Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho
15 de julho de 2021
A preparação isolada do pulmão do coelho é uma ferramenta padrão-ouro na pesquisa pulmonar. Esta publicação tem como objetivo descrever a técnica desenvolvida para o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos na reatividade das vias aéreas, preservação pulmonar e pesquisa pré-plínica em transplante de pulmão e edema pulmonar.
Esta técnica é útil na caracterização da fisiologia pulmonar e patologia medindo atividades metabólicas e função respiratória. O sistema isolado de perfusão pulmonar permite trabalhar com um órgão funcional completo possibilitando o estudo de uma função fisiológica contínua ao mesmo tempo em que recria ventilação e perfusão. Este método poderia fornecer uma visão da caracterização das capacidades não respiratórias dos tecidos pulmonares, como a atividade metabólica e as atividades de vários componentes como o macrófago alveolar e o tecido endotelial.
Para começar, monte o aparelho de trabalho, garantindo que ele contenha a coluna de aço principal montada em uma placa base segurando o tórax artificial com o pneumotachômetro e transdutor de peso localizado acima da coluna e atrás da bobina pré-aquecimento com uma armadilha de bolhas. Conecte todos os transdutores à unidade eletrônica central e prepare o sistema de ventilação além do aparelho. Depois de raspar o local cirúrgico do coelho anestesiado, faça uma incisão de linha mediana ventral de três a cinco centímetros do manúbrio do esterno até o pescoço.
Use a tesoura de operação para cortar o 2/3 anterior da traqueia entre os anéis de cartilagem. Insira uma cânula traqueal de cinco milímetros através da membrana fibrosa traqueal e fixe a cânula cuidadosamente com uma sutura de seda 4-0. Coloque os fórceps ou pinças sob a traqueia para garantir que a cânula não se dobre contra a traqueia.
Conecte a bomba de respiração à cânula traqueal, ajuste o volume da maré em 10 mililitros por quilograma e inicie a ventilação rapidamente após a traqueotomia e antes que o tórax seja aberto para manter a pressão positiva nos pulmões para evitar o colapso pulmonar durante a cirurgia. Para acessar a cavidade torácica, use um bisturi ou uma tesoura para abrir a parede do tórax e realizar uma esternotomia medial até o terço superior do tórax. Mantenha as metades do tórax abertas com dois retráteis.
Localize a veia cava superior e inferior e marque-as com roscas. Antes da exsanguinação do animal, identifique o ventrículo direito e injete 1.000 unidades internacionais por quilograma de heparina. Imediatamente após a injeção, ligue a veia cava superior e inferior com a rosca pré-looped.
Corte o manúbrio sterni para estender a esternotomia medial em direção à cânula traqueal, liberando a traqueia em ambos os lados de tecido de conexão. Agora ressegue a traqueia acima da cânula traqueal e puxe suavemente a cânula em um eixo cranial/caudal. Após a exsanguinação para a colheita do bloco cardiopulmonar, use dissecção digital direta ou tesoura de mola para separar o tecido conjuntivo e remover os pulmões do tórax.
Em seguida, dissecar a vasculatura e o esôfago. Levante os pulmões isolados do tórax e coloque cuidadosamente os pulmões sobre uma gaze estéril em uma placa de Petri. Para evitar atelectasia, ventile os pulmões usando ventilação de pressão positiva com pressão expiratória final positiva fixada em dois centímetros de coluna de água.
Corte os ventrículos do coração ao nível do sulco atrioventricular. Depois de abrir os dois ventrículos, introduza a cânula da artéria pulmonar pulmonar através da artéria pulmonar direita e a cânula do átrio esquerdo através da válvula mitral no átrio esquerdo. Fixar a cânula com uma sutura de seda 4-0, incluindo os tecidos circundantes nas ligaduras da artéria pulmonar e átrio esquerdo para evitar distensão estrutural.
Injete 250 mililitros de solução isotônica salina através da cânula arterial para retirar o sangue restante do leito vascular. Para a configuração da perfusão, coloque os pulmões isolados cuidadosamente na câmara pulmonar. Conecte a traqueia ao transdutor na tampa da câmara e conecte os vasos cânulados ao sistema de perfusão, em seguida, feche e proteja a câmara com a trava rotativa.
