Name: Preparação da Solução Naringenin para Aplicação In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a preparar solução de naringenina para administração intraperitoneal em estudos farmacológicos. Este protocolo simples e econômico utiliza DMSO, Tween 80 e solução salina para avaliar efeitos antidiabéticos e osteoporóticos em modelos animais.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973607 e 81573992).

As investigações descritas estavam em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa e foram aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Ao realizar os experimentos, jalecos, luvas nitrílicas descartáveis e óculos de proteção são necessários para fins de segurança.
1. Preparação de solventes e estimativa da naringenina necessária para aplicação in vivo
<ol><li>Preparar os seguintes solventes: Tween-80 (faixa de concentração final: 0,5%-1%), DMSO, glicerina (faixa de concentração final: 15%-20%), etanol (faixa de concentração final: 12% para injeção intramuscular)22 e 0,9% PS.</li>
	<li>Estime a quantidade de naringenina necessária com base na dose, número de camundongos e frequência de injeção.<ol><li>Encomende 10 ratos (C57BL/6, macho, 5 semanas de idade, SPF) para administrar naringenina 5 dias por semana durante 8 semanas. Mantenha os ratos em condições específicas livres de patógenos (SPF). NOTA: A dose necessária para a injeção intraperitoneal é de 20 mg/kg de p.c.23.</li>
		<li>Pesar 160 mg de naringenina com base no seguinte cálculo: 20 mg/kg x 0,02 kg/rato x 10 ratinhos x 5 dias/semana x 8 semanas = 160 mg.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular a concentração de naringenina a injetar in vivo.<ol><li>Prepare o volume recomendado com base no peso corporal dos camundongos. O volume recomendado de naringenina aplicado a cada rato é de 1% do peso corporal (0,3 ml). Neste experimento, foram utilizados 0,2 mL por camundongo.</li>
		<li>Calcule o volume total: 0,2 mL por camundongo x 10 camundongos x 5 dias/semana x 8 semanas = 80 mL.</li>
		<li>Calcular a concentração do Naringenina em stock: 160 mg/80 ml solventes = 2 mg/ml.</li>
		<li>Calcule o volume para cada dia: 0,2 mL por rato x 10 camundongos = 2 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dissolução
<ol><li>Solução de etanol<ol><li>Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,52 mg de naringenina e adicioná-la a um tubo de 2,0 mL. NOTA: Para atingir uma concentração de 2 mg/mL, o volume total necessário será de 1760 μL (cálculo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/mL).</li>
		<li>Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer com que o pó de naringenina se deposite no fundo do tubo (Figura 1A).</li>
		<li>Adicionar 8,8 μL de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 0,5% (v/v) em relação ao volume total necessário2. Naringenin não se dissolve completamente (Figura 1B).</li>
		<li>Continue a adicionar 79,2 μL de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin não se dissolve completamente (Figura 1B).</li>
		<li>Adicionar 1672 μL de 0,9% PS ao tubo contendo 5% de etanol, conforme descrito na etapa 2.1.4. Isso produzirá uma emulsão (Figura 1D). Centrifugar (2000 x g por 30 s) a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida aparecem na solução (Figura 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Solução DMSO<ol><li>Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,95 mg de naringenina e adicionar a um tubo de 2,0 mL. NOTA: Para atingir uma concentração de 2 mg/mL, o volume total necessário será de 1975 μL (cálculo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/mL).</li>
		<li>Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer o pó de naringenina se depositar no fundo do tubo.</li>
		<li>Adicionar 9,8 μL de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 0,5% (v/v) (cálculo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 2A).</li>
		<li>Adicionar 88,2 μL de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 2B).</li>
