Name: Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprenda transformação germinativa hiperativa em Spodoptera frugiperda usando o sistema piggyBac. Este método eficiente permite avanços na genômica funcional e no controle genético de pragas agrícolas.

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A pesquisa relatada é apoiada pela National Science Foundation I/UCRC, o Center for Arthropod Management Technologies, sob o Grant No IIP-1821936 e por parceiros da indústria, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e o National Institute of Food and Agriculture, Departamento de Agricultura dos EUA (2019-67013-29351 e 2353057000).

1. Síntese in vitro de hipPBase mRNA
NOTA: A sequência completa de codificação da sequência hyPBase foi sintetizada e inserida em um vetor pTD1-Cas9 (ver a Tabela de Materiais) para produzir a construção pTD1-hyPBase, que contém um expresso em hyPBase, promotor T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). A sequência completa da construção pTD1-hyPBase está prevista no Material Suplementar.
<ol><li>Preparação do modelo para síntese in vitro<ol>
<li>Execute uma reação pcr para amplificar o de expressão hyPBase usando um primer para a frente, 5'- atgcggtgtgaaccgcacagatgcg-3', e um primer reverso de 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerase de alta fidelidade e plasmídeo pTD1-hyPBase como um modelo. NOTA: A reação do PCR (volume final de 50 μL) contém 5,0 μL de tampão de reação de 10x, 4,0 μL de triphosfato de desoxicosídeo de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL de alta fidelidade polmerase, 1,0 μL cada um dos primers dianteiros e invertidos de 10 μM e 33 μL de água sem nuclease. As configurações foram as seguintes: uma incubação inicial de 95 °C para 3 min, seguida por 35 ciclos de 98 °C para 10 s, 60 °C para 15 s e 68 °C para 2 min.</li>
		<li>Verifique o produto PCR em um gel de 1% de agarose a 120 V em tampão fresco de ácido tetraacético Tris-acetato-etilenodiamina (TAE) por 30 min e purifique o produto com o kit de extração de gel. NOTA: Não utilize o kit de purificação do produto PCR. Mesmo uma quantidade de traço do plasmídeo pTD1-hyPBase diminui significativamente a eficiência da síntese in vitro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Síntese in vitro do hippbase mRNA usando um kit comercial<ol>
<li>Descongele completamente os reagentes congelados, mantenha a enzima e a solução NTP/CAP 2x no gelo e deixe o tampão de reação desoçado em temperatura ambiente.</li>
		<li>Monte a reação à temperatura ambiente adicionando os seguintes componentes: solução 2x NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampão de reação: 2 μL; DNA do modelo: 0.1-0.2 μg; Mistura de enzimas: 2 μL; Água sem nuclease a 20 μL.</li>
		<li>Misture bem os reagentes, encanar suavemente a mistura para cima e para baixo e incubar a 37 °C por 2-4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperação do mRNA sintetizado por precipitação de cloreto de lítio<ol>
<li>Adicione 30 μL de Solução de Precipitação LiCl, misture bem apertando o tubo e, em seguida, mantenha -20 °C por ≥ 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a 4 °C por 15 min na velocidade máxima e remover cuidadosamente o sobrenatante.</li>
		<li>Lave a pelota uma vez com 1 mL de 70% de etanol, reclímfusuga e remova o sobrenante cuidadosamente.</li>
		<li>Seque a pelota à temperatura ambiente por 1-2 min e, em seguida, resuspenque a pelota com 20-40 μL de água sem nuclease.</li>
		<li>Diluir 1 μL de solução mRNA com 9 μL de água sem nuclease. Tome 2 μL para determinar a concentração de mRNA e use 8 μL para verificar a qualidade do mRNA em um gel de 1% de agarose a 100 V em tampão TAE fresco por 40 minutos.</li>
		<li>Aliquot a solução mRNA e armazene congelado a -70 °C por até um ano. NOTA: Não seque completamente a pelota de mRNA; pode ser mais difícil dissolvê-lo na água.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Microinjeção
<ol><li>Coleta de ovos<ol>
<li>Coloque 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Cubra a caixa com uma toalha de papel. Coloque uma solução de sacarose de 10% na caixa para alimentar adultos.</li>
		<li>No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite.</li>
		<li>No dia 3 após a eclosão, transfira os adultos da etapa 2.1.2 para um lugar escuro. Recolher os embriões dentro de 2h após a oviposição.</li>
