Name: Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a induzir lesão traumática craniana por força bruta em zebrafish adulto usando um modelo de queda de peso escalável. Este método permite estudar patologias e mecanismos de regeneração neuronal pós-lesão.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Hyde por suas discussões pensativas, os técnicos do Freimann Life Sciences Center para cuidados e criação de zebrafish, e o Núcleo de Microscopia Óptica da Universidade de Notre Dame/NDIIF pelo uso de instrumentos e seus serviços. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Pesquisa de Zebrafish da Universidade de Notre Dame, pelo Centro de Células-Tronco e Medicina Regenerativa da Universidade de Notre Dame, e bolsas do National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinelas da Sociedade da Liberdade (JTH) e a Bolsa Pat Tillman (JTH).

Os zebrafish foram criados e mantidos na instalação de zebrafish de Notre Dame no Centro de Ciências da Vida de Freimann. Os métodos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame.
1. Paradigma de lesão cerebral traumática
<ol><li>Adicione 1 mL de 2-phenoxyetanol a 1 L de água do sistema (60 mg de Oceano Instantâneo em 1 L de água de RO desionizada).</li>
	<li>Prepare um tanque de recuperação aerado contendo 2 L de água do sistema à temperatura ambiente.</li>
	<li>Selecione o peso desejado do rolamento da esfera e um comprimento e diâmetro desejados de tubos de aço/plástico e determine a força de energia e impacto. NOTA: A tubulação deve ter um diâmetro interno que permita que o rolamento da esfera passe sem alterar seu caminho ou velocidade de movimento.<ol>
<li>Determine a energia cinética após o impacto: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq01.jpg"> Onde, KE = energia cinética, m = massa (em kg), g = força gravitacional, h = altura (em m) do ponto de gota para o peixe. NOTA: Isso fornece energia cinética em J. Multiplique o valor por 1.000 para determinar mJ. O KE é baseado em um objeto acelerado, que ocorre quando o rolamento da esfera é derrubado de uma posição estacionária.</li>
		<li>Gere um TBI leve (miTBI) utilizando tubos de aço/plástico de 7,62 cm de comprimento que terminam 1,5 cm acima da placa no crânio do zebrafish (distância total de 9,1 cm) e um rolamento de esfera de 1,5 g (6,4 mm de diâmetro). Estes produzem uma energia cinética de 1,33 mJ. Este dano foi empiricamente decidido ser equivalente a um miTBI baseado em marcadores TBI fisioterológicos chave, como lesão vascular, formação de hematoma subdural/intracerebral, morte celular neuronal e prejuízos cognitivos que em grande parte recapitulavam o que foi relatado na população humana de forma dependente da gravidade.</li>
		<li>Calcular energia cinética miTBI = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq02.jpg">
</li>
		<li>Gere um TBI moderado (moTBI) utilizando tubos de aço/plástico de 12,7 cm de comprimento que terminam 1,5 cm acima da placa no crânio do zebrafish (distância total de 14,2 cm) e um rolamento de esfera de 1,5 g (6,4 mm de diâmetro) que produz energia cinética de 2,08 mJ.</li>
		<li>Calcular moTBI de energia cinética = <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq03.jpg">
</li>
		<li>Gere um TBI (sTBI) grave usando tubos de aço/plástico de 7,62 cm de comprimento que terminam 1,5 cm acima da placa no crânio do zebrafish (distância total de 9,1 cm) e um rolamento de esfera de 8,38 mm de diâmetro que produz uma energia cinética de 2,94 mJ.</li>
		<li>Calcular energia cinética sTBI = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq04.jpg">
</li>
	</ol></li>
	<li>Encha uma placa de Petri com argila de modelagem (Figura 1, passo 1) e use um instrumento contundente (ou seja, a parte de trás de um par de fórceps) para criar uma plataforma elevada (5 cm x 1,5 cm) com argila de modelagem adicional (Figura 1, passo 2).<ol>
<li>Use uma lâmina de barbear para dividir a plataforma elevada longitudinalmente em duas metades aproximadamente iguais (Figura 1, passo 3, linha tracejada vermelha). Forme as duas metades em um canal que acomoda o comprimento de um peixe adulto (Figura 1, passo 4). Use argila adicional para construir paredes que garantam ~2/3 do corpo do peixe, deixando a cabeça exposta.</li>
		<li>Molde um pequeno suporte na região da cabeça exposta perpendicular às paredes para apoiar a cabeça para evitar rotação ou recuo da cabeça após o ferimento (Figura 1, passo 4). NOTA: O canal deve ser profundo o suficiente para apoiar o peixe em uma posição dorsal- up, mas ainda deve permitir que a cabeça descanse acima da argila circundante. Além disso, o suporte para a cabeça deve seguir a curvatura natural do peixe, suportando a mandíbula inferior e as brânquias.</li>
		<li>Certifique-se de que o peso caído não seja impedido pelos lados do canal (Figura 1, passo 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Crie um disco de aço de 3 mm de diâmetro usando um mini furo-perfurador e um pisca-pisca de aço de 22 g. Cada disco pode ser usado várias vezes.</li>
	<li>Anestesia um peixe colocando-o em um béquer com 50-100 mL de 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-fenoxitanol até que não seja respondetivo ao aperto de cauda.</li>