		<li>Adicionar 1877 μL de 0,9% PS (v/v por cento de 95%) à solução preparada no passo 2.2.4. Uma emulsão é produzida (Figura 1C). Centrifugar (2000 x g por 30 s) a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida aparecem na solução (Figura 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Solução Tween-80 e DMSO<ol><li>Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/ml, pesar 6,69 mg de naringenina e adicionar num tubo de 5,0 ml. NOTA: Para atingir a concentração final de 2 mg/mL, o volume total de solução necessário será de 3345 μL (cálculo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/mL).</li>
		<li>Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer o pó de naringenina se depositar no fundo do tubo.</li>
		<li>Adicionar 117,7 μL de DMSO para preparar uma solução a 3,5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 3A)</li>
		<li>Adicionar 117,7 μL de Tween 80 à solução preparada no passo 2.3.3 para obter 3,5% (v/v) de Tween 80 e 3,5% (v/v) de DMSO. Observe a dissolução completa da naringenina (Figura 3B)</li>
		<li>Adicionar lentamente a solução preparada na etapa 2.3.4 a um tubo de 5,0 mL contendo 3109,6 μL de PS a 0,9% (v/v por cento de 93%) e agitar bem para obter uma solução aparente de naringenina (Figura 3C).</li>
		<li>Deixar a solução preparada na etapa 2.3.5 permanecer à temperatura ambiente (RT) por 2 h. A solução ainda é aparente sem quaisquer precipitados visíveis (Figura 3D).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução de naringenina para administração in vivo<ol><li>De acordo com a etapa 1.2.2, pesar 160 mg de naringenina (160 mg / 2 mg / mL = 80 mL).</li>
		<li>Adicionar 2,8 mL de DMSO para obter solução a 3,5% (v/v) (cálculo: 2,8 mL / 80 mL x 100% = 3,5%)</li>
		<li>Em seguida, adicione 2,8 mL de Tween 80 à solução preparada na etapa 2.4.2 para atingir 3,5% (v/v) Tween 80 e 3,5% (v/v) de DMSO.</li>
		<li>Aliquotar a solução preparada na etapa 2.4.3 em quatro tubos, 1,4 mL por tubo [(2,8 mL + 2,8 mL) / 4 = 1,4 mL].</li>
		<li>Alíquota de 18,6 mL de 0,9% PS a cinco tubos de 15 mL.</li>
		<li>Conservar a solução preparada nas fases 2.4.3 (solução-mãe) e 2.4.5 a 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).</li>
		<li>Tomar 140 μL da solução-mãe (passo 2.4.3) e misturá-la com 1860 μL de PS a 0,9% para preparar 2 ml de solução de naringenina durante 1 dia de administração.</li>
		<li>Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Administração da solução de naringenin
<ol><li>Manuseio e contenção<ol><li>Pulverize a gaiola e as mãos com álcool 70-75% antes de abrir a tampa. Levante o rato pela base da cauda e coloque-o sobre uma superfície sólida para posicionar a cauda suavemente para trás.</li>
		<li>Segure o pescoço atrás das orelhas com o polegar esquerdo e o dedo indicador e posicione a cauda entre o dedo pequeno e o dedo anelar. Mantenha o rato em decúbito dorsal com a sua extremidade posterior ligeiramente elevada.</li>
	</ol></li>
	<li>Injecção<ol><li>Segure a pele traseira do rato para que a pele abdominal fique tensa.</li>
		<li>Empurre a agulha (seringa de insulina) em um ângulo de 10 ° entre a agulha e a superfície abdominal, no quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen para evitar atingir a bexiga, o fígado ou outros órgãos internos.</li>
		<li>Passe a agulha por via subcutânea em uma direção craniana por 3-5 mm e, em seguida, insira-a em um ângulo de 45 ° na cavidade abdominal.</li>
		<li>Quando a agulha passar pela parede abdominal e a resistência desaparecer, realize uma aspiração para confirmar que nenhum material de refluxo é retirado. Em seguida, empurre lentamente a solução.</li>
		<li>Após a injeção, puxe lentamente a agulha para fora e gire-a ligeiramente para evitar vazamentos. O volume recomendado é de 50-100 μL/10 g.</li>
		<li>Descarte as sobras de Naringenin em um recipiente de risco biológico.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Teste de glicose no sangue
NOTA: Teste a glicose no sangue 1 dia antes da injeção e 1 e 2 meses após a injeção.
<ol><li>Jejue os ratos por 15 h antes do teste de glicose no sangue. A água pode continuar a ser fornecida.</li>
	<li>Abra as tiras de teste e marque a data. Uma vez abertas, use as tiras de teste dentro de 3 meses. Conservar as tiras de ensaio a 2-30 °C. Feche bem a tampa depois de remover a tira para evitar a formação de umidade.</li>
