Name: Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a quantificar e visualizar a regulação da fagocitose macrófago por células-tronco mesenquimais usando partículas fluorescentes sensíveis ao pH. Este método de co-cultura oferece uma ferramenta valiosa para estudar interações celulares e mecanismos de imunidade inata.

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Este trabalho foi apoiado pelo mecanismo NSF Major Research Instrument sob números de subvenções 1626093 e 1919583.

<ol><li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem%2Fmultipotent+stromal+cells%3A+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li>
<li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+sensors+and+switchers+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li>
<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
<li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988(2011).</li>
<li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li>
<li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088(2010).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
<li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive%2Fanti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li>
<li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages%3A+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li>
<li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).</li>
<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
<li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li>
<li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).</li>
<li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c%2FEBP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li>
<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

A análise da fagocitose utilizando biopartículas conjugadas a um corante sensível ao pH é uma ferramenta relativamente nova que tem se mostrado vantajosa sobre partículas tradicionais rotuladas fluorescentes12,19,20. Com partículas tradicionais rotuladas por fluorescentes, apenas a análise de ponto final é viável. A detecção é realizada com microscopia fluorescente e/ou espectrofluorometria após a lavagem ou sacieçação de partíc...

Células-tronco mesenquimais (MSC) são células progenitoras que dão origem a células de tecido conjuntivo. O MSC está presente em tecidos mamíferos adultos e pode ser isolado da medulaóssea 1. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, essas células são amplamente estudadas2. Estudos iniciais focados na regulação do MSC das células T3,4,5,6, mas mais recentemente, sua regulação das células macrófagos (MΦ), um dos principais componentes celulares da imunidade inata, tem recebido maior atenção7,8,9,10,11,12,13,14 . A importância da interação MSC-MΦ no tratamento da doença inflamatória é sublinhada pelo fato de que o esgotamento dos monócitos/macrófagos revoga os efeitos terapêuticos do MSC nos modelosanimais 8. Aqui, o foco é a interação de contato celular do MSC com MΦ. A MSC tem a capacidade de regular o fenótipo de MΦ promovendo a mudança de respostas inflamatórias para anti-inflamatórias, levando a atividades de reparação tecidual8,9,10,11, e muito tem sido feito para demonstrar esses mecanismos regulatórios. Em outras circunstâncias, o MSC pode suportar ou exacerbar uma resposta inflamatória orientada por MΦ12,13 e melhorar a atividade fagocítica MΦ14,15. No entanto, há uma falta crítica de dados existentes que identifica os mecanismos pelos quais e as condições sob as quais o MSC regula a atividade fagocítica MΦ.
MΦ tem famílias de receptores que reconhecem ou o opsonizados (anticorpo ou complemento revestido) ou patógenos não opssonizados que levam à fagocitose16. A ativação e atividade deste último é menos bem estudada17. Em um ambiente in vitro não inflamatório, o MSC aprimora a fagocitose de maçom de patógenos não opssonizados13. No entanto, o reconhecimento de patógenos não opssonizados por MΦ pode ser reduzido após a exposição a um ambiente inflamatório produzido por linfócitos durante uma resposta imune adaptativa. IFN-γ, liberada por células assassinas naturais e linfócitos efeitos, tem um efeito inibidor na fagocitose de MΦ de partículas não opssonizadas18. Um modelo de cocultura foi desenvolvido para estudar os mecanismos da regulação de contato direto do MSC da fagocitose MΦ. O objetivo do experimento aqui apresentado é determinar se o MSC regula a fagocitose de mφ de patógenos não opssonizados após mΦ ter sido exposto a IFN-γ (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Microplaca de Poliestireno Preto de 96 Poços</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Solução de 0,4% de azul de tripano</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de Polipropileno Estéril Cônico de 15 mL e 50 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro com Câmara de 4 poços com poços não removíveis</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)&nbsp; Sistema de Imagem Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura, tratados para cultura de tecidos, área de superfície 75&nbsp; cm2, pescoço inclinado, com tampa, filtrado</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Linha Celular MSC de Camundongo</td></tr><tr><td>DMEM, Soro Bovino Fetal 11965092 ThermoFisher com Alto Teor de Glicose</td><td></td><td></td>, qualificado, inativado pelo calor ThermoFisher 16140071 Hemocitômetro FisherScientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Mouse M&Phi; Linha celular</td></tr><tr><td>LADMAC Linha celular</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>As células LADMAC secretam o fator de crescimento fator estimulador de colônias 1 (CSF-1).</td></tr><tr><td>Solução de imagem de células vivas</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Biopartículas Conjugadas</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>IFN murino recombinante-&gama;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro de Vácuo de Uso Único Estéril, 250 mL, 0.2 &micro; m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéreis, 0,2 micrômetro</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; quantitação e imagem