	<li>Coloque o peixe, lado dorsal para cima, no molde de argila dentro do canal para que o corpo seja fixado nas laterais e coloque um disco de aço de 3 mm 22 g na cabeça, centrado sobre o ponto de impacto desejado (Figura 1, passo 5).<ol>
<li>Certifique-se de que o peixe esteja alinhado o mais perpendicularmente possível para evitar que sua cabeça se incline para um lado, o que poderia causar um impacto desigual.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixar o tubo de aço/plástico, utilizando um suporte de anel padrão e grampo de braço, de modo que a parte inferior da tubulação está 1,5 cm acima da cabeça do zebrafish (Figura 1, passo 6). Certifique-se de que a tubulação está reta.<ol>
<li>Olhe para baixo da tubulação e certifique-se de que o tubo está alinhado acima da placa de aço.</li>
	</ol></li>
	<li>Solte o rolamento da esfera (1,5 g para TBI leve e moderado, e 3,3 g para TCE grave) de uma altura predeterminada (descrita nas Etapas 1.3.3-1.3.5) descendo a tubulação sobre a placa de aço localizada sobre a região neuroanatómica desejada de interesse (por exemplo, cerebelo, Figura 1, passo 5) para produzir o TBI de força bruta para a gravidade desejada da lesão. Coloque os peixes feridos em um tanque de recuperação para serem monitorados. NOTA: Dependendo da gravidade da lesão, a mortalidade ou as convulsões tônica-clonicas podem ocorrer. Se o peixe não responder por um período prolongado de tempo após o TBI, use uma pipeta de transferência ou fórceps para administrar uma pinça traseira e avaliar uma resposta à dor.</li>
</ol>2. Pontuação de convulsões pós-TCE no zebrafish adulto
<ol><li>Anestesiar e ferir os peixes de acordo com o protocolo de lesão descrito na seção 1 e colocar os peixes feridos em um tanque de recuperação aerado de 2 L de água do sistema.</li>
	<li>Observe o peixe para qualquer sinal de convulsões pós-traumáticas começando imediatamente após ser colocado no tanque de recuperação. Estabeleça um tempo de observação (ou seja, 1 h) e regisse toda a atividade convulsiva, incluindo o escore de convulsão (descrito abaixo), duração de cada convulsão e o percentual de peixes que sofreram convulsões (Figura 2A). NOTA: As convulsões podem ocorrer imediatamente após ferimentos, bem como horas ou dias pós-TCE. As convulsões podem persistir a longo prazo e um único peixe pode ter múltiplas convulsões. Estabelecer um tempo de observação de 1 h ou mais produzirá uma boa representação da tendência geral das taxas de apreensão.</li>
	<li>Escore peixe usando as diretrizes mussulini18 para fenótipos de apreensão de zebrafish adultos. NOTA: Sem usar o software de rastreamento, é difícil avaliar os escores de convulsão abaixo de 3 imparcialmente. Portanto, apenas escores de convulsão de 3 ou mais devem ser registrados quando a avaliação está sendo realizada sem software.</li>
</ol>3. Dissecção cerebral
<ol><li>Eutanize o peixe em uma solução de 1:500 (2 mL/1 L, 0,2%) de 2-fenoxinotanol, até que os movimentos da brânquia cessem, e eles não são ativos para fin pinch, no ponto final desejado.</li>
	<li>Encha uma placa de Petri com argila modeladora e crie uma pequena cavidade para apoiar o corpo durante a dissecação.</li>
	<li>Coloque o peixe, lado dorsal para cima, no molde de argila. Coloque um pino de dissecção através da linha média no meio do corpo do peixe e um segundo pino ~5 mm atrás da base da cabeça.</li>
	<li>Sob um microscópio de luz dissecando, corte sem rodeios o nervo óptico com um par de fórceps De Dumont #5 e remova os olhos (Figura 2A).</li>
	<li>Oriente o peixe para que a extremidade rostral seja mais distante quando olhar através do microscópio (Figura 2B). NOTA: As seguintes etapas são para indivíduos destros. Os canhotos podem preferir realizar as seguintes etapas em uma orientação espelhada.</li>
	<li>Use fórceps #5 para colocar lentamente uma extremidade dos fórceps sob a placa parietal direita, fazendo uma ação deliberada de tesoura movendo-se em direção à extremidade rostral e remover as placas parietal e frontal direita (Figura 2C).<ol>
<li>Mantenha os fórceps em um ângulo de 45° ou inferior, a fim de evitar penetrar o cérebro durante a dissecção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire o peixe 90° no sentido horário. Coloque uma extremidade das fórceps #5 sob a placa parietal esquerda e use o mesmo movimento da tesoura para remover as placas parietal esquerda e frontal expondo todo o aspecto dorsal do cérebro (Figura 2D,E).</li>
	<li>Transectar sem rodeios a maxila com fórceps nº 5. Preservar as lâmpadas olfativas e não danificá-las se esta for a região de interesse.</li>
	<li>Remova o opercle direito, o preopercle, o interopercle e o subóperculo com fórceps #5 (Figura 2F).</li>
	<li>Ressecção direta da musculatura na extremidade caudal da abertura do calvarium usando fórceps #5, expondo a medula espinhal.</li>
	<li>Transectar sem rodeios a medula espinhal com fórceps nº 5. Coloque cuidadosamente fórceps sob o cérebro e remova suavemente o cérebro do calvario. NOTA: Nunca belisque o cérebro. Use fórceps para "embalar" o cérebro ou resseccionar caudalmente e utilizar a medula espinhal exposta como um ponto de beliscão para manobrar o cérebro.</li>
