Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda
23 de setembro de 2021
A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.
Este protocolo mostra a produção de transgênicos Fall Armyworm usando sistema de transformação baseado em piggyBac. Esperamos que esses métodos beneficiem a melhoria da transformação, não apenas no Verme do Exército de Outono, mas também insetos lepidopteranos. O método descrito aqui torna eficiente a transformação germinal de insetos pestes lepidopteranos.
Xien Chen, pós-doutorando no meu laboratório. Comece colocando 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa. Coloque uma solução de 10% de sacarose na caixa para alimentar adultos.
Cubra a caixa com uma toalha de papel. No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite. No terceiro dia pós-eclosão, transfira os adultos para um lugar escuro.
Colete os embriões dentro de duas horas após a posição. Adicione gotas de água ao pedaço da toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro.
Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção. Injete uma mistura de 200 nanogramas por microliter e EGFP à base de co-doença, 200 nanogramas por microliter hiperativo piggyBac transposase mRNA, e água destilada estéril nos ovos usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado. Mantenha os ovos injetados em 27 mais ou menos um grau Celsius, 60 mais ou menos 10% de umidade relativa até eclodir.
Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial, e transfira cada larva para uma pequena xícara no estágio inicial de coalhada e estrela. Recolhe a pupa e coloca aproximadamente 150 fêmeas e 150 pupas machos em uma gaiola. Pendure vários pedaços de papel toalhas de 30 centímetros por 15 centímetros de tamanho na gaiola para coletar os ovos.
Colete as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos em condições adequadas até chocar. Mantenha as larvas de nénato a quatro graus Celsius por cinco minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada. Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um microscópio estéreo de fluorescência.
Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal, em cerca de duas semanas a 27 mais ou menos um grau Celsius. O hiperativo piggyBac transposase mRNA sintetizado in vitro foi detectado usando um gel de 1%Agarose. Os embriões injetados pelo PDS não apresentaram sinal de EGFP, enquanto os embriões de transposição de combísmo e hiperativos de combísmo de combísmo de co-pDA apresentaram fluorescência EGP, indicando que a construção do piggyBac foi bem sucedida.
As larvas do G1 obtidas a partir de ovos resultantes de uma auto-cruz de adultos G0 apresentaram forte sinal EGFP. Um fragmento contendo o promotor e o fragmento EGFP foi amplificado com sucesso usando o DNA genômico isolado das larvas positivas do EGFP como modelo. No entanto, o mesmo fragmento não foi detectado quando o DNA genômico foi isolado das larvas do tipo selvagem como modelo.
Os ovos para microinjeção devem ser o mais frescos possível e devem ser sempre mantidos no gelo antes da microinjeção para retardar seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores responderem perguntas sobre genômica funcional de insetos de pragas e desenvolverem métodos de controle genético para esta praga global.
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Visão Geral
Este estudo demonstra um protocolo para transformação da linhagem germinativa bem-sucedida na lagarta-do-cartucho, Spodoptera frugiperda, utilizando um sistema de transformação baseado em piggyBac. O método promete eficiência aprimorada de transformação em pragas lepidópteras e potencializa a pesquisa em genômica funcional nesses organismos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Engenharia genética em insetos-praga
- Técnicas de biologia transformacional
- Aplicações de genômica funcional
Contexto
- A lagarta-do-cartucho é uma praga agrícola significativa.
- O sistema de transposon piggyBac é conhecido por sua eficiência na entrega de genes.
- A melhoria da transformação da linhagem germinativa é crucial para estratégias de controle de pragas.
Métodos Utilizados
- Microinjeção de ovos com plasmídeo piggyBac e mRNA
- Spodoptera frugiperda como modelo biológico
- Microscopia de fluorescência para triagem de larvas transgênicas
Resultados Principais
- A expressão bem-sucedida de EGFP em larvas transgênicas demonstrou a funcionalidade do sistema piggyBac.
- A expressão de EGFP foi verificada por meio da amplificação de DNA genômico, distinguindo larvas transgênicas de larvas selvagens.
- A técnica de transformação mostrou-se eficiente para a produção de insetos-praga geneticamente modificados.
Conclusões
- O estudo estabelece um método robusto para transformação germinativa em Spodoptera frugiperda.
- Os achados contribuem para o avanço de medidas de controle genético de pragas agrícolas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de uma transformação germinativa eficiente em pragas agrícolas, como a lagarta-do-cartucho, permite a genômica funcional para validação de alvos e redução de riscos mecanicistas em pipelines de controle de pragas. Este protocolo auxilia na descoberta precoce ao fornecer um sistema escalonável para investigar a função gênica e avaliar os resultados fenotípicos em um modelo de inseto relevante para doenças. A transgênese bem-sucedida facilita a triagem posterior e a descoberta de biomarcadores para estratégias de manejo genético de pragas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de genes de pragas para validar alvos em estratégias de controle genético.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para gerar linhagens transgênicas destinadas à avaliação consistente de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar a interrupção gênica a efeitos fenotípicos em um modelo de praga.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera linhagens com repórter fluorescente para triagem de alto rendimento de perturbações genéticas.
- Valor Operacional: Permite genotipagem padronizada baseada em PCR e TAIL-PCR para validação de sítios de inserção.
- Prontidão para Ensaios: Produz linhagens transgênicas estáveis adequadas para triagem de compostos e ensaios fenotípicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a validação gênica na fase de descoberta à avaliação pré-clínica de mecanismos de controle genético.
- Avanço Ajustado ao Risco: Facilita a avaliação da essencialidade gênica e do impacto fenotípico antes da aplicação em campo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação de marcadores genéticos associados a características de suscetibilidade ou resistência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a validação de alvos por meio de transgênese, apoiar a identificação de compostos líderes por meio de triagem fenotípica e orientar decisões pré-clínicas por meio de modelos genéticos estáveis.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a interrupção gênica ou superexpressão em lagarta-do-cartucho para avaliar a relevância do alvo.
- Triagem: Gera linhagens transgênicas padronizadas para triagem reprodutível de moduladores genéticos ou químicos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de PCR e fluorescência para medir a integração do transgene e os níveis de expressão.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta da função gênica à avaliação pré-clínica de abordagens de controle genético de pragas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de transgênese reutilizável, aplicável a diversas espécies de pragas lepidópteras, para validação de alvos em toda a carteira de projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio da manipulação genética direta em um modelo de praga.
- Valor Operacional: Oferece um sistema de transgênese escalável e reprodutível, com protocolos padronizados de microinjeção e triagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos, reduzindo a incerteza biológica quanto à essencialidade do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação fenotípica in vivo em um modelo de praga.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em embriologia de insetos e técnicas de microinjeção.
- Requer microinjetor automatizado, microscópio estereoscópico de fluorescência e equipamentos de PCR para validação.
- Exige protocolos padronizados para coleta de embriões, condições de injeção e triagem de transgênicos entre equipes.
- Requer adaptação dos protocolos de temperatura, umidade e dieta para diferentes espécies de lepidópteros.
- Depende da qualidade e frescor dos embriões, com a eficiência da microinjeção influenciada pelo estágio de desenvolvimento.