	<li>Coloque o animal na câmara de indução. Ligue o vaporizador a um nível de indução de 4% para o isoflurano e 4 L/min para o oxigénio. Após o animal estar totalmente anestesiado, manter o anestésico com o cone nasal e o anestésico a um nível de 1,5% para isoflurano e 0,4 L/min para oxigênio.</li>
	<li>Limpe a cauda com bolas de algodão / cotonetes embebidos em álcool de 70% a 75%.</li>
	<li>Começando pelo ponto mais baixo da cauda, faça uma pequena punção na veia lateral da cauda com uma picada de agulha 25G e esprema uma gota de sangue.</li>
	<li>Limpe a gota de sangue com um papel de seda.</li>
	<li>Esprema outra gota de sangue e colete-a na borda de uma tira de teste.</li>
	<li>Leia e registre o resultado exibido no medidor de glicose.</li>
	<li>Para parar o sangramento, aperte a cauda do rato com uma gaze estéril e limpe a área com álcool a 75%.</li>
	<li>Amostras adicionais podem ser obtidas por uma técnica semelhante movendo-se para cima da cauda cranialmente.</li>
</ol>5. Coloração TRAP
<ol><li>Preparação de slides<ol><li>Realize testes de glicose no sangue em jejum nos ratos uma vez por semana. Quando os níveis de glicose no sangue estiverem ≥ 11,1 mmol / L (indicativo de camundongos com diabetes tipo II bem-sucedidos modelo 24), eutanasie os camundongos usando CO2, seguido de disclocação cervical, e colete o 4º-6º lombar (L4-L6) (nenhuma eutanásia é realizada durante o teste de glicose no sangue em jejum).</li>
		<li>Fixe as amostras de L4-L6 com paraformaldeído a 4% por 24 h (certifique-se de que o volume de paraformaldeído seja >20x o volume do tecido) e, em seguida, lave por 2 h em fluxo contínuo de água da torneira.</li>
		<li>Para descalcificar as amostras, mergulhe-as em uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% por 2 semanas no RT em condição estática até que as amostras sejam amolecidas. Certifique-se de que o volume da solução descalcificante é de 20-30 vezes o volume do tecido/amostra. Mude a solução EDTA a cada dois dias.</li>
		<li>Desidratar a amostra com um desidratador.<ol><li>Coloque os espécimes no processamento de tecidos incorporando. Numere o usando um lápis.</li>
			<li>Defina o programa de desidratador da seguinte forma: álcool a 75% por 2 h, álcool a 85% por 1 h, álcool a 95% por 1 h, álcool a 95% por 2 h, etanol anidro (I) por 2 h, etanol anidro (II) por 2 h, etanol anidro (III) por 2 h, xileno (I) por 1 h, xileno (II) por 1 h, xileno (III) por 1 h, xileno (III) por 1 h, cera de parafina (I) por 2 h, e cera de parafina (II) por 2 h, a RT.</li>
		</ol></li>
		<li>Incorpore as amostras em cera de parafina.<ol><li>Adicionar cera de parafina ao tabuleiro de da estação de incorporação de parafina e aquecer a 60 °C. Imergir os espécimes desidratados durante, pelo menos, 2 h.</li>
			<li>Coloque o de tecido na bandeja do e pré-aqueça.</li>
			<li>Adicionar cera de parafina ao reservatório de parafina e aquecer a 60 °C.</li>
			<li>Após 2 h, leve o de tecido e os espécimes para a área de trabalho. Despeje a cera de parafina pré-aquecida do reservatório de parafina no de tecido. Coloque a amostra na cera de parafina, certifique-se de que a cera de parafina cubra completamente o tecido e, em seguida, mova imediatamente o para uma estação de gelo.</li>
			<li>Use um micrótomo para cortar as amostras embutidas em parafina em seções de 5-6 μm. Desdobre as seções em água morna a 40 °C por menos de 10 s. Colete as seções em lâminas de vidro revestidas com APS (amino silano). Secar as lâminas a RT durante 1 h e, em seguida, movê-las para um forno regulado a 60 °C durante a noite.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do reagente TRAP<ol><li>Preparar solução básica de incubação de estoque: Dissolver 9,2 g de acetato de sódio anidro, 11,4 g de ácido tartárico L-(+) e 2,8 mL de ácido glacial em 1000 mL de água destilada. Ajuste o pH para 4,7-5,0 e armazene no RT por até 6 meses.</li>
		<li>Preparar solução de naftólio-éter: Dissolver 0,1 g de fosfato de naftol AS-BI em 5 ml de éter monoetílico de etilenoglicol. Conservar a 4 °C durante 5 semanas.</li>
		<li>Preparar solução de nitrito de sódio: Dissolver 1 g de nitrito de sódio em 25 mL de água destilada. Conservar a 4 °C.</li>