	<li>Fixar os cérebros removidos em 9 partes 100% etanol para 1 parte 37% formaldeído durante a noite a 4°C em uma plataforma roqueiro.</li>
</ol>4. Estudos de edema no cérebro de zebrafish
<ol><li>Anestesiar e ferir peixes de acordo com o protocolo de lesão descrito na seção 1 e permitir que os peixes se recuperem em um tanque de recuperação até que comecem a nadar livremente.</li>
	<li>Coloque os peixes de volta nas condições normais de habitação pós-lesão por 1 dia.</li>
	<li>Eutanize o peixe em 1:500 2-phenoxyetanol, depois que o tempo passou.</li>
	<li>Disseque todo o cérebro ou região de interesse de acordo com o protocolo descrito na seção 3 e coloque o cérebro imediatamente em um pequeno barco de pesagem. NOTA: Tenha cuidado ao transferir o cérebro, usando fórceps finos para colocá-lo suavemente no barco de pesagem sem esfaquear ou raspar o cérebro, o que pode resultar na perda de tecido.</li>
	<li>Rotular (com grupo de lesões e número cerebral) e tare um barco de pesagem de secagem menor adicional em uma escala. Use uma balança com a capacidade de medir um mínimo de 0,001 g para obter uma medição precisa.</li>
	<li>Transfira o cérebro para o barco de pesagem de secagem e regisse o peso úmido do cérebro. Oriente os cérebros para que eles deitem-se sobre o barco de pesagem com o lado dorsal virado para cima.</li>
	<li>Coloque o barco de pesagem de secagem e o cérebro em um forno de hibridização definido a 60 °C por 8h.</li>
	<li>Após a secagem, o cérebro pode ficar grudado no barco de pesagem de secagem e pode ser difícil de remover e transferir para um novo pequeno barco de pesagem tared. Evite beliscar o cérebro com fórceps, pois isso pode resultar em danos ao cérebro seco e perda de tecido. Em vez disso, aperte os fórceps finos juntos e, começando pelo lado ventral do cérebro, colher em um movimento ascendente.</li>
	<li>Determinar o teor de água de cada cérebro usando a fórmula (Figura 4): <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq05.jpg">
</li>
</ol>5. Rotular a proliferação celular através da neuroaxis e preparar tecido fixo.
<ol><li>Prepare 10 mM 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) em 2 mL de ddH2O.</li>
	<li>Anestesiar 3 a 4 peixes de cada vez em 50-100 mL de 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-fenoxiyetanol até que o peixe não responda ao aperto de cauda, no ponto de tempo desejado após a lesão (usando o protocolo delineado na seção 1).</li>
	<li>Faça uma incisão parcial em uma esponja molhada e coloque um peixe de cada vez na abertura, lado ventral para cima.</li>
	<li>Use uma agulha de 30 G para injetar ~40 μL de 10 mM EdU no corpo do peixe. Devolva o peixe para um tanque de retenção cheio de água do sistema. NOTA: As injeções repetidas podem ser realizadas em diferentes pontos de tempo para rotular um maior número de células proliferadoras e podem ser necessárias se um período de perseguição superior a 1 semana for desejado.</li>
	<li>Colete cérebros como descrito na seção 3 e coloque-os como um grupo em um frasco de vidro de 5 mL contendo 2 mL de 9 partes 100% etanol para 1 parte 37% formaldeído. Fixar os cérebros a 4 °C em uma plataforma de roqueiro. NOTA: Uma plataforma de roqueiro ou agitador proíbe que os cérebros descansem na parte inferior e o telencephalon de cérebros inteiros de enrolar.</li>
	<li>Cérebros de reidratação, no mesmo frasco de vidro usado para fixar cérebros, em lavagens de etanol descendente série, 75%, 50%, e 25%, para 15 minutos cada, seguido por uma lavagem de 1,5 h em 5% de sacarose/PBS em um roqueiro à temperatura ambiente. Armazene os cérebros em um frasco de vidro durante a noite em 30% de sacarose/PBS a 4° C em uma plataforma de roqueiro.</li>
	<li>Remova os cérebros de 30% de sacarose/PBS e transfira-os com fórceps para uma placa de 12 poços (um grupo de tratamento por poço) com poços preenchidos com uma solução 2:1 consistindo de 2 partes de tecido congelante médio e 1 parte 30% de sacarose/PBS. Incubar os cérebros durante a noite a 4 °C em uma plataforma de roqueiro.</li>
	<li>Transfira cérebros para a próxima linha de poços dentro da placa de 12 poços submersos cérebros em 100% TFM para 2-24 h a 4 °C.</li>
	<li>Use um mandril criostat para incorporar os cérebros em TFM na orientação desejada sobre gelo seco.</li>
	<li>Realize o criosectioning (seções de 16 μm de espessura) e colete as seções em slides carregados positivamente. Seque lâminas em um aquecedor de slides por 1h e depois armazene a -80 °C ou continue com a imunohistoquímica.</li>
	<li>Prepare uma barreira hidrofóbica na lâmina ao redor das seções teciduais e deixe secar em um aquecedor de slides por 20 minutos.</li>
	<li>Lave brevemente os slides em PBS por 5 min e depois duas vezes em PBS-Tween 20 (0,05%) por 10 min cada.</li>
	<li>Realize a detecção da EdU usando o Kit de Proliferação de Células EdU e as instruções do fabricante.</li>
	<li>Analise os slides e quantifique as células fluorescentes rotuladas por EdU usando um microscópio epifluorescente ou um microscópio confocal. Um mínimo de 40x de objetivo será necessário para distinguir claramente células individuais.</li>
</ol>

