Name: Extração do Cofactor F420 para Análise do Comprimento da Cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Aprenda a extrair o cofator F420 para análise do comprimento da cauda poliglutama em culturas puras e amostras ambientais. Este método otimizado utiliza cromatografia líquida para estudar o metabolismo de procariotos.

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Agradecemos ao Prof. Colin Jackson pelo apoio com o cofactor F420 purificado. Esta pesquisa foi apoiada pelo Tyrolean Science Fund (TWF) e pela Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Reconhecemos muito o suporte de GPS, HK, SB, GG e HB.

NOTA: A extração e análise do cofato F420 é um processo de três etapas, incluindo lise amostral, pré-purificação de cofato por extração em fase sólida (SPE) e detecção de cofatores através de RP-HPLC (IP-RP-HPLC) com detecção de fluorescência. Antes de iniciar, prepare os materiais e reagentes conforme indicado na Tabela 1.
1. Lise amostral
<ol><li>Adicione até 5 g de amostra aos tubos apropriados (por exemplo, tubos cônicos de 50 mL).</li>
	<li>Adicione 5 mL do tampão de lise (solução de estoque 2x, Tabela 1) às amostras.</li>
	<li>Leve a um volume final de 10 mL com água destilada para atingir uma concentração final de 0,5 g·mL-1.</li>
	<li>Vórtice as amostras diluídas para 20 s.</li>
	<li>Autoclave por 30 min a 121 °C.</li>
	<li>Para amostras secas como solo florestal, traga para um volume final de 20 mL com água destilada após autoclaving e vórtice a amostra diluída. ATENÇÃO: O aumento da temperatura durante a autoclavagem pode causar a explosão dos tubos.</li>
</ol>2. Pré-purificação do cofator F 420 através de extração em fase sólida (SPE)
NOTA: Todas as etapas da SPE são conduzidas à temperatura ambiente
<ol><li>Esfrie as amostras em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar as amostras autoclavadas por 5 min a 11.000 x g.</li>
	<li>Prepare 5 mL SPE colunas preenchidas com 100 mg de sorbent polimérico de modo misto de ânion fraco.</li>
	<li>Condiciona o trocador de ânion com 3 mL de metanol (solução de condição, Tabela 1).</li>
	<li>Equilibre o trocador de ânion com 3 mL de água destilada (solução de equilíbrio, Tabela 1).</li>
	<li>Carregue até 9,0 mL do supernascido do lysate centrifuso na coluna SPE.</li>
	<li>Lave as impurezas com 5 mL de acetato de amônio de 25 mM (solução de lavagem spe 1, Tabela 1).</li>
	<li>Lave as impurezas com 5 mL de metanol (solução de lavagem spe 2, Tabela 1).</li>
	<li>Elute o cofator F420 em 1,0 mL de tampão de eluição (Tabela 1). NOTA: Prepare o tampão de eluição fresco. Devido ao vácuo aplicado e à alta pressão de vapor do tampão de elução, os volumes de eluição podem diferir de amostra para amostra. Para garantir o mesmo volume final em todas as amostras, recomenda-se pesar os vasos de coleta antes e depois da eluição e calcular o volume de eluição eficaz. Equilibre as diferenças com a adição de tampão de elução.</li>
</ol>3. Detecção do cofator F420
<ol><li>Coloque o forno a 40 °C e detector de fluorescência a 420 nm de comprimento de onda de extinção e comprimento de onda de emissão de 470 nm. Obter separação via modo gradiente utilizando as fases móveis A e B (Tabela 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B a uma vazão de 0,75 mL·min-1. NOTA: Garantia de equilíbrio das condições da coluna antes da injeção de amostras, lavando a coluna pelo menos com volumes de 3 colunas de 74% de fase móvel A e 26% de fase B móvel (Tabela 1).<ol>
<li>Filtre as amostras elucidadas da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 μm. NOTA: Recomenda-se os filtros PTFE com um tamanho de poros de 0,22 μm.</li>
		<li>Injete 50 μL da amostra elucida no sistema HPLC para analisar a composição e concentração do cofato F420 . NOTA: Como nenhum padrão quantitativo é usado neste protocolo, amostras e variantes devem ser comparadas por área de pico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para a avaliação do cofator F420 a partir de culturas puras metogênicas, pode-se realizar uma avaliação microscópica para visualizar o crescimento e a atividade (microscopia de fluorescência) dos microrganismos envolvidos (Figura 1). Para amostras derivadas de ambientes naturais, o uso de microscopia para detectar ou quantificar f420 é limitado devido a interferências com outros microrganismos fluorescentes, partículas orgânicas e inorgânicas. Neste contexto, a extração...

