Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6
29 de julho de 2021
Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.
Este protocolo descreve a caracterização e aplicação de uma nova sonda lipídica fluorescente sensível ao pH, específica para membranas celulares, que permite aos pesquisadores monitorar exo e endocitose em células vivas. A maioria dos repórteres anteriores sobre a proteína de membrana baseada na proteína de fluorescência verde sensível ao pH, que é indireta. Como um mimético lipídico, ND6 integrar-se na membrana celular, e, assim, relatar fielmente o tráfego de membrana lipídica.
A sonda ND6 torna-se fluorescente somente se embutida em ambiente de membrana biológica. A intensidade de fluorescência dessa sonda correlaciona-se com a protonação e desprotonação do grupo cabeça da piperazina. Assim, ele fluoresce muito mais forte em pH mais baixo.
A exocitose e a endocitose são processos ubíquos subjacentes à secreção e captação de muitas moléculas sinalizadoras. Portanto, o ND6 pode ser usado para estudar algumas questões fundamentais na biologia celular e nas ciências biomédicas. Quem demonstrará o procedimento serão Haley, Oliver e Jonathan, alunos do meu laboratório.
Comece preparando uma câmara de imagem que permita o controle de temperatura e a saída de entrada de solução para imagens de fluorescência de células vivas. Configure um dispositivo programável para alternar as soluções de perfusão e fornecer o estímulo elétrico em pontos de tempo definidos durante a aquisição de imagens. Pesar uma quantidade adequada de ND6.
Dissolva-o em sulfóxido de dimetilo e deixe-o solubilizar à temperatura ambiente. Em seguida, sonicar a solução brevemente. Filtre a solução-mãe bruta usando um filtro de 0,22 micrômetro para remover grandes agregados de corante.
Usando um espectrofotômetro convencional ou de microvolume, determine a concentração do corante a 405 nanômetros. Antes da aplicação, diluir a solução-mãe para uma concentração de um miligrama por mililitro usando a solução de banho. Manter a solução-mãe à temperatura ambiente no escuro.
Adicionar a solução-estoque de ND6 ao meio de cultura na concentração final de um micrograma por microlitro e incubá-lo para rotular de forma ubíqua compartimentos de membrana endocitosados, como endossomos. Para reduzir a extensão da marcação de vesículas sinápticas, suprimir farmacologicamente a atividade neuronal espontânea. Após a marcação seletiva das vesículas sinápticas, conforme descrito no manuscrito, montar a lamínula contendo células na câmara de imagem.
Conecte o sensor de temperatura, a entrada de perfusão e a ponta de vácuo à câmara de imagem. Ajustar a velocidade de perfusão para aproximadamente 0,2 mililitros por segundo e iniciar a perfusão da solução de tirode normal pré-aquecido contendo NBQX e DAP5 para remover o excesso de ND6 na cultura. Ajuste o foco e localize o campo de visão apropriado contendo neurônios saudáveis e bem espalhados com neuritos conectados.
Evitar áreas contendo dicolóides não resolvidos. Tente criar imagens de células carregadas com ND6 com diferentes tempos de exposição para identificar as melhores configurações de imagem. Estabeleça o protocolo de estimulação e perfusão, o frame interval e a duração total usando as informações do manuscrito do texto.
Iniciar a aquisição das imagens acompanhado de estimulação e perfusão sincronizadas. Monitorar a estimulação e a troca de soluções durante a aquisição de imagens. Interromper a perfusão após o término da imagem.
Remova a tampa e limpe a câmara de imagem para o próximo ensaio. Faça backup e faça uma cópia eletrônica de todos os arquivos de imagem. Escolha e abra o programa de análise para extração de dados.
Abra ou importe uma pilha de imagens para o programa de análise. Depois de gerar uma máscara binária, use a função de partícula de análise com tamanho de área e circularidade apropriados para solicitar regiões de interesse, ou ROIs, correspondentes a membranas celulares, endossomos, lisossomos ou boutons sinápticos. Selecione quatro ROIs em segundo plano em regiões livres de células dentro do campo de visão.