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<li>Lund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury%2C+acute+phase+course+and+deviations+in+physiological+variables%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Trauma+Resuscitation+and+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77(2016).</li>
<li>Levin, H., Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis%2C+prognosis%2C+and+clinical+management+of+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury.</a> The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).</li>
<li>Ruff, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+diagnosing+a+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+National+Academy+of+Neuropsychology+education+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Clinical+Neuropsychology%3A+The+Official+Journal+of+the+National+Academy+of+Neuropsychologists%22%5BJournal%5D)">Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper.</a> Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).</li>
<li>Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in fish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018(2016).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Muller+glia+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons.</a> Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As investigações de neurotrauma e sequelas associadas têm sido centradas em modelos tradicionais de roedores não regenerativos20. Somente recentemente, estudos aplicaram várias formas de dano de CNS aos modelos regenerativos9,11,13,14,21. Embora perspicazes, esses modelos são limitados pelo uso de um método de lesão pouco visto na popul...

Lesões cerebrais traumáticas (TBIs) são uma crise de saúde global e uma das principais causas de morte e incapacidade. Nos Estados Unidos, cerca de 2,9 milhões de pessoas experimentam um TCE a cada ano, e entre 2006-2014 a mortalidade por sequelas de TCE ou TCE aumentou mais de 50% 1. No entanto, os TBIs variam em sua etiologia, patologia e apresentação clínica devido, em grande parte, ao mecanismo de lesão (MOI), que também influencia as estratégias de tratamento e previu o prognóstico2. Embora os TBIs possam resultar de vários MOI, eles são predominantemente o resultado de um trauma penetrante ou contundente. Traumas penetrantes representam uma pequena porcentagem de TBIs e geram uma lesão grave e focal localizada nas regiões cerebrais próximas e circundantes3. Em contraste, as TBIs de força bruta são mais comuns na população geral, abrangem uma série de gravidades (leves, moderadas e graves) e produzem uma lesão difusa, heterogênea e global que afeta múltiplas regiões cerebrais1,4,5.
Os zebrafish (Danio rerio) têm sido utilizados para examinar uma ampla gama de insultos neurológicos que abrangem o sistema nervoso central (CNS)6,7,8,9. Os zebrafish também possuem, ao contrário dos mamíferos, uma resposta regenerativa inata e robusta para reparar danos do CNS10. Os modelos atuais de trauma de zebrafish utilizam vários métodos de lesão, incluindo penetração, excisão, insulto químico ou ondas de pressão11,12,13,14,15,16. No entanto, cada um desses métodos utiliza um MOI que raramente é experimentado pela população humana, não é escalável em uma série de gravidades de lesões, e não aborda a heterogeneidade ou sequência de TCE dependente da gravidade relatada após tbi de força bruta. Esses fatores limitam o uso do modelo de zebrafish para compreender os mecanismos subjacentes das patologias associadas à forma mais comum de TCE na população humana (lesões leves por força bruta).
Nosso objetivo foi desenvolver um modelo rápido e escalável de zebrafish TBI de força bruta que fornece caminhos para investigar a patologia da lesão, a progressão das sequelas do TCE e a resposta regenerativa inata. Modificamos a queda de peso do roedor Marmarou17 comumente usado e aplicamos-no a zebrafish adulto. Este modelo produz uma gama reprodutível de gravidades que variam de leve, moderada, a grave. Este modelo também recapitula múltiplas facetas da patologia do TCE humano, de forma dependente da gravidade, incluindo convulsões, edema, hematomas subdurais e intracerebrais, morte celular neuronal e déficits cognitivos, como aprendizado e prejuízo de memória. Dias após lesões, patologias e déficits se dissipam, retornando a níveis semelhantes a controles não danificados. Além disso, este modelo de zebrafish exibe uma resposta robusta de proliferação e regeneração neuronal através da neuroaxis em relação à gravidade da lesão.
Aqui, fornecemos detalhes para a configuração e indução de trauma por força bruta, pontuação de convulsões pós-traumáticas, avaliação de lesões vasculares, instruções sobre a preparação de seções cerebrais, abordagens para quantificar edema, e insights sobre a resposta proliferativa após lesão.