		<li>Preparar corante Pararosanilina: Adicionar 1 g de base de pararosanilina a 20 mL de HCl 2N (83 mL de HCl em 417 mL de água). Use uma placa de agitação para dissolver a base e filtrá-la antes de usá-la.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração TRAP<ol><li>Encher dois frascos Coplin com 50 mL de solução básica de incubação de estoque e colocar em forno a 37 °C por 2 h.</li>
		<li>Pegue um frasco de Coplin e adicione 0,5 mL de solução de éter de naptol.</li>
		<li>Colocar as lâminas no frasco de Coplin e incubar a 37 °C durante 1 h. Observação : Prepare pelo menos três slides para cada grupo.</li>
		<li>Poucos minutos antes do término do tempo de incubação, adicione 1 mL de solução de nitrito de sódio e 1 mL de corante pararosanilina. Misture suavemente por 30 s e deixe por 2 min.</li>
		<li>Adicionar a solução preparada na fase 5.2.2 ao outro frasco de Coplin pré-aquecido que contém a solução-mãe de base. Misture bem a solução e insira as lâminas do frasco de Coplin na etapa 5.3.3.</li>
		<li>Incubar por 15-20 min em RT.</li>
		<li>Lave as fatias em outro frasco Coplin com 200 mL de PBS por 5 min.</li>
		<li>Contra-manchar as fatias com 100% de hematoxilina por 30 s em um frasco de Coplin.</li>
		<li>Desidrate as fatias com álcool 85%, 95% e 100% (200 mL) por 2 min cada e trate em xileno (200 mL) por 2 min por 3x. Use frascos Coplin para realizar cada etapa.</li>
		<li>Prenda a seção no vidro da tampa com uma tampa usando resina. Certifique-se de evitar o aprisionamento de bolhas de ar.</li>
	</ol></li>
</ol>6. ELISA
<ol><li>Preparação da amostra<ol><li>Remova os tecidos moles do fêmur e da tíbia do rato. Limpe os ossos com gaze.</li>
		<li>Colocar as amostras ósseas num tubo de microcentrífuga de 1 ml e armazenar os tubos de amostra a -80 °C. NOTA: As amostras também podem ser armazenadas em um tanque de nitrogênio líquido por não mais de 6 meses.</li>
		<li>Pesar a amostra óssea. Diluir com 0,9% PS na proporção de 1:10. Por exemplo, dilua 0,1 g de osso com 1 mL de PS.</li>
		<li>Adicione grânulos de zircônia de 3 mm no tubo e triture as amostras 3x a 70 Hz por 30 s com descanso de 20 s no meio.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 4 °C e 12.000 x g durante 5 minutos. Colete o sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de ensaio ELISA NOTA: Execute ELISA de acordo com o protocolo de ensaio especificado pelo fabricante.<ol><li>Adicionar 100 μL de cada diluição de padrão, em branco e amostra nos poços apropriados. Incubar durante 90 min a 37 °C.</li>
		<li>Decantar o líquido de cada poço e adicionar 100 μL de solução de trabalho de anticorpos de detecção biotinilados. Incubar durante 1 h a 37 °C.</li>
		<li>Decantar a solução, adicionar 350 μL de tampão de lavagem a cada alvéolo. Mergulhe por 1 min, repita 3x.</li>
		<li>Adicione 100 μL de solução de trabalho conjugado HRP a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Decantar a solução. Repetir o processo de lavagem 5x conforme descrito na etapa 6.2.3.</li>
		<li>Adicionar 90 μL do reagente do substrato. Incubar durante 15 min a 37 °C protegido da luz.</li>
		<li>Adicionar 50 μL da solução de paragem.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um leitor de placas para registrar a absorvância de cada poço a 450 nm.</li>
	<li>Geração de curva padrão<ol><li>Traçar os respectivos valores médios de absorvância em relação às concentrações de proteínas diluídas em série.</li>
		<li>Junte os pontos para criar a melhor curva de ajuste. Use qualquer aplicativo de computador apropriado (planilha) para gerar a equação de curva padrão.</li>
	</ol></li>
	<li>Substituir o valor de absorvância de cada amostra na equação da curva padrão para obter a concentração da respectiva amostra.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação de solução fitoquímica é a base para a sua aplicação in vivo. Neste protocolo, o preparo da solução de naringenina foi demonstrado por meio do uso de diferentes solventes, como etanol, DMSO, Tween 80 e PS a 0,9%. A solução em estado completamente dissolvido precisa ser monitorada ainda mais, permitindo que permaneça à temperatura ambiente por algumas horas prolongadas e, em seguida, filtrada antes de ser usada in vivo.
A determinação de solventes é um passo críti...

