Name: Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a medir o turnover lipídico da membrana usando a sonda fluorescente ND6 sensível ao pH em neurônios vivos. Este método permite monitorar dinamicamente a exocitose e endocitose com alta precisão.

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Este trabalho foi apoiado pela Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) e NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

O protocolo a seguir inclui (1) um procedimento simplificado para estabelecer culturas hipocampais e corticais de camundongos com base em um protocolo bemestabelecido22, (2) uma breve introdução a uma instalação de microscópio de epifluorescência para neurônios vivos, (3) uma descrição detalhada da carga e imagem de ND6 em neurônios de camundongo, (4) uma discussão sobre a quantificação do tráfego de membrana pelo sinal ND6. Todos os procedimentos seguem as diretrizes de biossegurança e IACUC da Florida Atlantic University. A síntese de ND6 já foi descritaanteriormente20.
1. Preparação das culturas hipocampal e cortical de camundongos
NOTA: Se não especificado de outra forma, todas as etapas devem ser executadas em uma capela de fluxo laminar nível 2 de biossegurança. Esterilizar todas as ferramentas e materiais.
<ol><li>Use pinças de tamanho 5 para colocar tampas de vidro em placas de cultura multipoço. NOTA: Por exemplo, uma placa de 24 poços é ideal para lamínulas de 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> .</li>
	<li>Adicionar o volume apropriado de matrizes extracelulares para revestir a superfície de cultura celular (por exemplo, 75 μL de solução de matriz de membrana basal por lamínula de 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> ; ver Tabela de Materiais)</li>
	<li>Colocar as placas preparadas na incubadora de cultura de tecidos (5% CO2, 100% de umidade e 37 °C) por 1-4 h para permitir a reticulação da matriz da membrana basal.</li>
	<li>Sacrificar os animais, abrir o crânio e transferir todo o cérebro para uma placa de Petri de 35 mm com 3 mL de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contendo 20% de soro fetal bovino (H+20). Corte o cérebro ao longo da linha média e separe os córtices e hipocampos em uma capela de dissecção de fluxo laminar para reduzir a contaminação.</li>
	<li>Use microtesouras para cortar os tecidos em pequenos pedaços (~1 mm3). Transfira esses tecidos para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de H+20.</li>
	<li>Lavar os tecidos três vezes com 5 mL de H+20 e três vezes com 5 mL de HBSS.</li>
	<li>Adicionar 1,5 ml de tripsina a 1% com ácido etilenodiaminotetracético e incubar a 37 °C durante 10 minutos para digestão enzimática.</li>
	<li>Repita o passo 1.6 e utilize o vácuo para aspirar HBSS no final.</li>
	<li>Dissociar os tecidos mecanicamente em 1 mL de HBSS contendo 2,95 g/L de MgSO4•7H2O usando uma pipeta de vidro polido a fogo.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 400 × g, 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume apropriado de meio de cultura para obter uma concentração de ~10.000.000 células/ml.</li>
	<li>Plaquear as células a ~1.000.000 células/cm2 e colocar a cultura na incubadora (5% CO2, 100% de umidade e 37 °C) por 1-4 h para facilitar a fixação das células às lamínulas de vidro.</li>
	<li>Adicione um volume apropriado de meio de cultura (por exemplo, 1 mL por poço para uma placa de 24 poços). Adicione o mesmo volume de meio de cultura após 1 semana. Após 2 semanas, substitua metade do meio de cultura existente por meios frescos a cada semana.</li>
</ol>2. Configuração do microscópio para imagens de fluorescência de células vivas