<table><tbody><tr><td>2-fenoxietanol</td><td>Sigma Alderich</td><td>77699</td><td></td></tr> <tr><td># 00 chumbo grosso</td><td>Remington</td><td>RMS23770</td><td>peso de 3,3g para chumbo grosso sTBI</td></tr> <tr><td># 3</td><td>Remington</td><td>RMS23776</td><td>peso de 1,5g para miTBI / moTBI</td></tr> <tr><td># 5 Dumont fórceps</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>5-etinil-2'-desoxiuridina</td><td>Life Technologies</td><td>A10044</td><td>EdU</td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 5 ml</td><td>VWR</td><td>66011-063</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit de Proliferação de Células Placa</td> de 12 poços <td>Life Technologies</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas super carregadas com carga positiva</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Super PAP Bloqueador de líquidos</td><td>Ted Pella</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>Meio de congelamento de tecidos</td><td>VWR</td><td>15148-031</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Lesões cerebrais traumáticas por força bruta (TCE) são a forma mais comum de traumatismo craniano, que abrange uma série de gravidades e resulta em efeitos secundários complexos e heterogênios. Embora não haja mecanismo para substituir ou regenerar os neurônios perdidos após um TBI em humanos, os zebrafish possuem a capacidade de regenerar neurônios em todo o seu corpo, incluindo o cérebro. Para examinar a amplitude das patologias exibidas em zebrafish após um TBI de força bruta e estudar os mecanismos subjacentes à resposta regenerativa neuronal subsequente, modificamos a queda de peso comumente utilizada de roedor Marmarou para o uso em zebrafish adulto. Nosso modelo de TCE de força bruta simples é escalável, induzindo um TBI leve, moderado ou grave, e recapitula muitos dos fenótipos observados após o TCE humano, como convulsões de contato e pós-traumático, edema, hematomas subdural e intracerebral, e prejuízos cognitivos, cada um exibido de forma dependente de lesões. As sequelas do TCE, que começam a aparecer poucos minutos após a lesão, diminuem e retornam a níveis de controle quase intactos dentro de 7 dias após a lesão. O processo regenerativo começa já em 48 horas após a lesão (hpi), com a proliferação de células máximas observada por 60 hpi. Assim, nosso modelo de TBI de força bruta de zebrafish produz patologias tbi primárias e secundárias características semelhantes às TBI humanas, o que permite investigar o início e a progressão da doença, juntamente com os mecanismos de regeneração neuronal que é exclusivo do zebrafish.