Com o aumento dos estudos sobre o uso de compostos fitoquímicos para triagem de medicamentos, vale a pena dar atenção às abordagens para preparar soluções fitoquímicas para avaliar seus efeitos ótimos. Muitos aspectos, como a metodologia de dissolução, dosagem e concentração, devem ser considerados ao preparar o composto1.
A dissolução à base de solvente é amplamente utilizada para a preparação de compostos orgânicos1. Os solventes comumente usados incluem água, óleo, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Embora uma suspensão com substâncias não dissolvidas seja aceitável quando o composto é administrado por gavagem gástrica, um soluto totalmente dissolvido é crítico para administração intravenosa. Como a solução oleosa, a suspensão e a emulsão podem causar embolias capilares, sugere-se uma solução aquosa para o preparo de compostos, especialmente quando se administram injeções intravenosas, intramusculares e intraperitoneais3.
A faixa de dose efetiva varia entre os compostos e até mesmo entre as doenças tratadas com o mesmo composto. As determinações da dose efetiva e segura e da concentração dependem da literatura e de experimentos preliminares4. Aqui, a preparação do composto naringenina é demonstrada como um exemplo.
A naringenina (4,5,7-trihidroxi-flavanona), um composto polifenólico, tem sido estudada no tratamento da doença por suas atividades hepatoprotetoras5, antidiabéticas6, anti-inflamatórias7 e antioxidantes8. Para aplicações in vivo, a administração oral de naringenina é comumente usada. Estudos prévios relataram o preparo de solução de naringenina em carboximetilcelulose a 0,5%-1%, dose de metilcelulose a 0,5%, DMSO a 0,01% e solução salina fisiológica (PS) a 50-100 mg/kg, administrada por gavagem oral 9,10,11,12. Além disso, outros estudos relataram a suplementação de naringenina com ração a 3% (em peso/m) para ingestão oral na dose de 3,6 g/kg/d13,14. Estudos também relataram o uso de etanol (0,5% v/v), PS e DMSO para dissolver naringenina para injeção intraperitoneal a 10-50 mg/kg15,16,17,18. Em um estudo de epilepsia do lobo temporal, camundongos receberam uma injeção de naringenina suspensa em carboximetilcelulose a 0,25% dissolvida em PS19. Embora esses estudos relatem o uso de diferentes solventes para preparar soluções de naringenina, mais detalhes, como o estado de dissolução e a resposta animal, não foram relatados.
Este protocolo introduz um procedimento para preparar solução de naringenina para aplicação in vivo na osteoporose induzida por diabetes. A preparação da solução injetável inclui a preparação de solventes e compostos, estimativa de dosagem, processo de dissolução e filtração. A dosagem foi determinada com base em pesquisas bibliográficas e experimentos preliminares, monitorando camundongos após a administração de injeções todos os dias durante 3 dias e modificando a dosagem de acordo com os comportamentos dos camundongos. A concentração final escolhida (20 mg/kg de p.c.) foi administrada por via intraperitoneal 5 dias por semana durante 8 semanas em uma dieta rica em gordura e camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Os efeitos da naringenina na osteoporose diabética foram avaliados por meio de testes de glicose no sangue, micro-TC, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e ensaio imunoenzimático (ELISA).
No geral, observou-se que a naringenina em uma faixa de concentração de 40-400 mg/mL não se dissolveu completamente em etanol ou DMSO ou 5% (etanol ou DMSO) mais 95% PS (v/v). No entanto, a naringenina se dissolveu completamente em uma mistura de 3,52% de DMSO, 3,52% de Tween 80 e 92,96% de PS. O procedimento detalhado ajudará os pesquisadores a preparar o composto como uma solução de injeção para aplicação in vivo.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,5 mL</td><td>Corning Science (Wujiang) Co.</td><td>23218392</td><td>Holding líquido</td></tr><tr><td>Desidratador Automático</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Co.</td><td>LEICA ASP 300S</td><td>Desidratar amostras</td></tr><tr><td>Tiras de teste de glicose no sangue</td><td>Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>4130392 MIULAB</td><td>Centrífuga de minutos</td><td>Solução centrífuga</td></tr><tr><td>Desidratador</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.</td><td>LEICA&nbsp; ASP300S</td><td>Desidratação</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>Kit de</td> ensaio ELISA <td>de E918BA0041 Co-Solvente</td></tr><tr><td></td><td>Elabscience Biotechnology Co.,Ltd</td><td>Mouse COL1(Colágeno Tipo I) Kit ELISA: E-EL-M0325c Mouse&nbsp; Kit CTX I ELISA: E-EL-M0366c Kit PICP ELISA para Mouse: E-EL-M0231c Kit ELISA PINP para Mouse: E-EL-M0233c</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>Co-Solvente</td></tr><tr><td>Éter monoetílico de etilenoglicol</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>A501118-0500</td><td>Coloração TRAP</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009617</td> Filtro de <td>descalcificação</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millpore LTD.</td><td>Millex-GP, 0,22 e micro; </td><td>m solução de filtro</td></tr><tr><td>Ácido glacial</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td>coloração TRAP Medidor de</td></tr><tr><td>glicose</td><td>Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.</td><td>One Touch Ultra Vue</td><td>Número de série: COJJG8GW</td></tr><tr><td>Moedor</td><td>Shanghaijingxin Tecnologia Experimental</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>D005</td><td>Coloração TRAP</td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>Shanghai Kantaray Medical Devices Co.</td><td>0,33 mm x 13 mm, RW LB</td><td>Injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>L- (+) ácido tartárico</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>100220008</td><td>Microscópio de coloração</td></tr><tr><td></td><td>TRAP Microscópio de observação OLYMPUS</td><td>sz61</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>de observação Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.</td><td>LEICA RM 2135</td><td></td></tr><tr><td>Seção Mini centrífuga</td><td>Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd.</td><td>&nbsp; Centrífuga Mini-6KC</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-BI fosfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>BCBS3419</td><td>coloração</td></tr><tr><td>Naringenin</td><td>Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>102764</td><td></td></tr><tr><td>Estação de incorporação de parafina</td> de soluto <td>Leica Microsystems (Shanghai) Co.</td><td>LEICA&nbsp; EG 1150 H, LEICA&nbsp; EG 1150 C</td><td>Amostras de incorporação</td></tr><tr><td>Base de pararosanilina</td><td>BBI Life Sciences</td><td>E112BA0045</td><td>coloração TRAP</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>eppendorf</td><td>2&ndash; 20 &micro; L, 100&ndash; 1000 &micro; L, 20&ndash; 200 &micro; </td><td>Leitor de Placas Líquidas para transferência</td></tr><tr><td></td><td>BioTek Instruments USA, Inc.</td><td>Leitor de imagem BioTek CYTATION 3</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Resin</td><td>Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd.</td><td>Bálsamo neutro</td><td>TRAP coloração</td></tr><tr><td>salina (0,9 PS)</td><td>Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd</td><td>A6E1323</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Acetato de sódio anidro</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>Merck-1.06268.0250 | 250g</td><td>TRAP coloração</td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10020018</td><td>TRAP coloração</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A</td> zircônia do <td>emulsionante</td></tr><tr><td>de E819BA0006 perla a</td><td>moedura</td> experimental <td>11079125z 454g</td> de <td>Shanghaijingxin</td></tr></tbody></table>