		<li>Adicione gotas de água ao pedaço de uma toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro. Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuração de microinjeção<ol>
<li>Injete uma mistura de uma proteína fluorescente verde transgênica (EGFP) expressando plasmídeo (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hipPBase mRNA (200 ng/μL) e água destilada estéril nos ovos, usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado (ver a Tabela dos Materiais).</li>
		<li>Mantenha os ovos injetados a 27 ± 1 °C, 60 ± umidade relativa até chocar.</li>
		<li>Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial e transfira cada larva para um pequeno copo no estágioinstar 3 no início (~6 mm de comprimento, e a cor do corpo fica preta).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Triagem de fluorescência e travessia genética
<ol><li>Colete a pupae e coloque ~150 pupas fêmeas e ~150 pupas machos em uma gaiola de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Pendure vários pedaços de toalhas de papel (~30 cm x 15 cm) na gaiola para coletar os ovos.</li>
	<li>Recolhe as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% de umidade relativa até eclodir.</li>
	<li>Mantenha as larvas de nénato a 4 °C por 5 minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada.</li>
	<li>Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um estereóscópio de fluorescência. Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal em ~2 semanas a 27 ± 1 °C, e separe-os por sexo de acordo com as diferenças de fenótipo nos segmentos do abdômen ventral. NOTA: A pupa fêmea tem uma abertura genital semelhante à fenda no oitavo segmento abdominal e as margens cefálicas do nono e décimo segmentos curvados em direção à abertura genital. A abertura genital da pupa masculina tem uma leve elevação no nono segmento abdominal.</li>
	<li>Coloque a pupae EGFP-positiva e a pupae do tipo selvagem do sexo oposto em um macho: proporção feminina de 1:1 em uma gaiola. Sib-cross os adultos expressos do EGFP para produzir as gerações seguintes.</li>
</ol>4. Detecção de PCR de inserção transgênica
<ol><li>Extrair DNA genômico das larvas individuais do tipo selvagem e EGFP positivo usando qualquer kit de extração de DNA genômico comercial seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Realizar uma reação pcr usando o DNA genômico como modelo; um primer avançado, 5'-acgtacgctccccctgtgttccgttc-3' localizado na região promotora ie1; e um primer reverso, 5'-aagcactacccgtaggtcag-3' localizado na região EGFP do vetor de transformação.</li>
	<li>Configure cada reação pcr (volume final de 40 μL) para conter 20 μL da mistura de polimerase, 1,0 μL de DNA genômico (40 μg/μL), 1,0 μL cada um dos primers dianteiros e reversos de 10 μM e 17 μL de água sem nuclease. Use as seguintes configurações: uma incubação inicial de 95 °C para 3 min, seguida por 35 ciclos de 95 °C para 20 s, 56 °C para 20 s e 68 °C para 40 s.</li>
	<li>Verifique os produtos PCR em um gel de 1% agarose a 120 V por 30 min.</li>
</ol>5. Determinação do local de inserção transgênica
<ol><li>Realize tail-PCR de alta eficiência usando DNA genômico como modelo para determinar o local de integração da inserção transgênica nos insetos positivos do EGFP.<ol>
<li>Execute as reações do PCR seguindo as etapas descritas em outros lugares9.<ol>
<li>Use três primers, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacacgcc-3', P2: 5'tcacgggagctccaagcggcgactg-3', e P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggcgcgct-3', que são específicos para o vetor piggyBac, nas 3 rodadas de reação pcr, respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequencie os produtos pcr finais para determinar o local de integração.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transformation+with+piggyBac%3A+getting+the+number+of+injections+just+right%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A baixa taxa de transposição e a dificuldade de entregar componentes transgênicos em embriões frescos limitam o sucesso da transformação germinal em muitos insetos não-modelo, especialmente aqueles da ordem, Lepidoptera. Para aumentar a taxa de transformação germinal, foi desenvolvida uma versão hiperativa da transposase de piggyBac mais utilizada (hyPBase)7,10. Até o momento, a transformação germinal bem sucedida em insetos lepidopteranos é relatada pri...