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

As células-tronco mesenquimais (MSC) têm sido tradicionalmente estudadas para suas propriedades regenerativas, mas, mais recentemente, suas características imunoregulatórias têm estado na vanguarda. Eles interagem e regulam a atividade das células imunes. O foco deste estudo é a regulação do MSC da atividade fagocítica do macrófago. A fagocitose macrófago (MΦ) é uma parte importante da resposta do sistema imunológico inato à infecção, e os mecanismos pelos quais a MSC modula essa resposta estão sob investigação ativa. Apresentado aqui é um método para estudar a fagocitose de MΦ de partículas de zimosã não opssonizadas conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH enquanto em co-cultura com MSC. À medida que a atividade fagocítica aumenta e as partículas de zimosã rotuladas são fechadas dentro do ambiente ácido do fagolico, a intensidade de fluorescência da molécula sensível ao pH aumenta. Com os comprimentos de onda de excitação e emissão adequados, a atividade fagocítica é medida usando um espectrofotômetro fluorescente e os dados cinéticos são apresentados como alterações em unidades fluorescentes relativas durante um período de 70 minutos. Para suportar esses dados quantitativos, a mudança na atividade fagocítica é visualizada por meio de imagens dinâmicas. Os resultados utilizando este método demonstram que, quando na co-cultura, o MSC melhora a fagocitose de zymosan não opssonizado tanto ingênua quanto ifn-γ tratada MΦ. Esses dados se somam ao conhecimento atual da regulação do MSC do sistema imunológico inato. Este método pode ser aplicado em investigações futuras para delinear totalmente os mecanismos celulares e moleculares subjacentes.

Após calcular a média ± SEM para cada grupo em todos os pontos de tempo, os dados são apresentados em formato gráfico de linha com o eixo Y como a Intensidade Fluorescente Relativa e o eixo X como Tempo. O Arquivo Suplementar 1 fornece um exemplo de dados brutos de uma leitura cinética da placa de 96 poços em formato de planilha.
Neste estudo, os resultados ideais apresentados na Figura 3A, e na Tabela 3 demonstram que 1) a cocult...

Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Este método de cocultura ajudará a responder às principais perguntas em torno dos mecanismos de contato celular por trás da regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose de macrófago e, portanto, iluminará o papel do MSC na regulação da imunidade inata. Esta técnica pode ser aplicada em análises de alto rendimento. As biopartículas conjugadas aos corantes sensíveis ao pH fluorescem apenas em ambientes ácidas phagolysosome.Por isso, lavar e saciar são necessários. Este método também pode ser aplicado a uma variedade de modelos de co-cultura que incluem neutrófilos e outros fagocitos. Demonstrando o procedimento será Ethan Chetkof, um estudante atualmente no meu laboratório.Para começar, observe a confluência de células-tronco mesenquimais cultivadas. Quando 70-80% de confluência é alcançada, aspire o meio de crescimento das células cultivadas em um prato de 100 milímetros e adicione cinco mililitros de PBS. Após aspirar o PBS, adicione dois mililitros de solução EDTA de 0,05% de trippsina e incuba as células por três minutos.Após três minutos, verifique o desprendimento celular usando um microscópio invertido. E se as células não forem separadas, incubar por um a dois minutos novamente. Uma vez que todas as células são separadas, adicione cinco mililitros de meio de crescimento fresco à placa.Depois de enxaguar a placa usando a mistura média de trippsina, use uma pipeta sorológica estéril para coletar células em um tubo cônico limpo e estéril de 50 mililitros. Em seguida, pelota para baixo as células por centrifugação. Depois de aspirar o supernaspe, resuspenque a pelota de célula em 10 mililitros de meio de crescimento fresco, tubos suavemente para cima e para baixo.Para a contagem celular, adicione 10 microliters de suspensão celular em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 30 microliters de 0,4%Trypan Blue solução, em seguida, adicione 10 microliters da mistura sob a tampa de uma câmara de contagem de hemócitometros. Sob o microscópio invertido ou Brightfield, conte as células viáveis não manchadas usando uma lente objetiva de 10X e quatro câmaras de um milímetro quadrado e calcule o número da célula conforme descrito no manuscrito do texto. Use a equação C1V1 igual a C2V2 para determinar o volume desejado da suspensão média e celular fresca necessária para preparar a suspensão celular em uma concentração final de uma vez 10 para as quintas células por mililitro.Use um micropipetter multicanal para adicionar 100 microliters da suspensão celular nos poços de uma placa de 96 poços de acordo com o design da placa. Use uma micropipette para adicionar 530 microliters da suspensão celular a cada um dos slides da câmara de acordo com o desenho da placa e incubar durante a noite. Prepare 10 mililitros de meio de ativação contendo gamma interferon a uma concentração de 250 nanogramas por mililitro para ativar as células macrófagos em um prato de 100 milímetros.Aspire o meio de crescimento das culturas das células macrófagos e enxágue as células com cinco mililitros do meio de ativação desprovidos de interferon gama. Depois de aspirar o meio de lavagem no prato experimental, adicione 10 mililitros de meio de ativação suplementados com interferon gama. E no prato de controle, adicione 10 mililitros de meio de ativação sem interferon gama, em seguida, incubar as células por 16 a 24 horas.Ao final da incubação, para a preparação das coculturas, remova o meio de ativação das células macrófagos e adicione cinco mililitros de meio de crescimento fresco. Use um levantador de células para raspar suavemente as células e coletar as células em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, conte as células usando a exclusão do Trypan Blue e a hemocittometria, seguidas pela preparação de suspensões de células de controle e macrófago tratadas na concentração de duas vezes 10 a cinco células por mililitro, como demonstrado anteriormente para as células-tronco mesenquimais.Aspire suavemente o meio dos poços experimentais contendo células-tronco mesenquimais. Use uma micropipette multicanal para adicionar 100 microliters do tratado e as suspensões de células macrófagos de controle nos poços experimentais apropriados de acordo com o desenho da placa e incubar durante a noite, como demonstrado. Aspire suavemente o meio do escorregador de câmara de quatro paredes contendo células-tronco mesenquimais.Use uma micropipette para adicionar 530 microliters da suspensão das células macrófagos aos poços apropriados de acordo com o projeto e incubar durante a noite. Adicione um mililitro de meio de imagem celular viva ao frasco contendo um miligrama de partículas zymosan e colete a mistura de partículas médias em um tubo de cultura de vidro. Depois de enxaguar o frasco com um mililitro adicional de solução de imagem, transfira o meio de imagem enxaguado no tubo de vidro e adicione três mililitros de solução de imagem adicional para alcançar 0,2 miligramas por suspensão de partículas zymosan mililitro.Vórtice a suspensão Zymosan usando pulsos rápidos por 30 a 60 segundos, em seguida, use um sonicator sonda para sonicar a suspensão com 60 pulsos rápidos. Após aspirar o meio, enxágue os poços experimentais e os poços em branco de reagente com 100 microliters de solução de imagem celular viva. Em seguida, aspire a solução de imagem de células vivas dos poços e adicione 100 microliters da suspensão Zymosan.Abra a bandeja da placa do leitor fluorescente usando a interface touch pad. Coloque a placa sem a tampa na bandeja com o poço A1 no canto superior esquerdo. Feche a bandeja usando o touch pad e clique no botão verde de leitura no menu superior.Para realizar o ensaio de fagocitose, após enxaguar o primeiro poço experimental com 750 microliters do meio de imagem, adicione 400 microliters da suspensão zymosan deixando os poços restantes no meio de crescimento. Em seguida, coloque o slide no estágio incubado do sistema de imagem. Use o software de imagem.Selecione a opção Brightfield sob a guia localizar e clique no ícone da ocular. Com o objetivo 10X em vigor, use a ocular e o botão de foco para focar nas células. Selecione a guia de aquisição.Abra o menu suspenso do experimento e selecione um conjunto de comprimentos de onda que inclui o conjunto de filtroS EGFP para acomodar 509 nanômetros de excitação e 533 comprimentos de onda de emissão de nanômetros do corante sensível ao pH. Quando faltar cerca de dois minutos no temporizador, clique no ícone 20X no menu objetivo para alterar o objetivo para 20X, clique no menu de canais, selecione filtros EGFP e, no menu de exposição, defina o tempo de exposição a 400 milissegundos para detectar o fluorophore verde sensível ao pH e clique ao vivo. Depois de ajustar o foco, clique em parar para desligar a luz e marque a caixa ao lado da configuração experimental de lapso de tempo superior.No menu de estratégia de foco, selecione o foco automático do software e no menu suspenso, selecione configurações inteligentes e centrais para reduzir o tempo de exposição à luz enquanto o foco automático estiver em execução. No menu time-lapse, defina o número desejado de aquisições para 30 a 60, o intervalo para um minuto e clique no botão iniciar o experimento para iniciar a aquisição. O efeito do interferon gama na cocultura foi estudado.Os resultados representativos demonstram que a co-cultura de macrófagos com células-tronco mesenquimais aumenta a atividade fagocítica do macrófago. O tratamento gama de interferon reduz a atividade do macrófago. No entanto, na presença de células-tronco mesenquimais, a atividade fagocítica do macrófago foi parcialmente resgatada.As densidades celulares ideais são críticas nesses estudos. E quando as células macrófagos foram banhadas a uma densidade muito baixa, mudanças na intensidade da fluorescência não foram detectadas. Quando as células macrófagos foram banhadas a uma alta densidade, a intensidade da fluorescência foi elevada rapidamente em todos os grupos e as diferenças não foram discernidas.Uma das coisas mais importantes durante este procedimento é garantir que as densidades celulares sejam otimizadas e mantidas consistentes entre os experimentos.