NOTA: Uma configuração de imagem exemplar (Figura 5) inclui pelo menos um microscópio de fluorescência invertida (consulte a Tabela de Materiais), fonte de luz de fluorescência com obturador automático, conjuntos de filtros de fluorescência (por exemplo, para geração de imagens ND6, use 405/10 BP para excitação, 495 LP para dicroico e 510/20 BP para emissão) e uma câmera de alta sensibilidade (Tabela de Materiais), todos controlados por software de aquisição de imagens (Tabela de Materiais).
<ol><li>Prepare uma câmara de imagem que permita o controle de temperatura e a entrada/saída de solução para imagens de fluorescência de células vivas. NOTA: Por exemplo, uma câmara de imagem de banho aberto modificada fixada em uma plataforma de aquecimento foi usada neste protocolo (Figura 6).</li>
	<li>Configure um dispositivo programável para alternar as soluções de perfusão e fornecer o estímulo elétrico em pontos de tempo definidos durante a aquisição de imagens. NOTA: A sincronização de hardware e software é necessária para análises quantitativas (Figura 7). Por exemplo, nesse protocolo, uma saída de gatilho da câmera de imagem foi usada para iniciar um programa de computador que controla um dispositivo de comutação automática, que controla um sistema de perfusão multicanal e um estimulador de pulso quadrado.</li>
	<li>Para co-imagear dois ou mais repórteres fluorescentes, execute imagens de fluorescência multicanal alternando sequencialmente conjuntos de filtros ou dividindo simultaneamente diferentes emissões de fluorescência e projetando para a mesma câmera.</li>
</ol>3. Carregamento e obtenção de imagens ND6 em culturas neuronais
<ol><li>Pesar uma quantidade adequada de ND6, dissolvê-lo em dimetilsulfóxido (DMSO) e deixá-lo solubilizar à temperatura ambiente; sonicar brevemente (por exemplo, 3 min). Filtrar a solução-mãe bruta utilizando um filtro de 0,22 μm para remover grandes agregados corantes. Após filtração, determinar a concentração do corante por espectroscopia de absorção a 405 nm usando um espectrofotômetro convencional ou de microvolume usando ε = 10.700 M-1 cm-1.</li>
	<li>Antes da aplicação, diluir a solução-mãe até uma concentração de 1 μM utilizando a solução de banho. Manter a solução-mãe à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Marcação de endossomos e vesículas sinápticas<ol><li>Para rotular de forma ubíqua compartimentos de membrana endocitosados, como endossomos, adicione a solução estoque de ND6 (por exemplo, 1 mM em DMSO) ao meio de cultura na concentração final de 1 μM e incube a 5% de CO2, 100% de umidade e 37 °C por 30 min. Para reduzir a extensão da marcação de VS, suprimir farmacologicamente a atividade neuronal espontânea. Por exemplo, utilizar a tetrodotoxina para bloquear potenciais de ação ou o ácido 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetraidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida (NBQX) e o ácido D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanóico (D-AP5) para inibir a transmissão excitatória23.</li>
		<li>Para marcar seletivamente as SVs, use estimulação breve, mas forte, para evocar exo-/endocitose pré-sináptica. Primeiro, transfira a(s) tampa(s) de cultura para uma placa de Petri de 35 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> contendo 2 mL de solução normal de Tyrode à temperatura ambiente. Em segundo lugar, diluir a solução-estoque de ND6 em solução de Tyrode com alto teor de K+ (KCl 90 mM) na concentração final de 1 μM. Em terceiro lugar, substitua a solução normal de Tyrode na placa de Petri por uma solução de Tyrode com alto teor de K+ ND6 e incube à temperatura ambiente durante 2 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir a cultura celular marcada com ND6 para a câmara de imagem preenchida com solução normal de Tyrode pré-aquecida contendo 10 μM NBQX e 10 μM D-AP5.</li>
	<li>Ajustar a velocidade de perfusão para ~0,2 mL/s (ou seja, 1 gota por segundo) e iniciar a perfusão da solução normal de Tyrode pré-aquecida contendo NBQX e D-AP5 para remover o excesso de ND6 na cultura.</li>