preparação da solução naringenin para aplicação in vivo

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

A preparação de uma solução composta (fitoquímica) é uma etapa negligenciada, mas crítica, antes de sua aplicação em estudos como a triagem de medicamentos. A solubilização completa do composto é necessária para o seu uso seguro e resultados relativamente estáveis. Aqui, um protocolo para o preparo de solução de naringenina e sua administração intraperitoneal em uma dieta rica em gordura e modelo diabético induzido por estreptozotocina (STZ) é demonstrado como exemplo. Uma pequena quantidade de naringenina (3,52-6,69 mg) foi usada para testar sua solubilização em solventes, incluindo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) e DMSO mais Tween 80 reconstituído em solução salina fisiológica (PS), respectivamente. A solubilização completa do composto é determinada observando a cor da solução, a presença de precipitados após a centrifugação (2000 x g por 30 s) ou permitindo que a solução permaneça por 2 h à temperatura ambiente (RT). Após a obtenção de um composto estável/solução fitoquímica, a concentração/quantidade final do composto necessária para estudos in vivo pode ser preparada numa solução-mãe apenas com solvente (sem PS) e, em seguida, diluída/misturada com PS conforme desejado. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina em camundongos (administração intraperitoneal a 20 mg/kg de p.c., 2 mg/mL) foram avaliados pela medição da glicemia, massa óssea (micro-TC) e taxa de reabsorção óssea (coloração TRAP e ELISA). Os pesquisadores que procuram preparações detalhadas de soluções orgânicas / fitoquímicas se beneficiarão dessa técnica.

