável por sintomas alérgicos mediados pela imunoglobulina E.

Foi avaliada a reatividade cruzada da imunoglobulina E aos alérgenos homólogos. A resposta ao Bet v 1 foi encontrada em ambos os pacientes, mas o paciente dois também respondeu a Cor a 1. O alergênico alimentar homólogo bet v 1, indicando cor mais alto um 1 níveis de imunoglobulina E transativa no paciente dois.

A natureza hipoalergênica das variantes mutantes dos alérgenos foi avaliada e comparada com sua contraparte do tipo selvagem. A curva de liberação da variante Bet v 1 fold mudou para uma maior concentração de antígeno em comparação com o alérgeno tipo selvagem, resultando em uma concentração significativamente maior de antígeno para provocar a liberação meia máxima, o que torna o mutante menos alérgico e, portanto, um candidato para imunoterapia específica de alergênico. Não se esqueça de deixar as soluções de lavagem nas células até aplicar a diluição do antígeno para evitar que as células sequem, caso contrário, isso resultaria em um fraco desempenho do ensaio.

O ensaio pode ser usado para muitas aplicações diferentes, incluindo a padronização de produtos alergênicos, com base em sua atividade biológica, como soluções de teste de picada de pele ou extratos usados para imunoterapia específica de alergênicos.