	<li>Ajuste o foco e localize o campo de visão apropriado contendo neurônios saudáveis e bem espalhados com neuritos conectados. Evite áreas que contenham coloides corantes não resolvidos.</li>
	<li>Tente criar imagens de células carregadas com ND6 com diferentes tempos de exposição para identificar as melhores configurações de imagem. NOTA: Para o melhor tempo de exposição, a maior intensidade de fluorescência de pixels na imagem resultante é cerca de metade do intervalo de bits (por exemplo, para uma imagem de 16 bits, o intervalo de bits é de 0 a 65.535), o que permitirá um aumento adicional na fluorescência quando a solução de banho ácido for aplicada. O tempo de exposição selecionado deve ser usado para todas as imagens ND6.</li>
	<li>Estabeleça o protocolo de estimulação e perfusão, o frame interval e a duração total. Por exemplo, no protocolo a seguir, use uma linha de base de 30 s, uma estimulação de campo elétrico de 10 s 30 Hz, recuperação de 50 s, K+ de 120 s 90 mM, recuperação de 60 s, solução de Tyrode de 60 s com NH4Cl de 50 mM, solução de Tirode de 60 s em pH 5,5 e um intervalo de quadros de 3 s.</li>
	<li>Iniciar a aquisição das imagens acompanhado da estimulação e perfusão sincronizadas. Monitore a simulação e a troca de soluções durante a aquisição de imagens.</li>
	<li>Pare a perfusão após o término da imagem, remova a lamínula e limpe a câmara de imagem para o próximo teste.</li>
</ol>4. Quantificação do tráfego de membrana por uma mudança na fluorescência ND6
<ol><li>Faça backup e/ou cópia eletrônica de todos os arquivos de imagem.</li>
	<li>Escolha um programa de análise para extração de dados, por exemplo, um software de análise de imagem de código aberto como o ImageJ24 e/ou FIJI25.</li>
	<li>Abra ou importe uma pilha de imagens para o programa de análise.</li>
	<li>Defina a primeira imagem como referência e alinhe o restante a ela usando funções/plugins como o Rigid Registration26, que mitigará artefatos devido ao xy-drifting. Consulte a Figura 8 para ver imagens de exemplo.</li>
	<li>Média de todas as imagens adquiridas durante a pré-linha de base de 30 s para produzir uma imagem de referência. Salve uma cópia desta imagem para referência futura.</li>
	<li>Defina o limite de intensidade para gerar uma imagem binária a partir da imagem média da linha de base.</li>
	<li>Use Watershed no ImageJ ou funções semelhantes em outro programa para separar neuritos ou células de conexão.</li>
	<li>Use a função Analisar Partícula com tamanho de área e circularidade apropriados para solicitar regiões de interesse (ROIs) correspondentes a membranas celulares, endossomos, lisossomos ou boutons sinápticos. Salve todos os ROIs selecionados.</li>
	<li>Selecione quatro ROIs em segundo plano em regiões livres de células dentro do campo de visão.</li>
	<li>Meça as intensidades médias de pixel para cada ROI em cada quadro da pilha de imagens e exporte os resultados para análise estatística.</li>
	<li>Calcule a intensidade média das ROIs de fundo como o ruído basal, que será subtraído das intensidades médias de pixel para cada ROI.</li>
	<li>Média das três maiores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação da solução de Tyrode pH 5,5 para obtenção da intensidade máxima de fluorescência, que é definida como 100% para normalização.</li>
	<li>Média das três menores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação de 50 mM NH4Cl para definir a intensidade mínima de fluorescência, que é definida como 0% para normalização.</li>
	<li>Calcule as mudanças relativas de fluorescência para cada ROI com base em suas próprias intensidades de 0% e 100%. Derive mudanças de fluorescência média, cinética de mudança e outros valores/gráficos de dados individuais de ROI.</li>
</ol>