Verificou-se que o peso corporal dos camundongos diabéticos alimentados com dieta rica em gordura e induzidos por STZ diminuiu quando comparado com o dos grupos controle de 0-8 semanas após o tratamento com STZ. A perda de peso dos ratos tratados com naringenina foi significativa em comparação com os ratos não tratados (grupo STZ) na semana 4. Os grupos controle e STZ foram administrados com o mesmo volume de PS (Tabela 1). O nível de glicose no sangue em ratos diabéticos aumentou drasticamente dentro de...

Aqui, o protocolo apresenta o preparo da solução de naringenina para administração intraperitoneal in vivo. A naringenina é totalmente dissolvida em uma mistura de dimetilsulfóxido, Tween 80, e solução salina. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina foram avaliados por teste de glicose no sangue, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato e ensaio de imunoabsorção enzimática.

Preparação da Solução Naringenin para Aplicação In Vivo

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The ...

Com o aumento dos estudos que dizem respeito aos componentes fitoquímicos para abordagens de triagem de fármacos para preparar solução fitoquímica para avaliação de efeitos ótimos, fui dando atenção às vantagens deste protocolo como operação simples e de baixo custo. Este protocolo beneficiará os pesquisadores que lidam com a triagem de drogas da farmacologia. Sugere-se começar com uma pequena quantidade de composto fitoquímico para experimentos preliminares, considerando o custo de consumo.Em segundo lugar, recomenda-se o uso de uma seringa de insulina sobre uma seringa regular Para preparar uma solução de naringenina de dois miligramas por mililitro em etanol, pese 3,52 miligramas de pó de naringenina e adicione-a a um tubo de dois mililitros. Gire rapidamente o tubo para assentar o pó no fundo do tubo. Em seguida, adicione 8,8 microlitros de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 0,5%.Em seguida, adicione 79,2 microlitros de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 5%. Em seguida, adicione 1,672 mililitros de solução salina fisiológica a 0,9% ao tubo que contém a solução a 5%. Isso produzirá uma emulsão.Em seguida, a centrífuga recusou o tubo para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida podem aparecer na solução. Em seguida, para preparar uma solução de naringenina de dois miligramas por mililitro em DMSO, pese 3,95 miligramas de pó de naringenina e adicione-o a um tubo de dois mililitros.Após um giro rápido, adicione 9,8 mililitros de DMSO ao tubo para preparar a solução a 8,5%. Em seguida, adicione 88,2 microlitros de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 5%. Em seguida, adicione 1,877 mililitros de solução salina a 0,9% à solução.Isso resultará em uma emulsão. Centrifugar a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida. Precipitados brancos têm naringenina não dissolvida pode aparecer na solução.Em seguida, para preparar uma solução de naringenina de dois miligramas por mililitro em Tween 80 e DMSO, pese 6,69 miligramas de pó de naringenina e adicione-o em um tubo de cinco mililitros. Gire rapidamente o tubo e adicione 117,7 microlitros de DMSO para preparar uma solução a 3,5%. Em seguida, adicione 117,7 microlitros de Tween 80 à solução para obter uma concentração de 3,5% Tween 80 e 3,5% DMSO.Adicione lentamente esta solução a outro tubo de cinco mililitros contendo 3109,6 microlitros de solução salina a 0,9% e agite bem para obter uma solução clara de naringenina. Após duas horas, a solução permanecerá límpida sem quaisquer precipitados visíveis. Para administrar a solução de naringenina, levante um rato C57 preto de seis machos C57 de cinco semanas de idade pela base de sua cauda e coloque-o em uma superfície sólida posicionando sua cauda para trás suavemente.Em seguida, segure o scruff do pescoço atrás das orelhas com o polegar esquerdo e o dedo indicador e posicione a cauda entre o dedo pequeno e anelar. Mantenha o rato em decúbito dorsal com a sua extremidade posterior ligeiramente elevada. Para injetar a solução de naringenina, segure a pele nas costas do rato para que a pele abdominal fique tensa.Em seguida, empurre a agulha para o quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen em um ângulo de 10 graus. para evitar atingir a bexiga, fígado ou outros órgãos internos. Passe a agulha por via subcutânea em uma direção craniana por três a cinco milímetros e, em seguida, insira-a em um ângulo de 45 graus na cavidade abdominal.Uma vez que a agulha passa através da parede abdominal, empurre lentamente a solução. Após a injeção, puxou lentamente a agulha para fora, girando-a ligeiramente para evitar vazamentos. Para realizar um teste de glicose no sangue, abra as tiras de teste e marque a data.Faça uma pequena punção na veia lateral da cauda com uma picada de agulha de calibre 25 e esprema uma gota de sangue. Depois de limpar a gota de sangue com papel de seda, esprema outra gota de sangue e colete-a na borda da tira de teste. Leia e registre o resultado exibido no medidor de glicose.O peso corporal da dieta rica em gordura alimentada e dos ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina foi diminuído em comparação com o dos ratos do grupo controle de zero a oito semanas após um tratamento com estreptozotocina. Na quarta semana, a perda de peso de camundongos tratados com naringenina foi significativa em comparação com camundongos não tratados. O nível de glicose no sangue nos ratos diabéticos aumentou drasticamente dentro de um mês após a indução da estreptozotocina.Após dois meses, diminuiu automaticamente para um nível observado há dois meses. Em contraste, o tratamento com naringenina reduziu os níveis de glicose no sangue em 51,8% em um mês e 34,8% em dois meses em comparação com STZ. Em comparação com os controles, os camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina exibiram perda óssea, conforme indicado por uma diminuição no volume ósseo por volume de tecido e no número de trabéculas.Enquanto isso, o tratamento com naringenina resgatou significativamente a perda óssea. A atividade dos osteoclastos, demonstrada pelo número de osteoclastos, por área óssea trabecular, foi aumentada em camundongos diabéticos, embora não tenha sido observada significância estatística entre os modelos controle e doença. A coloração TRAP de osso trabecular e osteoclastos de controle e camundongos induzidos por estreptozotocina é mostrada aqui.O tratamento com naringenina diminuiu significativamente as atividades dos osteoclastos. Nos animais diabéticos, o telopeptídeo C-terminal do colágeno tipo um foi elevado em 68,09% e o propeptídeo N-terminal do tipo um Pro-Collagen foi elevado em 204,88%, indicando um aumento dramático na taxa de reabsorção óssea. No entanto, o tratamento com naringenina diminuiu significativamente ambos os indicadores da taxa de reabsorção óssea.por isso é um desafio pipetar dosagem precisa. Cortar a ponta torna a pipetagem mais fácil e precisa. Alternativamente, o volume necessário pode ser convertido em uma massa, que pode ser posterior facilmente.O tempo de jejum de todos os animais antes de cada experimento de glicose na bexiga deve permanecer a coisa durante todo o experimento.