Em seguida, salve todos os ROIs selecionados. Alinhe todos os quadros dentro das pilhas de imagens de lapso de tempo ND6. Defina a primeira imagem como referência e alinhe o restante a ela usando registro rígido, o que atenuará artefatos devido à deriva XY.
Em seguida, salve as pilhas de imagens alinhadas. Aplique os ROIs salvos a pilhas de imagens ND6 alinhadas. Meça as intensidades médias de pixel da fluorescência ND6 para cada ROI em cada quadro da pilha de imagens.
Em seguida, exporte os resultados para análise estatística. Calcular a intensidade média das ROIs de fundo para obter o ruído basal, que será subtraído de todas as ROIs selecionadas. Média das três maiores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação da solução de tirode pH 5,5 para obtenção da intensidade máxima de fluorescência, definida como 100% para normalização.
Média das três menores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação de cloreto de amônio de 50 milimolares para definir a intensidade mínima de fluorescência, definida como 0% para normalização. Calcule as mudanças de fluorescência relativas para cada ROI com base em suas próprias intensidades de 0% e 100%. Derive mudanças médias de fluorescência, cinética de mudança e outros valores ou gráficos a partir de dados individuais de ROI.
Pontos fluorescentes verde-brilhantes ao longo dos processos neuronais foram visíveis após a carga das células neuronais com ND6. Uma forte correlação entre as intensidades de fluorescência ND6 e FM464 também sugeriu a coloração da vesícula sináptica por ND6. Foi observada uma diminuição na fluorescência do ND6 em resposta tanto à estimulação elétrica quanto à estimulação com alto potássio, sugerindo que o ND6 reside na membrana da vesícula sináptica e que o lúmen da vesícula sináptica é neutralizado durante a liberação.
Sob uma estimulação elétrica exaustiva, o tratamento com M beta CD reduziu significativamente a liberação e recuperação da vesícula sináptica medida por imagem de DN, o que sugeriu que o colesterol de membrana facilita a exocitose e endocitose da vesícula sináptica. Baf A1 preveniu a recuperação da fluorescência ND6 após estimulação, bloqueando agudamente a reacidificação das vesículas sinápticas recuperadas. A compreensão básica da microscopia de fluorescência é imprescindível.
O planejamento cuidadoso das condições fisiológicas para dar suporte à imagem de células vivas é muito importante. É crucial determinar com precisão a concentração da solução-estoque de ND. Se possível, remedir a concentração da solução-mãe antes de cada utilização.
Por favor, mantenha-o longe da luz solar direta para evitar o clareamento fotográfico e a decomposição da sonda.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método de imagem de fluorescência que utiliza sondas lipídicas sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membranas lipídicas durante a exocitose e endocitose celular. O mimético lipídico ND6 incorpora-se à membrana celular, fornecendo informações em tempo real sobre esses processos dinâmicos em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia de Fluorescência
- Biologia Celular
- Neurociência
Contexto
- A sonda ND6 é sensível ao pH e projetada especificamente para membranas celulares.
- Métodos anteriores que utilizam proteínas fluorescentes verdes são indiretos, enquanto a ND6 fornece medição direta.
- A intensidade da fluorescência correlaciona-se com a protonação e desprotonação de seu grupo terminal.
- Investigar a exocitose e a endocitose é essencial para compreender a sinalização celular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para observar diretamente a dinâmica da membrana lipídica em células vivas.
- Facilitar o estudo de processos fundamentais em biologia celular.
- Fornecer insights sobre os mecanismos de tráfego de vesículas e interação da membrana durante a atividade neuronal.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza imagem de células vivas para monitorar alterações na fluorescência usando ND6 em células neuronais cultivadas.
- Os procedimentos principais incluem a preparação de uma câmara de imagem, solubilização de ND6 e perfusão controlada.
- A aquisição de imagens é sincronizada com protocolos de estimulação elétrica e perfusão.