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<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Corantes à base de lipídios, como 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) e perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), têm sido usados há muito tempo para ilustrar a morfologia celular e rastrear processos celulares, como as projeções axonais dos neurônios. Corantes de estirila, como o FM1-43, têm sido inventados e utilizados com sucesso para o estudo da exocitose34. Devido à sua baixa afinidade com a membrana, eles marcam seletivamente as vesículas endocitadas onde f...

A bicamada lipídica é um dos conjuntos de biomoléculas mais comuns e é indispensável para todas as células. Fora das células, forma a membrana plasmática que faz interface com as células e seu ambiente; Dentro das células, compartimentaliza várias organelas especializadas para designar funcionalidades. Mais dinâmicas do que paradas, as membranas lipídicas experimentam constantemente fusão e fissão, o que medeia o transporte de biomateriais, a reforma da organela, a mudança morfológica e a comunicação celular. Sem dúvida, a membrana lipídica é a base física para quase todos os processos celulares, e sua disfunção desempenha um papel crucial em várias desordens que vão desde o câncer1 até a doença de Alzheimer2. Embora as moléculas lipídicas sejam muito menos diversas do que as proteínas, a pesquisa de membrana até agora tem sido principalmente centrada em proteínas. Por exemplo, sabe-se muito mais sobre a maquinaria proteica do que sobre os lipídios na exocitose 3,4,5. Além disso, a organização, distribuição, dinâmica e homeostase dos lipídios através das membranas superficiais e intracelulares permanecem em grande parte inexploradas em comparação com as proteínas de membrana6.
Isso não é surpreendente, pois técnicas modernas de biologia molecular, como a mutagênese, fornecem uma vantagem metodológica para estudar proteínas em vez de lipídios. Por exemplo, a marcação transgênica de proteína verde fluorescente sensível ao pH (também conhecida como pHluorina) para proteínas vesiculares facilita a medida quantitativa da quantidade e taxa de turnover proteico vesicular durante a exo-/endocitose 7,8,9. No entanto, é quase impossível modificar geneticamente os lipídios da membrana in vivo. Além disso, manipulações qualitativas e mesmo quantitativas de quantidades e distribuições de proteínas são muito mais viáveis do que as de lipídios10. No entanto, lipídios fluorescentes nativos e sintéticos têm sido isolados e desenvolvidos para simular lipídios de membrana endógena in vitro e in vivo11. Um grupo de lipídios fluorescentes amplamente utilizado são os corantes estiril, por exemplo, FM1-43, que exibem fluorescência realçada por membrana e são uma ferramenta poderosa no estudo da liberação de vesículas sinápticas (VS) em neurônios12. Ultimamente, corantes lipídicos sensíveis ao ambiente têm sido inventados e amplamente utilizados como uma nova classe de repórteres para estudar várias propriedades da membrana celular, incluindo potencial de membrana11, ordem de fase13 e secreção14.
Uma nova classe de miméticos lipídicos cuja fluorescência é sensível ao pH (por exemplo, pHluorina) e sensível à membrana (por exemplo, FM1-43) foi desenvolvida para medir diretamente a distribuição lipídica na membrana plasmática e endossomos/lisossomos e o tráfego lipídico durante a exo-/endocitose. Os conhecidos fluoróforos solvatocrômicos exibindo características push-pull devido à transferência de carga intramolecular foram selecionados para este propósito. Dentre os fluoróforos solvatocrômicos existentes, o arcabouço 1,8-naftalimida (ND) é relativamente fácil de modificar, versátil para marcação, único em fotofísica15 e, portanto, tem sido utilizado em intercaladores de DNA, diodos orgânicos emissores de luz e sensores de biomoléculas 16,17,18.
A ligação de um grupo doador de elétrons à posição C4 do arcabouço ND gera uma estrutura push-pull, que leva a um aumento do momento dipolar ao redistribuir a densidade eletrônica no estado excitado19,20. Tal transferência de carga intramolecular produz grandes rendimentos quânticos e desvios de Stokes, resultando em fluorescência brilhante e estável21. Recentemente, esse grupo desenvolveu uma série de análogos lipídicos solvatocrômicos baseados no arcabouço ND e os obteve com bons rendimentos sintéticos20.
A caracterização espectroscópica mostra que, dentre esses produtos, o ND6 possui as melhores propriedades de fluorescência (Figura 1)20. Primeiro, ele tem picos de excitação e emissão bem separados (ou seja, ~400 nm e ~520 nm, respectivamente, na Figura 2A,B) em comparação com fluoróforos populares como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou GFP, tornando-o espectralmente separável deles e, portanto, útil para imagens multicoloridas. Em segundo lugar, a fluorescência ND6 exibe um aumento de mais de oito vezes em sua fluorescência na presença de micelas (Figura 2C), sugerindo uma forte dependência de membrana. Estudos prévios de fluorescência de células vivas com diferentes tipos de células mostraram excelente coloração de membrana por ND620. Terceiro, quando o pH da solução é diminuído de 7,5 (comumente encontrado em ambientes extracelulares ou citosólicos) para 5,5 (comumente encontrado em endossomos e lisossomos), o ND6 mostra um aumento de aproximadamente duas vezes na fluorescência (Figura 2D), mostrando sua sensibilidade ao pH. Além disso, a simulação de dinâmica molecular indica que o ND6 se integra prontamente à bicamada lipídica com seu arcabouço ND voltado para fora da membrana e do resíduo de piperazina mostrando fortes interações com grupos de cabeças de fosfolipídios (Figura 3). Em conjunto, essas características fazem do ND6 um análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar e medir o turnover lipídico da membrana durante a exo-/endocitose.
Este trabalho apresenta um método para estudar a taxa de turnover e a dinâmica de lipídios SV usando cultura de neurônios hipocampais de camundongos. Ao estimular neurônios com soluções de Tyrode, com alto teor de K+, as VS e a membrana plasmática foram carregadas com ND6 (Figura 4A,B). Posteriormente, os neurônios foram reestimulados com diferentes estímulos, seguidos por soluções de NH4Cl e pH 5,5 de Tyrode (Figura 4D). Esse protocolo facilita a mensuração quantitativa das taxas de exocitose e endocitose montadas em diferentes circunstâncias (Figura 4C).