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Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe...

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

A água de sangria de produção (PBW) foi tratada com nanopartículas de óxido cúprico (CuO-NPs) e a toxicidade celular foi avaliada em células humanas cultivadas. O objetivo deste protocolo foi integrar a amostra ambiental nativa em um formato de cultura de células avaliando as mudanças na toxicidade devido ao tratamento com CuO-NP.

A remoção do Trace Elements por Óxido de Cupric nanopartículas de urânio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperação sangro água e seu efeito na viabilidade celular

Este manuscrito apresenta protocolos para a aplicação de novas sondas de óxido nítrico (NO•) geneticamente codificadas (geNOps) para monitorar flutuações de NO• de célula única em tempo real usando microscopia de fluorescência. A formação de NO• desencadeada por Ca2+ no nível de células endoteliais individuais foi visualizada combinando geNOps com um sensor químico de Ca2+.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Aqui, apresentamos a preparação de uma decocção er-xian (EXD) em quatro etapas - imersão, decocção, filtração e concentração - e demonstram a administração de um soro contendo EXD preparado para ratos. Estes métodos são aplicáveis ​​ao estudo in vivo e in vitro de decocções à base de plantas, como medicamentos tradicionais chineses.

Preparação de Fitoterapia: Decocção Er-Xian e Soro contendo Er-Xian para<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentos

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) de ROS (espécies reativas de oxigênio) eliminação na vivo, nanoceria de imagens em tecidos vegetais por microscopia confocal e na vivo monitoramento de nanoceria ROS eliminação pela microscopia confocal.

Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.

In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

O presente protocolo descreve uma operação detalhada de imagem de fluorescência NIR-II em tempo real de um rato usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II.

Uma sonda de fluorescência NIR-II brilhante para imagens vasculares e tumorais

Aqui, descrevemos um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) que compartilham a mesma origem biológica e estrutura, morfologia e composição proteica semelhantes de vesículas extracelulares nativas (EVs).

Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Aprenda a preparar solução de naringenina para administração intraperitoneal em estudos farmacológicos. Este protocolo simples e econômico utiliza DMSO, Tween 80 e solução salina para avaliar efeitos antidiabéticos e osteoporóticos em modelos animais.

Preparação da Solução Naringenin para Aplicação In Vivo

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