O verme do exército de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,é nativo de regiões tropicais e subtropicais da América. Atualmente, este é um herbívoro de insetos devastador em mais de 100 países em todo o mundo1. As larvas faw se alimentam de mais de 350 plantas hospedeiras, incluindo algumas importantes culturas alimentaresbásicas 2. A forte capacidade migratória dos adultos da FAW contribui para sua recente rápida disseminação das Américas para outros lugares1,2. Como resultado, este inseto está ameaçando a segurança alimentar internacionalmente. A aplicação de novas tecnologias pode facilitar estudos avançados na FAW e fornecer novas estratégias para gerenciar essa praga.
A transformação da germinação de insetos tem sido usada para estudar a função genética e gerar insetos transgênicos para uso no controle genético3,4. Entre os vários métodos utilizados para alcançar a transformação genética em insetos, o método baseado em elementos piggyBac é o método mais utilizado5. No entanto, devido à baixa taxa de transposição, ainda é desafiador realizar transgênese em insetos não modelo. Recentemente, uma versão hiperativa de piggyBac transposase (hyPBase) foi desenvolvida6,7. A transformação germinal foi alcançada na FAW recentemente8, que é o primeiro relatório que utilizou o hyPBase em insetos lepidopteranos. Neste relatório, são descritas informações detalhadas sobre a contratação de mRNA hipPBase na geração de FAW transgênicos. O método aqui descrito poderia ser aplicado para alcançar a transformação de outros insetos lepidopteranos.

<table><tbody><tr><td>Rolos de Algodão Dentais de 1,5"</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>RAISING</td></tr><tr><td>1 oz Tampas de Copo de Soufflé</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 oz Copos de Soufflé</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>RAISING</td></tr><tr><td>48 oz Recipientes de Plástico</td><td>Deli Genpack</td><td>AD48</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Conjunto de Filtros Adicionais (Verde)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Vidro de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>INJEÇÃO</td></tr><tr><td>Vidro de borosilicato</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Featherweight Forceps</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Gutter Guard</td><td>ThermWell Products</td><td>VX620</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Inverted Microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>INJEÇÃO</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>INJEÇÃO</td></tr><tr><td>Micropipeta Extrator</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>INJEÇÃO Lâminas</td></tr><tr>de<td>Microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>INJEÇÃO</td></tr><tr><td>NightSea Sistema Completo NightSea</td><td>LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td></td></tr><tr><td>TRIAGEM Nitrogênio Gás</td><td>AWG/ Toalhas de Papel Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td></td><td>Bounty</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>CRIAÇÃO</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Dieta Artificial</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [Solicitar Espécie/Quantidade]</td><td>RECRIAÇÃO</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Ovos Benzon</td><td>Research, Inc</td><td>N/A [Solicitar Espécie/Quantidade]</td><td>CRIAÇÃO</td></tr><tr><td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td><td>mistura de polimerase</td></tr></tbody></table>

transformação germline hiperativa da transposase mediada pela transposase no verme do exército de outono, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

A inserção estável da carga genética em genomas de insetos usando elementos transposáveis é uma poderosa ferramenta para estudos genômicos funcionais e desenvolvimento de estratégias genéticas de manejo de pragas. O elemento transposável mais usado na transformação de insetos é o piggyBac, e a transformação germinal baseada em piggyBactem sido conduzida com sucesso em insetos modelo. No entanto, ainda é desafiador empregar essa tecnologia em insetos não-modelo que incluem pragas agrícolas. Este artigo relata a transformação germinal de uma praga agrícola global, a minhoca de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,usando a transposase hiperativa piggyBac (hyPBase).
Neste trabalho, o mRNA hyPBase foi produzido e utilizado no lugar de plasmídeo de ajudante em microinjeções de embriões. Essa mudança levou à geração bem sucedida de FAW transgênico. Além disso, também são descritos os métodos de triagem de animais transgênicos, a detecção rápida da inserção transgênica baseada em PCR e a determinação assimétrica do local de integração. Assim, este artigo apresenta um protocolo para produzir FAW transgênico, o que facilitará a transgênese baseada em piggyBacna FAW e outros insetos lepidopteranos.