A preparação da plataforma de indução de lesões permite um meio rápido e simplista de fornecer um TBI escalável de força bruta aos zebrafish adultos. A gravidade classificada do modelo de lesão fornece várias métricas facilmente identificáveis de lesões bem sucedidas, embora a lesão vascular seja uma das patologias mais fáceis e proeminentes (Figura 3). A variedade de peixes utilizada durante a lesão pode tornar este indicador mais fácil ou mais difícil de identificar. Ao utilizar peixes...

Modificamos o modelo de queda de peso de Marmarou para o zebrafish adulto para examinar uma amplitude de patologias após lesão cerebral traumática por força bruta (TCE) e os mecanismos subjacentes à regeneração neuronal subsequente. Este modelo de TBI de força bruta é escalável, induz um TCE leve, moderado ou grave, e recapitula a heterogeneidade da lesão observada no TBI humano.

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Este protocolo fornece um método simples, rápido e reprodutível para induzir uma lesão cerebral traumática escalável em zebrafish adulto. Os zebrafish adultos que sofrem essa lesão cerebral traumática por força bruta apresentam muitas das características observadas em humanos que sofrem de uma TBI de força bruta. Demonstrando o procedimento estarão o Sr. James Hentig e a Sra. Kaylee Cloghessy, dois doutorandos do meu laboratório.Comece preenchendo uma placa de Petri com argila modeladora. Em seguida, use os dedos ou a parte de trás de um par de fórceps para criar uma plataforma elevada com argila de modelagem adicional. Divida a plataforma elevada longitudinalmente em duas metades aproximadamente iguais usando uma lâmina de barbear.Forme as duas metades em um canal, de tal forma que acomode o comprimento de um peixe adulto. Use argila adicional para construir paredes para proteger 2/3 do corpo de peixe com a cabeça exposta. Molde um pequeno suporte na região da cabeça exposta perpendicular às paredes para evitar rotação ou recuo da cabeça após o ferimento.Certifique-se de que os lados do canal não impeçam o peso caído. Use um mini furo para criar um disco de aço de 3 milímetros a partir de um pisca-pisca de aço de calibre 22. Coloque um peixe anestesiado sem resposta para a pinça de cauda no molde de argila dentro do canal com seu lado dorsal para cima para que seu corpo seja fixado nas laterais.Coloque o disco de aço de calibre 3 mm 22 na cabeça, centrado sobre o ponto de impacto desejado. Alinhe o peixe perpendicularmente para evitar que sua cabeça se incline para um lado, o que poderia causar um impacto desigual. Use um suporte de anel padrão e um grampo de braço para fixar o tubo de aço ou plástico, garantindo que ele seja reto, de modo que a parte inferior do tubo está 1,5 centímetros acima da cabeça do zebrafish.Olhe para baixo a tubulação para garantir que ela esteja alinhada acima da placa de aço. Escolha o rolamento adequado do esfera com base na gravidade desejada da lesão. Solte o rolamento da esfera de uma altura predeterminada para baixo da tubulação sobre a placa de aço.Em seguida, coloque os peixes feridos no tanque de recuperação para serem monitorados. Encha uma placa de Petri com argila modeladora e crie uma pequena cavidade para apoiar o corpo durante a dissecação. Coloque o peixe no molde de argila com o lado dorsal para cima.Coloque dois pinos de dissecção, um através da linha média no meio do corpo e outro cerca de 5 milímetros atrás da base da cabeça. Use um par de 5 fórceps Dumont para cortar sem rodeios o nervo óptico e remover os olhos. Coloque uma extremidade dos 5 fórceps sob a placa parietal direita.Faça uma ação deliberada de tesoura movendo-se em direção à extremidade rostral e remova a placa frontal direita. Em seguida, gire o peixe 90 graus no sentido horário. Coloque uma extremidade dos 5 fórceps sob a placa parietal esquerda e use o mesmo movimento da tesoura para remover as placas parietal e frontal esquerda, expondo todo o aspecto dorsal do cérebro.Use os 5 fórceps para transcessão direta da maxila de tal forma que as lâmpadas olfativas sejam preservadas e não danificadas. Usando os mesmos fórceps, remova o operáculo direito, o preopercle, o interopercle e o subóculo. Em