Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Cada neurônio no cérebro está conectado com outras células neuronais por aproximadamente 7.000 sinapses. Exceto que essas sinapses no cérebro dos mamíferos estão principalmente localizadas nas pequenas saliências da membrana chamada colunas dendríticas. Plasticidade das sinapses e espinhas dendríticas e afins, funções cerebrais importantes como aprendizado e processos de memória.

É importante notar que apenas a microscopia eletrônica dá uma visão completa se uma coluna dendrítica tem uma entrada postsináspica. Várias técnicas de imagem de colunas dendríticas estão disponíveis. No entanto, a microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais dá uma possibilidade única de imagem de grande volume de tecido com alta resolução.

A técnica de microscopia eletrônica de varredura baseada em blocos em série requer um protocolo especial de preparação da amostra que envolve forte contraste com metais pesados. Minha fixação primária durante a perfusão nos permitiu usar os mesmos cérebros para microscopia eletrônica iluminada. Os ratos foram sacrificados e perfundidos com um leve fixador primário.

O cérebro foi cortado em metades e um hemisfério foi post fixado com imunofluorescência dedicada fixa, crioprotetor, fatiada usando um criostat e processada para estudos de imunofluorescência. Onde o outro hemisfério foi pós-fixado com microscopia eletrônica fixa, fatiado com o vibratome e preparado para estudos de microscopia eletrônica. As fatias cerebrais para estudos de microscopia eletrônica de varredura baseada em blocos seriais foram contrastadas, planas embutidas em resina, então uma região de CA1 do hipocampo foi montada no pino e imagem com o microscópio eletrônico de varredura baseado em blocos seriais.

A parte do protocolo destacada em uma caixa amarela foi destaque no vídeo. Pegue o tecido, que foi fixado e cortado em 100 fatias microbióticas e lave-o com tampão de fosfato frio cinco vezes por três minutos cada. Prepare uma mistura de 4%tetroxida de mossmium e ferrocianida de 3% de potássio.

O produto final ficará marrom. Mergulhe as amostras nesta mistura. Em seguida, coloque as amostras no gelo.

E a partir deste estágio é importante protegê-los da luz. Incuba-os com agitação suave por uma hora. Enquanto isso, prepare a solução TCH.

Misture 10 mililitros de água dupla destilada e 0,1 grama de TCH. Coloque-o em um forno a 60 Celsius por uma hora. É importante fazer a solução de tempos em tempos.

Quando estiver pronto, esfrie-o à temperatura ambiente. Agora lave as amostras com água dupla destilada cinco vezes por três minutos cada e, em seguida, mergulhe-as na solução TCH filtrada. As fatias ficarão pretas.

Incuba-os por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave as amostras com água destilada dupla cinco vezes por três minutos cada e incuba-as com 2%de tetroxida de ósmio por 30 minutos, desta vez em temperatura ambiente. Novamente, lave as amostras com água dupla destilada cinco vezes por três minutos cada e coloque-as em acetato filtrado de 1%ou amilase.

Incubar-os a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, comece com a preparação de D-aspartate. Misture o nitrato de chumbo com a solução de ácido aspartílico pré-aquecida a 60 graus Celsius.

Coloque a mistura em um banho de água ajustado a 60 graus Celsius e ajuste o pH para 5,5 com um hidróxido de sódio molar. Feche o frasco com aspartato de chumbo e deixe-o em 60 graus Celsius por 30 minutos. A solução deve ser clara.

Se ficar nublado, deve ser descartado e um novo precisa ser preparado. Enquanto isso, lave as amostras com o gás duplamente destilado água cinco vezes por três minutos cada e mantenha-as no forno a 60 graus Celsius por 30 minutos. Mergulhe as amostras na solução de aspartato de chumbo recém-preparada e incuba-las no forno a 60 graus Celsius por 20 minutos.

Prepare resina epóxi. Pesar os ingredientes e misture bem a resina por pelo menos 30 minutos antes de adicionar o acelerador DMP 30. Prepare o vírus com diluição de grau de etanol.

Em seguida, retire as amostras do forno e lave-as novamente com água destilada dupla cinco vezes por três minutos cada. Enquanto isso, misture a resina com 100% de etanol em proporção de um para um para obter a resina de 50%. Misture bem.

Na sequência, desidrate as amostras em cada diluição do etanol por cinco minutos. Lembre-se que as amostras nunca devem secar completamente. Infiltrar as amostras primeiro em 50% de resina por 30 minutos, em seguida em 100% de resina por uma hora, e depois novamente em uma resina fresca de 100% durante a noite.

No dia seguinte, coloque as amostras em resina fresca de 100% por uma hora e, em seguida, incorpore-as entre folhas de incorporação de fluoropolímeros. Prepare peças de folha de incorporação que foram desartadas com etanol e coloque de lado as lâminas de vidro que serão usadas como suporte. Coloque um pedaço de folha de incorporação em um slide de vidro, coloque uma gota de resina sobre ele e, em seguida, transfira a amostra cuidadosamente com o uso de vara de madeira.

Cubra com a segunda peça. Tente evitar bolhas de ar. Seja gentil, pois o tecido é muito frágil.

Coloque cuidadosamente outro deslizamento de vidro em cima da peça da folha de incorporação e cure a amostra no forno a 70 graus Celsius por pelo menos 48 horas. Separe as camadas e corte um pedaço da amostra embutida com uma lâmina de barbear. Transfira para a parafina.

Isso minimizará o perigo de perder a amostra devido à eletrostática. Pegue um pino de alumínio que foi des graxa com etanol. Misture bem um epóxi condutivo e use um pouco de quantidade para montar a amostra no pino.

Curar epóxi condutivo a 70 graus Celsius por 10 minutos. Corte cada lado do bloco de amostra com a faca de diamante e, em seguida, polir a face do bloco até que o tecido seja exposto. Aterrar a amostra no pino usando tinta condutiva e curá-la.

Para minimizar o carregamento, as amostras também devem ser vistas revestidas com uma fina camada de ouro ou paládio dourado. Coloque o pino com a amostra na câmara do microscópio eletrônico de varredura baseado em blocos seriais. Alinhe a amostra à faca e feche a câmara e defina os parâmetros.

Colete uma pilha de imagens. Usando o método descrito, foram obtidas imagens de tecido cerebral do camundongo. A grande imagem do hipocampo de uma região foi tirada e a imagem foi definida no centro do radiador de estrato.

Uma pilha de imagens foi adquirida e segmentos os objetos de interesse, como colunas dendríticas e sinapses. A morfologia tecidual de boa qualidade foi obtida com membranas claramente visíveis e vesículas sinápticas e mitocôndrias bem preservadas. Estudos imunofluorescentes de anticorpos PSD 95 confirmaram que fixação primária leve e fixação tradicional com 4%PFA dão resultados comparáveis.

O protocolo apresentado permite a aquisição de imagens de tecido cerebral com o uso de microscopia eletrônica de varredura baseada em blocos seriais, morfologia tecidual de alta qualidade e 12 membranas visíveis facilitam 10 segmentações e reconstrução corretas. Minha fixação primária possibilitou o uso dos mesmos cérebros para análise da imunofluorescência PSD 95 e da microscopia eletrônica de colunas dendríticas. Aqui usamos PSE 9.500 brotando.

No entanto, o outro também pode ser usado.