Em seguida, conecte a tampa da câmara e troque sobre a torneira para passar de ventilação de pressão positiva para negativa. Perfumar os pulmões com 200 mililitros de perfusato artificial sem sangue começando com o fluxo a três mililitros por minuto por quilograma, em seguida, lentamente intensificar o fluxo ao longo de cinco minutos para cinco mililitros por minuto por quilograma. E durante os próximos cinco minutos, permita que o fluxo atinja oito mililitros por minuto por quilograma, seguido por um fluxo máximo de 10 mililitros por minuto por quilograma durante cinco minutos.
Ventile os pulmões com ar umidificado a uma frequência de 30 batidas por minuto, um volume de maré de 10 mililitros por quilograma e uma pressão expiratória final de dois centímetros de coluna de água. Para alcançar as três condições da zona, aguarde de 10 a 15 minutos para obter um equilíbrio caracterizado por um estado gravimétrico ISO, garantindo que a pressão venosa seja estável em todo o registro. Certifique-se de que o peso do pulmão permanece constante e as pressões auriculares e esquerdas são estáveis para alcançar a zona três condições para abrir um número máximo de vasos pulmonares e manter o teor de leito microvascular durante o experimento.
Para o controle eletrônico e processamento de sinais, certifique-se de que o fluxo respiratório, as alterações de peso, a pressão microvascular, o volume da maré, a resistência vascular, entre outros, sejam registrados em uma unidade eletrônica central múltipla que integra sinais provenientes dos transdutores e os exibe no sistema de avaliação. Foram avaliadas a concentração de 5-HT e monoamina oxidase envolvidas no metabolismo pulmonar e permeabilidade vascular. A concentração de 5-HT e monoamina oxidase atingiu o pico após 15 minutos de preservação e depois diminuiu durante as seis horas seguintes.
Posteriormente, os níveis de perfusão apresentaram aumento não estatisticamente significativo até 24 horas. As taxas de liberação de 5-HT e monoamina oxidase indicaram que durante a primeira hora da preservação, os níveis de 5-HT subiram mais alto do que a monoamina oxidase e diminuíram dentro de seis horas após serem recapturados por células e plaquetas endoteliais, bem como o catabolismo mediado pela monoamina oxidase. A atividade de endopeptidase neutra aumentou em nove horas e depois diminuiu e permaneceu estável durante 12 a 24 horas.
A atividade enzimária conversor de angiotensina diminuiu após quatro horas, depois aumentou e permaneceu estável ao longo do tempo até 24 horas. O efeito da preservação pulmonar na permeabilidade capilar foi avaliado por 24 horas, indicando que o pulmão perfusado sofreu um aumento progressivo no coeficiente de filtragem capilar. Verificou-se o efeito de diferentes aditivos na permeabilidade capilar do sistema isolado de perfusão pulmonar em diversas condições e observado um aumento máximo da permeabilidade com atropina.
A manobra mais importante é colocar corretamente os pulmões em uma câmara pulmonar e conectar os vasos canulados ao sistema de perfusão. As implicações dessa técnica se estendem para interações entre substâncias circulatórias e os efeitos de substâncias inaladas ou perfundadas como no teste de drogas e em várias patologias pulmonares.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
A preparação de pulmão isolado de coelho é uma ferramenta fundamental na pesquisa pulmonar, permitindo o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos. Esta técnica facilita a caracterização da fisiologia e patologia pulmonar por meio da medição de atividades metabólicas e da função respiratória.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa pulmonar
- Fisiologia
- Patologia
Antecedentes
- O sistema de perfusão pulmonar isolado permite o estudo de um órgão funcional completo.
- Este método recria a ventilação e a perfusão para análise contínua da função fisiológica.
- Fornece informações sobre as capacidades não respiratórias dos tecidos pulmonares.
- Os componentes principais incluem as atividades dos macrófagos alveolares e do tecido endotelial.
Objetivo do Estudo
- Descrever a técnica de preparação do pulmão isolado de coelho.
- Investigar a reatividade das vias aéreas e a preservação pulmonar.
- Apoiar pesquisas pré-clínicas em transplante pulmonar e edema pulmonar.
Métodos Utilizados
- Montagem do aparelho de trabalho com componentes essenciais.
- Conexão dos transdutores à unidade eletrônica central.
- Preparação do sistema de ventilação.
- Realização de procedimentos cirúrgicos no coelho anestesiado.