seguida, ressecção direta da musculatura na extremidade caudal do calvério para expor a medula espinhal.Usando os fórceps, transcessão sem rodeios da medula espinhal. Coloque as fórceps cuidadosamente sob o cérebro e remova suavemente o cérebro do calvarium. Disseque todo o cérebro ou região de interesse usando as instruções do manuscrito do texto, e coloque o cérebro imediatamente em um pequeno barco de pesagem usando fórceps finos, tomando cuidado para não esfaquear ou raspar o cérebro.Transfira o cérebro para o barco de pesagem de secagem e regisse o peso úmido do cérebro. Oriente os cérebros para colocá-los no barco de pesagem com o lado dorsal virado para cima. Em seguida, coloque o cérebro e o barco de pesagem de secagem em um forno de hibridização definido a 60 graus Celsius por oito horas.Para transferir o cérebro para um novo pequeno barco de pesagem, uma vez que esteja seco, aperte os fórceps finos juntos e, começando pelo lado ventral do cérebro, colher em um movimento ascendente. Faça uma incisão parcial em uma esponja molhada. Coloque um peixe de cada vez na abertura com o lado ventral para cima e use uma agulha de calibre 30 para injetar aproximadamente 40 microliters de 10 milimôlares EdU no corpo do peixe.Em seguida, devolva o peixe para o tanque de retenção cheio de água do sistema. Colete os cérebros como mencionado anteriormente, e coloque-os como um grupo em um frasco de vidro de 9 mililitros contendo 2 mililitros de nove partes 100% etanol para uma parte 37% formaldeído. Conserte os cérebros a 4 graus Celsius em uma plataforma de roqueiro.Use um mandril criostat para incorporar os cérebros em TFM na orientação desejada sobre gelo seco. A lesão vascular foi considerada uma das patologias mais fáceis e proeminentes para identificar lesões bem sucedidas através deste modelo. A capacidade de identificar o indicador mudou com a cepa de peixes utilizada durante a lesão.A identificação de lesões vasculares no tipo AB selvagem foi difícil de distinguir entre TBI leve ou moderada e peixe de controle não danificado devido à pigmentação. Após a lesão, o peixe TBI leve apresentou escoriações mínimas da superfície, enquanto os peixes TBI moderados apresentaram hemorragia cerebral limitada. A extensão da lesão foi aparente em peixes TBI graves.Em contraste, a lesão vascular pode ser facilmente identificada ao usar peixe albino ou casper. O inchaço do cerebrum devido à lesão foi avaliado por edema. Em contraste, tanto o TCE moderado quanto o TCE grave apresentaram edema significativo, 1 dpi e 3 dpi, mas o teor fluido tanto de TBI moderado quanto de TCE grave retornou a níveis semelhantes a controles não danificados por 5 dpi.Esta lesão por força bruta resultou em uma resposta robusta de proliferação celular abrangendo a neuroaxis. O aumento da rotulagem edu foi observado nas zonas ventricular e subventricular do cérebro em comparação com controles não danificados. Os cérebros feridos apresentaram aumento da rotulagem edu na zona cinza periventricular, os lobos tectal ópticos, e aspectos do hipotálamo anterior em comparação com o cérebro de peixe não danificado.Após tce-TBI grave, regiões neurogênicas no cérebro traseiro apresentaram aumento da proliferação celular em comparação com o cérebro não danificado. Para a indução adequada da lesão, certifique-se de que os peixes estejam protegidos e estáveis no molde, e que a tubulação seja reta para evitar o impacto fora do centro ou alterar a trajetória de queda de peso. Este procedimento fornece um método de indução de lesão por força bruta rápida e econômica aplicado a um modelo regenerativo que seria especialmente aplicável para repetidos traumatismo craniano ou estudos regenerativos induzidos por lesões.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um método para investigar lesões cerebrais em larvas de peixe-zebra usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) em larga escala, uma técnica que combina elementos de microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para produzir imagens de alta resolução. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação de amostras e na aquisição de imagens STEM de alta resolução para identificar lesões cerebrais.

