Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Medir a frequência cardíaca intrínseca é um importante indicador de saúde cardíaca. Esta técnica mede com precisão essa taxa, excluindo a maioria das influências confusas no nó sinoatrial. O registro mea de frequência cardíaca intrínseca captura dados precisos de taxa de disparo semelhantes a gravações unicelulares sem treinamento extenso de eletrofisiologia.

Os indivíduos que utilizam essa técnica podem ter dificuldade em obter preparações saudáveis de tecidos em experimentos iniciais, por isso praticam a dissecção e otimizam os buffers e as configurações de coleta de dados antes de iniciar a coleta real de dados. Demonstrando o procedimento estarão os doutores Man Si e Praveen Kumar, pesquisadores de pós-doutorado no meu laboratório. Comece segurando a pele do rato eutanizado com um hemostato e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão transversal na pele logo abaixo do fundo da caixa torácica do arco costal esquerdo para o arco costal direito.

Use uma tesoura cirúrgica para cortar o peritônio e separar cuidadosamente o fígado do diafragma sem cortar o fígado para evitar sangramento excessivo. Incise o diafragma ao longo do tórax para expor a cavidade torácica. Use a tesoura cirúrgica para cortar as paredes laterais da caixa torácica das bordas dos arcos costais até as clavículas para expor o coração e, em seguida, use uma agulha de seringa calibre 23 para fixar a caixa torácica sobre o ombro.

Use uma pipeta de transferência para soltar a solução quente heparinizada completa de Tyrode no coração para mantê-la úmida. Segure os pulmões com fórceps graefe extra finos e corte a traqueia com uma tesoura cirúrgica para remover os pulmões. Para remover o coração, segure o ápice do coração com fórceps graefe extra finos e corte a aorta e a veia cava inferior com uma tesoura cirúrgica.

Transfira o coração para uma placa de Petri contendo elastômero de silicone curado e use uma pipeta de transferência para banhar o coração com dois a três mililitros de solução completa de Tyrode heparinizada quente. Coloque o ápice do coração no prato com um pino de dissecção. Segure a veia cava inferior com o a fórceps de laminectomia Dumont 2.

Insira uma agulha de seringa de calibre 22 através da cava vena inferior e superior para localizar sua posição no átrio direito, que também identifica a posição aproximada do nó sinoatrial. Segure o apêndice atrial direito com fórceps de laminectomia Dumont 2, e coloque um pino de dissecção através do apêndice atrial direito para mantê-lo no lugar. Repita o mesmo procedimento para o apêndice atrial esquerdo e remova a agulha de seringa que abrange a cavae vena.

Use a tesoura Castroviejo para remover o ápice do coração fazendo uma incisão transversal através dos ventrículos para liberar o sangue do coração, em seguida, lave o coração adicionando a solução quente heparinizada completa de Tyrode. Use a tesoura Castroviejo para cortar ao longo do septo atrioventricular até que a ária seja separada dos ventrículos e mantenha a incisão mais próxima do ventrículo. Corte ao longo do septo interarterial para remover o átrio esquerdo.

Coloque os pinos de dissecção na periferia do átrio direito para deixá-lo liso. Remova qualquer gordura, vasos ou tecido restantes do átrio usando a tesoura Castroviejo e localize o nó sinoatrial no átrio direito. Adicione a solução da Tyrode ao modelo de solução de entrada e ligue o fluxo de gás carbógeno para oxigenar a solução do Tyrode.

Defina a bomba peristáltica para 25 RPM, o que dá uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Depois de ligar a bomba, certifique-se de que o buffer não está vazando do sistema e coloque o controlador de temperatura em 37 graus Celsius. Use o Dumont 55 fórceps para transferir o tecido dissecado da placa de Petri dissecando para a grade de matriz de microeletrodos.

Posicione suavemente o tecido com um pincel macio para sobrepor a região do nó sinoatrial da grade de eletrodos. Em seguida, coloque a malha sobre o tecido usando os fórceps ósseos ou quaisquer fórceps curvos. Usando os fórceps ósseos, posicione a âncora da harpa na malha para manter tudo no lugar.

Disponha o prato de matriz de microeletrodes na placa do conector. Coloque cuidadosamente a tampa de perfusão no prato de matriz de microeletrídula sem perturbar a âncora da fatia de harpa e fixar a lacuna de perfusão com fita. Ligue o amplificador e configure um fluxo de trabalho para a gravação no software.

Selecione beat_recording. modelo moflo. Abra-o e defina o número de vestígios, duração do traço, intervalo de rastreamento, tensão de entrada, taxa de amostragem e outros parâmetros de gravação de acordo com as condições de gravação desejadas.

Clique no botão gravar e reproduzir para iniciar a gravação e adquirir dados para 10 traços de duração de um minuto com dois minutos de intervalos entre os traços. Pause a bomba e troque a tubulação de entrada da bomba da solução de gravação normal para a solução de Tyrode contendo a droga desejada de escolha. Reinicie a bomba e retome a gravação.

Uma vez que a solução de Tyrode infundida com drogas tenha atingido o tecido, registos da mesma maneira que feito anteriormente para as gravações da linha de base. Tire uma foto final do posicionamento do tecido na matriz de microeletrodos. Abra o arquivo de dados gravado salvo no modelo de análise de frequência beat do software de análise.

Clique na reprodução e permita que toda a gravação seja executada para visualização de dados e, em seguida, atribua parâmetros de análise apropriados. Selecione os canais a serem incluídos na análise e defina os valores de limiar de amplitude maxima ou amplitude da amplitude desejados para identificação automatizada de pico de forma de onda. Clique no ícone de reprodução novamente para refazer o conjunto de dados e confirmar que os parâmetros de análise são apropriados para uma extração de pico.

Para análise, identifique os três traços consecutivos mais estáveis que apresentam uma taxa de espancamento estável para cada traço na maioria dos canais durante o período de base do experimento e outros três traços estáveis consecutivos durante o período de exposição à droga. Clique no ícone de reprodução e gravação para iniciar a análise. Os dados foram coletados de um rato suíço preto de 45 dias para a medição da frequência do nódulo sinoatrial.

As formas de onda com diferentes formas e amplitudes foram observadas em diferentes canais e todos os canais apresentaram intervalos interspike idênticos e frequências de disparo. No entanto, o grau de contato tecidual com o eletrodo também pode influenciar as características da forma de onda, como amplitude. Dos 10 traços registrados, foram escolhidos os três canais consecutivos com frequência de batida estável e intervalo de interspike para análise posterior.

Os padrões de pico extraídos ruins devem estar ausentes, mas se presentes são influenciados pelo ruído ou instáveis. As formas de onda que correspondem a batimentos cardíacos individuais refletem atividade de pacemaking cardíaco intrínseco. O sistema de matriz de microeletrodos permite fácil aplicação de agentes medicamentosos para analisar os efeitos farmacológicos.

A taxa de disparo intrínseca de três vestígios selecionados em todos os 64 canais foi encontrada em aproximadamente 320 batidas por minuto nos dados amostrais. A introdução de 4-aminopirimidina aumentou os intervalos de interspike como esperado, o que diminuiu a frequência de batidas de 320 para 210 batidas por minuto. Para coletar dados confiáveis para análise, é importante confirmar que o tecido é saudável durante o registro, verificando se os traços são estáveis e atendem aos critérios padrão.

Os MEAs podem ser usados para registrar atividade cardíaca em outras regiões do coração, permitindo uma caracterização detalhada específica da região que é favorável a estudar os efeitos da manipulação genética e farmacológica.