Resultados Principais
- A técnica permite a medição detalhada da função respiratória.
- Amplia a compreensão das atividades metabólicas nos tecidos pulmonares.
- Facilita o estudo de diversos componentes pulmonares.
- Fornece um modelo confiável para pesquisas pré-clínicas.
Conclusões
- O preparo de pulmão isolado de coelho é uma ferramenta de pesquisa valiosa.
- Ele contribui significativamente para a compreensão da fisiologia e da patologia pulmonar.
- Este método é essencial para o avanço da pesquisa em doenças relacionadas ao pulmão.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sistema de perfusão pulmonar isolado permite a avaliação direta das respostas pulmonares a compostos farmacológicos em um modelo ex vivo fisiologicamente relevante. Essa abordagem apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas mediante a medição de atividades metabólicas, permeabilidade vascular e função respiratória em um sistema de órgão completo. Ele fornece confiança preditiva para a identificação de compostos líderes na descoberta de fármacos respiratórios, simulando a fisiologia pulmonar relevante ao ser humano sem a variabilidade de animais inteiros.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação do engajamento de alvos pulmonares mediante a avaliação da atividade metabólica de macrófagos alveolares e do tecido endotelial.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos pulmonares por meio da medição em tempo real da mecânica respiratória e das respostas vasculares.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos mecanicistas pela quantificação do coeficiente de filtração capilar (Kfc) para avaliar a formação de edema e a integridade da barreira.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece dados quantitativos e com resolução temporal sobre enzimas metabólicas pulmonares, como cinética de liberação de 5-HT e monoamina oxidase.
- Valor Operacional: Padroniza parâmetros de perfusão e ventilação (por exemplo, volume corrente de 10 mL/kg, PEEP de 2 cm H₂O) para testes reprodutíveis de compostos.
- Prontidão do Ensaio: Permite a avaliação de substâncias inaladas ou perfundidas sobre a fisiologia pulmonar sob condições controladas de zona três.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Modela a dinâmica da perfusão pulmonar humana para apoiar a avaliação pré-clínica de candidatos a fármacos pulmonares.
- Alinhamento de Biomarcadores: Acompanha alterações na atividade enzimática (por exemplo, enzima conversora da angiotensina, endopeptidase neutra) como biomarcadores translacionais da preservação pulmonar.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite a avaliação longitudinal da viabilidade pulmonar (janela de 5–8 h) para orientar critérios de prosseguimento ou interrupção no desenvolvimento de terapias pulmonares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema de perfusão pulmonar isolado insere-se na sequência de descobertas que vai da validação do alvo até a avaliação pré-clínica, permitindo o aprimoramento iterativo de candidatos a fármacos pulmonares com base em leituras funcionais em nível de órgão.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos pulmonares por meio do monitoramento em tempo real de saídas metabólicas e respiratórias.
- Triagem: Fornece dados padronizados e quantitativos de perfusão e ventilação essenciais para a reprodutibilidade de ensaios e classificação de compostos.
- Análises: Gera pontos finais mensuráveis, incluindo coeficiente de filtração capilar (Kfc), resistência vascular, volume corrente e taxas de liberação enzimática, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta a fase inicial de descoberta à continuidade pré-clínica ao modelar a preservação pulmonar e a progressão de lesões relevantes para humanos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testes iterativos de múltiplos compostos ou condições dentro de uma janela de viabilidade definida.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na resposta pulmonar ao fármaco.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de cânulação, perfusão e ventilação.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de riscos pulmonares, reduzindo a eliminação em fases tardias.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em indicadores de segurança pulmonar e respostas funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas cirúrgicas em roedores, canulação vascular e obtenção do bloco cardiorrespiratório.
- Depende de instrumentação de precisão, incluindo pneumotacógrafo, transdutor de peso e unidade eletrônica central para integração de sinais.
- Necessita padronização entre equipes dos fluxos de perfusão (3–10 mL/min/kg) e parâmetros de ventilação (30 rpm, volume corrente de 10 mL/kg).
- Envolve considerações de adaptação para diferentes espécies ou modelos de doença devido a respostas vasculares e metabólicas específicas de cada espécie.
- Limitado pelo aumento progressivo do coeficiente de filtração capilar ao longo do tempo, restringindo a duração do experimento a 5–8 horas antes do desenvolvimento significativo de edema.