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a regulação de células-tronco mesenquimais (MSC) da fagocitose de macrófagos em uma cocultura. Após a co-cultura de MSC com macrófagos, partículas de zimosana não opsonizadas conjugadas a um fluoróforo sensível ao pH são adicionadas para serem fagocitadas pelos macrófagos. Com o aumento da fagocitose, a intensidade da fluorescência aumenta, permitindo a determinação da regulação da atividade fagocítica mediada por CTM.

Um ensaio para estudar a regulação da fagocitose de macrófagos por células-tronco mesenquimais

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar a atividade Quimiotáticos de monócitos do sangue em modelos do rato, para avaliar os efeitos de intervenções nutritivas, farmacológicas e genéticas no monocyte do sangue e para caracterizar os macrófagos derivados do sangue dos monócitos em modelos de mouse usando o monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-carregado porão membrana-derivado gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Este protocolo descreve a geração robusta de macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e métodos para sua caracterização subseqüente. A expressão do marcador de superfície celular, a expressão genética e os ensaios funcionais são usados para avaliar o fenótipo e a função desses macrófagos derivados do iPSC.

Produção e Caracterização de Macrófagos Humanos de Células-Tronco Pluripotentes

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Aprenda a quantificar e visualizar a regulação da fagocitose macrófago por células-tronco mesenquimais usando partículas fluorescentes sensíveis ao pH. Este método de co-cultura oferece uma ferramenta valiosa para estudar interações celulares e mecanismos de imunidade inata.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

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