<table><tbody><tr><td>Dispositivos moleculares</td> do <td>sistema de aquisição de dados Digidata 1440A</td><td>Digidata 1440A</td><td>Para estimulação sincronizada e troca de soluções</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de canal duplo</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Para imagens de células</td></tr><tr><td>vivas Soro bovino fetal</td><td>OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>Para fazer solução H+20 usada em dissecação e cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS câmera</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>Câmera de alta sensibilidade</td> <td>C13440-20CU</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada Hank's Sigma</td><td></td><td>H6648</td><td>Para fazer solução H+20 usada em dissecação e cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Plataforma aquecida</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Tabela de isolamento de vibração Micro-G</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>Para controle de aquisição</td></tr><tr><td>de imagens Aquecedor de solução em linha multilinha</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 Câmera digital CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>Câmara de perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>Para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>Sistema de perfusão de controle de válvula de seis canais</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Para troca de soluções</td></tr><tr><td>Estimulador de pulso quadrado</td><td>Instrumento de grama</td><td>SD9</td><td>Para estimulação de campo elétrico</td></tr></tbody></table>

medindo o turnover lipídico da membrana com o análogo lipídico fluorescente sensível ao ph nd6

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocitose é um processo comum que medeia a troca de biomoléculas entre as células e seu ambiente e entre diferentes células. Células especializadas usam esse processo para executar funções vitais do corpo, como a secreção de insulina das células β e liberação de neurotransmissores das sinapses químicas. Devido ao seu significado fisiológico, a exo-/endocitose tem sido um dos tópicos mais estudados em biologia celular. Muitas ferramentas têm sido desenvolvidas para estudar este processo a nível de genes e proteínas, por causa das quais muito se sabe sobre a maquinaria proteica que participa neste processo. No entanto, poucos métodos foram desenvolvidos para medir o turnover lipídico da membrana, que é a base física da exo-/endocitose.
Este artigo apresenta uma classe de novos análogos lipídicos fluorescentes exibindo fluorescência dependente de pH e demonstra seu uso para rastrear a reciclagem lipídica entre a membrana plasmática e as vesículas secretoras. Auxiliados por simples manipulações de pH, esses análogos também permitem a quantificação da distribuição lipídica através da superfície e dos compartimentos da membrana intracelular, bem como a medida da taxa de turnover lipídico durante a exo-/endocitose. Esses novos repórteres lipídicos serão de grande interesse para vários campos de pesquisa biológica, como biologia celular e neurociência.