Uma construção para a expressão do promotor T7 contendo hippBase: poliedrin-5'UTR: hyPBase: poliedrin-3'UTR: poly (A) sinal foi gerado(Figura 1A) e amplificado como um fragmento de PCR ~2,2 kb para sintetizar hipPBase mRNA in vitro (Figura 1B). Em seguida, o mRNA hyPBase foi produzido e submetido à eletroforese de gel agarose. O mRNA do tamanho esperado (~1,1 kb de banda) foi detectado em um gel de 1% de agarose(Figura 1C)....

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Este protocolo mostra a produção de transgênicos Fall Armyworm usando sistema de transformação baseado em piggyBac. Esperamos que esses métodos beneficiem a melhoria da transformação, não apenas no Verme do Exército de Outono, mas também insetos lepidopteranos. O método descrito aqui torna eficiente a transformação germinal de insetos pestes lepidopteranos.Xien Chen, pós-doutorando no meu laboratório. Comece colocando 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa. Coloque uma solução de 10% de sacarose na caixa para alimentar adultos.Cubra a caixa com uma toalha de papel. No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite. No terceiro dia pós-eclosão, transfira os adultos para um lugar escuro.Colete os embriões dentro de duas horas após a posição. Adicione gotas de água ao pedaço da toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro.Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção. Injete uma mistura de 200 nanogramas por microliter e EGFP à base de co-doença, 200 nanogramas por microliter hiperativo piggyBac transposase mRNA, e água destilada estéril nos ovos usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado. Mantenha os ovos injetados em 27 mais ou menos um grau Celsius, 60 mais ou menos 10% de umidade relativa até eclodir.Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial, e transfira cada larva para uma pequena xícara no estágio inicial de coalhada e estrela. Recolhe a pupa e coloca aproximadamente 150 fêmeas e 150 pupas machos em uma gaiola. Pendure vários pedaços de papel toalhas de 30 centímetros por 15 centímetros de tamanho na gaiola para coletar os ovos.Colete as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos em condições adequadas até chocar. Mantenha as larvas de nénato a quatro graus Celsius por cinco minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada. Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um microscópio estéreo de fluorescência.Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal, em cerca de duas semanas a 27 mais ou menos um grau Celsius. O hiperativo piggyBac transposase mRNA sintetizado in vitro foi detectado usando um gel de 1%Agarose. Os embriões injetados pelo PDS não apresentaram sinal de EGFP, enquanto os embriões de transposição de combísmo e hiperativos de combísmo de combísmo de co-pDA apresentaram fluorescência EGP, indicando que a construção do piggyBac foi bem sucedida.As larvas do G1 obtidas a partir de ovos resultantes de uma auto-cruz de adultos G0 apresentaram forte sinal EGFP. Um fragmento contendo o promotor e o fragmento EGFP foi amplificado com sucesso usando o DNA genômico isolado das larvas positivas do EGFP como modelo. No entanto, o mesmo fragmento não foi detectado quando o DNA genômico foi isolado das larvas do tipo selvagem como modelo.Os ovos para microinjeção devem ser o mais frescos possível e devem ser sempre mantidos no gelo antes da microinjeção para retardar seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores responderem perguntas sobre genômica funcional de insetos de pragas e desenvolverem métodos de controle genético para esta praga global.

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

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JoVE Journal

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Biologia

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Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

O kit de ferramentas genômicas funcionais para os nematoides parasitéticos Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti inclui transgênese, mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 e RNAi. Este protocolo demonstrará como usar a microinjeção intragonadal para introduzir componentes transgenes e CRISPR em S. stercoralis e S. ratti.

Geração de Transgênicos e Nocautes em Espécies Strongyloides por Microinjeção

Aprenda transformação germinativa hiperativa em Spodoptera frugiperda usando o sistema piggyBac. Este método eficiente permite avanços na genômica funcional e no controle genético de pragas agrícolas.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

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