- A análise estatística envolve o cálculo de alterações relativas na fluorescência e a geração de máscaras binárias para regiões de interesse.
Resultados Principais
- A fluorescência intensa dos pontos ND6 indica marcação bem-sucedida das vesículas sinápticas.
- As alterações na fluorescência ND6 correlacionam-se com a dinâmica das vesículas sinápticas durante a estimulação.
- Experimentos revelaram interações entre o colesterol e o tráfego de vesículas sinápticas.
- O tratamento com Baf A1 afetou a recuperação da fluorescência ND6, destacando o papel do pH na reacidificação das vesículas.
Conclusões
- Este protocolo permite investigações detalhadas do tráfego de membranas lipídicas em neurônios vivos.
- Os insights obtidos com este método contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos celulares subjacentes à exocitose e endocitose.
- Os achados têm implicações significativas para a sinalização celular e a neurobiologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da renovação dos lipídios da membrana fornece uma visão direta da base física da exo-/endocitose, um processo central na sinalização celular e no tráfego de vesículas. O análogo fluorescente sensível ao pH, ND6, permite o rastreamento em tempo real e quantitativo da reciclagem de lipídios entre a membrana plasmática e compartimentos intracelulares, apoiando a desmistificação mecanicista na validação de alvos e no desenvolvimento de ensaios. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao associar a dinâmica dos lipídios a resultados funcionais nas vias de secreção e captação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar o tráfego de membranas lipídicas como hipótese terapêutica em vias relacionadas à secreção.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura direta da renovação lipídica, reduzindo a dependência de indicadores indiretos baseados em proteínas.
- Valor Preditivo: Apoia a validação funcional de alvos ao correlacionar a dinâmica lipídica com a liberação e recuperação de vesículas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de fluorescência proporcionais à dinâmica da membrana lipídica durante a estimulação.
- Valor Operacional: Permite a medição padronizada e reprodutível da cinética de exo-/endocitose em células vivas.
- Prontidão do Ensaio: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para triagem de compostos e estudos de modulação de vias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as medidas de renovação lipídica a sistemas relevantes para doenças, como secreção neuronal e liberação de insulina.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece o papel do colesterol da membrana e do pH no tráfego de vesículas, orientando a segurança e eficácia do alvo.
- Confiança Preditiva: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular a dinâmica lipídica a respostas funcionais de secreção.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, ao fornecer leituras diretas e quantitativas da dinâmica da membrana lipídica que informam o entendimento mecanicista e a triagem funcional.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos mediados por lipídios nas vias de exocitose e endocitose.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis de fluorescência para avaliar os efeitos de compostos sobre o turnover de lipídios.
- Análise: Permite obter alterações médias da fluorescência, cinética e métricas de normalização para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica de lipídios com a função secretora em células neurais e endócrinas, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para monitorar o tráfego de membranas lipídicas em diferentes tipos celulares e paradigmas de estimulação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece uma medida direta e quantitativa da renovação da membrana lipídica, reduzindo a ambiguidade mecanicista nas vias de secreção.
- Valor Operacional: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios de tráfego lipídico por meio da normalização baseada em pH e análise de ROI.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao vincular a dinâmica lipídica à liberação e recuperação funcional de vesículas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos envolvidos no tráfego de membranas e processos secretórios.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, imageamento de células vivas e manipulação de sondas sensíveis ao pH.
- Exige instrumentação para perfusão controlada, regulação de temperatura e estimulação sincronizada durante o imageamento.
- Exige padronização entre equipes quanto à concentração da sonda, diluição e configurações de imageamento para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos celulares, composições de membrana e protocolos de estimulação.
- Inclui limitações práticas, como risco de fotodesvanecimento, necessidade de armazenamento no escuro e otimização dos tempos de exposição e soluções de pH.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Microscope Setup, Loading and Imaging ND6 in Neuronal Cultures
4:17
Quantification of Membrane Trafficking by a Change in ND6 Fluorescence
6:44
Results: Membrane Lipid Turnover with the pH‐Sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6
8:00
Conclusion