As VS são especializadas na liberação de neurotransmissores via exo-/endocitose evocada27. As SVs têm lúmen altamente ácido (i.e., pH 5,5), o que é ideal para ND6. Utilizamos alta estimulação com K+ para evocar a VS exo-/endocitose a fim de permitir que o ND6 acessasse o VS. Esperava-se que pontos fluorescentes verde-vivos ao longo dos processos neuronais aparecessem após a carga (Figura 9A). O perfil de retas mostrado na Figura 4B demonstr...

Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.

Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Este protocolo descreve a caracterização e aplicação de uma nova sonda lipídica fluorescente sensível ao pH, específica para membranas celulares, que permite aos pesquisadores monitorar exo e endocitose em células vivas. A maioria dos repórteres anteriores sobre a proteína de membrana baseada na proteína de fluorescência verde sensível ao pH, que é indireta. Como um mimético lipídico, ND6 integrar-se na membrana celular, e, assim, relatar fielmente o tráfego de membrana lipídica.A sonda ND6 torna-se fluorescente somente se embutida em ambiente de membrana biológica. A intensidade de fluorescência dessa sonda correlaciona-se com a protonação e desprotonação do grupo cabeça da piperazina. Assim, ele fluoresce muito mais forte em pH mais baixo.A exocitose e a endocitose são processos ubíquos subjacentes à secreção e captação de muitas moléculas sinalizadoras. Portanto, o ND6 pode ser usado para estudar algumas questões fundamentais na biologia celular e nas ciências biomédicas. Quem demonstrará o procedimento serão Haley, Oliver e Jonathan, alunos do meu laboratório.Comece preparando uma câmara de imagem que permita o controle de temperatura e a saída de entrada de solução para imagens de fluorescência de células vivas. Configure um dispositivo programável para alternar as soluções de perfusão e fornecer o estímulo elétrico em pontos de tempo definidos durante a aquisição de imagens. Pesar uma quantidade adequada de ND6.Dissolva-o em sulfóxido de dimetilo e deixe-o solubilizar à temperatura ambiente. Em seguida, sonicar a solução brevemente. Filtre a solução-mãe bruta usando um filtro de 0,22 micrômetro para remover grandes agregados de corante.Usando um espectrofotômetro convencional ou de microvolume, determine a concentração do corante a 405 nanômetros. Antes da aplicação, diluir a solução-mãe para uma concentração de um miligrama por mililitro usando a solução de banho. Manter a solução-mãe à temperatura ambiente no escuro.Adicionar a solução-estoque de ND6 ao meio de cultura na concentração final de um micrograma por microlitro e incubá-lo para rotular de forma ubíqua compartimentos de membrana endocitosados, como endossomos. Para reduzir a extensão da marcação de vesículas sinápticas, suprimir farmacologicamente a atividade neuronal espontânea. Após a marcação seletiva das vesículas sinápticas, conforme descrito no manuscrito, montar a lamínula contendo células na câmara de imagem.Conecte o sensor de temperatura, a entrada de perfusão e a ponta de vácuo à câmara de imagem. Ajustar a velocidade de perfusão para aproximadamente 0,2 mililitros por segundo e iniciar a perfusão da solução de tirode normal pré-aquecido contendo NBQX e DAP5 para remover o excesso de ND6 na cultura. Ajuste o foco e localize o campo de visão apropriado contendo neurônios saudáveis e bem espalhados com neuritos conectados.Evitar áreas contendo dicolóides não resolvidos. Tente criar imagens de células carregadas com ND6 com diferentes tempos de exposição para identificar as melhores configurações de imagem. Estabeleça o protocolo de estimulação e perfusão, o frame interval e a duração total usando as informações do manuscrito do texto.Iniciar a aquisição das imagens acompanhado de estimulação e perfusão sincronizadas. Monitorar a