Investigando uma lesão cerebral larval de peixe-zebra usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura em larga escala

Neste vídeo, embriões fertilizados de peixe-zebra são descorionados sob um microscópio estéreo e depois expostos a um inibidor da síntese de colesterol, levando ao desenvolvimento de rupturas de vasos sanguíneos e hemorragias cerebrais nas larvas. As larvas hemorrágicas, identificáveis por manchas vermelhas distintas, são posteriormente separadas ao microscópio para análise posterior.

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Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Este artigo descreve um método para criar uma lesão mecânica do vaso em embriões de peixe-zebra. Este modelo de lesão fornece uma plataforma para estudar hemostasia, inflamação relacionada a lesões e cicatrização de feridas em um organismo ideal para microscopia em tempo real.

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Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.

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Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar ferimento de cérebro, deficits do locomotor e neuroinflammation depois do sangramento no cérebro em larvas do zebrafish, no contexto da hemorragia intracerebral humana (ICH).

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Este protocolo descreve os procedimentos para induzir lesão renal aguda (AKI) em zebrafish adulto usando cisplatina como um agente nefrotóxico. Detalhamos as etapas para avaliar a reprodutibilidade da técnica e duas técnicas para analisar inflamação e morte celular no tecido renal, citometria de fluxo e TUNEL, respectivamente.

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.

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Este protocolo descreve um modelo de criolesão para induzir danos profundos de vários miômeros caudais em zebrafish adultos. Este método fornece uma nova abordagem para o estudo da regeneração muscular esquelética após perda severa de tecido em vertebrados não mamíferos.

Modelo de criolesão para o estudo da regeneração muscular esquelética do pedúnculo caudal em zebrafish adulto

Este protocolo oferece um método para estudar a dinâmica celular usando uma técnica simples de cultura in vitro . Ele oferece uma oportunidade para pesquisadores e educadores de peixes-zebra estudarem processos celulares, como aqueles relacionados à homeostase óssea e biologia celular básica, visualizando núcleos fluorescentes e células apoptóticas dentro das escamas.

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Aprenda a induzir lesão traumática craniana por força bruta em zebrafish adulto usando um modelo de queda de peso escalável. Este método permite estudar patologias e mecanismos de regeneração neuronal pós-lesão.

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

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