estimulação e a troca de soluções durante a aquisição de imagens. Interromper a perfusão após o término da imagem.Remova a tampa e limpe a câmara de imagem para o próximo ensaio. Faça backup e faça uma cópia eletrônica de todos os arquivos de imagem. Escolha e abra o programa de análise para extração de dados.Abra ou importe uma pilha de imagens para o programa de análise. Depois de gerar uma máscara binária, use a função de partícula de análise com tamanho de área e circularidade apropriados para solicitar regiões de interesse, ou ROIs, correspondentes a membranas celulares, endossomos, lisossomos ou boutons sinápticos. Selecione quatro ROIs em segundo plano em regiões livres de células dentro do campo de visão.Em seguida, salve todos os ROIs selecionados. Alinhe todos os quadros dentro das pilhas de imagens de lapso de tempo ND6. Defina a primeira imagem como referência e alinhe o restante a ela usando registro rígido, o que atenuará artefatos devido à deriva XY.Em seguida, salve as pilhas de imagens alinhadas. Aplique os ROIs salvos a pilhas de imagens ND6 alinhadas. Meça as intensidades médias de pixel da fluorescência ND6 para cada ROI em cada quadro da pilha de imagens.Em seguida, exporte os resultados para análise estatística. Calcular a intensidade média das ROIs de fundo para obter o ruído basal, que será subtraído de todas as ROIs selecionadas. Média das três maiores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação da solução de tirode pH 5,5 para obtenção da intensidade máxima de fluorescência, definida como 100% para normalização.Média das três menores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação de cloreto de amônio de 50 milimolares para definir a intensidade mínima de fluorescência, definida como 0% para normalização. Calcule as mudanças de fluorescência relativas para cada ROI com base em suas próprias intensidades de 0% e 100%. Derive mudanças médias de fluorescência, cinética de mudança e outros valores ou gráficos a partir de dados individuais de ROI.Pontos fluorescentes verde-brilhantes ao longo dos processos neuronais foram visíveis após a carga das células neuronais com ND6. Uma forte correlação entre as intensidades de fluorescência ND6 e FM464 também sugeriu a coloração da vesícula sináptica por ND6. Foi observada uma diminuição na fluorescência do ND6 em resposta tanto à estimulação elétrica quanto à estimulação com alto potássio, sugerindo que o ND6 reside na membrana da vesícula sináptica e que o lúmen da vesícula sináptica é neutralizado durante a liberação.Sob uma estimulação elétrica exaustiva, o tratamento com M beta CD reduziu significativamente a liberação e recuperação da vesícula sináptica medida por imagem de DN, o que sugeriu que o colesterol de membrana facilita a exocitose e endocitose da vesícula sináptica. Baf A1 preveniu a recuperação da fluorescência ND6 após estimulação, bloqueando agudamente a reacidificação das vesículas sinápticas recuperadas. A compreensão básica da microscopia de fluorescência é imprescindível.O planejamento cuidadoso das condições fisiológicas para dar suporte à imagem de células vivas é muito importante. É crucial determinar com precisão a concentração da solução-estoque de ND. Se possível, remedir a concentração da solução-mãe antes de cada utilização.Por favor, mantenha-o longe da luz solar direta para evitar o clareamento fotográfico e a decomposição da sonda.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

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Aprenda a medir o turnover lipídico da membrana usando a sonda fluorescente ND6 sensível ao pH em neurônios vivos. Este método permite monitorar dinamicamente a exocitose e endocitose com alta precisão.

Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

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