F420 é um cofator generalizado, mas muitas vezes negligenciado, que funciona como um portador obrigatório de hidreto de dois elétrons em processos metabólicos primários e secundários tanto da Archaea quanto das Bactérias1,2. F420 é um 5-deazaflavin e estruturalmente semelhante aos flavins, pelo qual suas propriedades químicas e biológicas são mais comparáveis com as de NAD+ ou NADP+. Devido à substituição de nitrogênio por carbono na posição 5 do anel isoalloxazine, é um forte redutivo, apresentando assim um baixo potencial de redox padrão de -340 mV1,3. F420 compreende um anel 5-deazaflavin e um linker 2-fospho-L-lactato (F420-0). Uma cauda oligoglutamate contendo monômeros de glutamato n+1 pode ser anexada à molécula (F420-n+1)4.
Por muito tempo, o cofator F420 tem sido associado exclusivamente com Archaea e Actinobacteria. Isso foi em grande parte anulado. Análises recentes revelaram que o F420 está distribuído entre diversos organismos anaeróbicos e aeróbicos da filo Proteobacteria, Cloroflexi, e potencialmente firmicutes que habitam uma miríade de habitats como solos, lagos e intestino humano1,5. Em 2019, Braga et al.6, mostraram que o proteobacterium Paraburkholderia rizoxinica produz um derivado F420 único, contendo um 3-fosfoglicerate em vez de uma cauda de 2 fosfolactato, que pode ser difundida em vários habitats. Dentro do domínio Archaea, f420 foi encontrado em várias linhagenias, incluindo methanogenic7, methanotrófico8,9, e ordens redutoras de sulfato10, e deve ser produzido em Thaumarchaeota11. F420 é mais conhecido como uma coenzima redox essencial em methanogênese metilotrófica e metilotrófica. A forma reduzida de F420 (F420H2) funciona como um doador de elétrons para a redução de metilenotetrahidromedromedetina (metileno-H4MPT, Mer) e mehenyl-H4MPT12,13. Também pode ser usado como um porta-elétrons em vias de transporte de elétrons independentes de H2 de methanogênios contendo citocromes12,14. Além disso, a forma oxidada de F420 tem uma fluorescência azul-esverdeada característica após a excitação a 420 nm, o que facilita a detecção de methanogênios microscopicamente (Figura 1). Devido ao seu baixo potencial de redox, f420 facilita (i) a redução exógena de um amplo espectro de compostos orgânicos recalcitrantes ou tóxicos, (ii) síntese de antibióticos tetracítricos e lincosamidas ou fitotoxinas em estreptomices (filo Actinobacteria), e (iii) resistência ao estresse oxidativo ou nitrosativo ou outras condições desfavoráveis em micobactérias (filo Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Consequentemente, os oxidoreductases dependentes de F420 são biocatalysts promissores para fins industriais e farmacêuticos, bem como para a bioremediação de ambientes contaminados1,23. Apesar dessas descobertas recentes, os papéis exatos do cofator F420 ainda são marginalmente conhecidos em Actinobacteria ou outras bactérias.
Há pelo menos três caminhos para a biosíntese F4202,6,24. No início, a via da biossíntese é dividida em uma biosíntese de 5 deazaflavinas e um ramo metabolismo de 2 fosfolactato. A parte reativa da molécula F420 é sintetizada via FO-synthase usando os substratos tyrosine e 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinadiona. O resultado é o nível de riboflavina cromohore FO. Dentro do ramo de metabolismo de lactato atualmente aceito, o L-lactato é fosfoilado a 2-phospho-L-lactato por um L-lactato kinase (CofB); 2-phospho-L-lactato, por sua vez, é guanylated para L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine por 2-phospho-L-lactate guanylyltransferase (CofC). No próximo passo, L-lactil-2-diphospho-5'-guanosine é ligado à FO por um 2-phospho-L-lactato transferase (CofD) para formar F420-02. Finalmente, a enzima F420-0:ɣ-glutamyl liga os monômeros glutamato para F420-0, formando o cofator final6 em números variados23,25. Diferentes organismos apresentam padrões diferentes no número de resíduos de glutamato anexados, com caudas mais curtas encontradas para methanogênios do que em micobactérias2,25,26. Geralmente, os metanogens mostram comprimentos de cauda de dois a três, com até cinco no metanogena actolástico, methanosarcina sp., enquanto os comprimentos da cauda encontrados em Mycobacterium sp. variaram de cinco a sete resíduos de glutamato2,25,26,27. No entanto, descobertas recentes mostraram que a F420 de cadeia longa se liga a oxidoreductases dependentes da F420 com uma afinidade maior do que a F420 de cadeia curta; além disso, o F420 de cadeia longa ligado aumenta a afinidade do substrato, mas diminui a taxa de rotatividade das respectivas enzimas23.
A detecção do cofato F420 é frequentemente baseada em sua fluorescência. Assim, seus derivados de glutamato oligo foram separados por meio de fase inversa (RP)-HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. usaram hidróxido de tetrabutylammonium como um reagente de emparelhamento de íons para a cauda de glutamato carregada negativamente para melhorar a separação em RP-HLPC com sucesso5. Aqui, apresentamos um método para a preparação de amostras, posteriormente, extração, purificação, separação e quantificação do cofato F420 não apenas de culturas puras, mas também de diferentes amostras ambientais (ou seja, solos e lodo digestor).

<table><tbody><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de HPLC biocompatível equipado com módulo de gradiente, forno e detector de fluorescência</td><td>Sistema de HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga e rotor para 50 mL " Falcão" tubos (11.000 rcf) e tubos apropriados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna HPLC: Gemini NX C18, 5 &mu; m, 150 x 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC coluna</td></tr><tr><td>PTFE filtro (tamanho do poro 0,22 &micro; m) remover material particulado antes da análise</td><td></td><td></td><td></td>por HPLC</tr><tr><td>Resina para SPE: Strata-X-AW 33 &mu; m como sorvente polimérico de modo misto de ânion fraco</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>sorvente polimérico de modo misto de ânion fraco</td></tr><tr><td>Coletor de vácuo para SPE e tubos de coleta apropriados Equipamento</td><td></td><td></td><td>SPE</td></tr><tr>Misturador <td></td><td></td><td></td><td>de vórtice</td></tr></tbody></table>

extração do cofactor f420 para análise do comprimento da cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

O cofator F420 desempenha um papel central como portador de hidreto no metabolismo primário e secundário de muitas taxas bacterianas e arqueais. O cofator é mais conhecido por seu papel na methanogênese, onde facilita reações termodinamicamente difíceis. Como a cauda de poliglutamate varia de comprimento entre diferentes organismos, as análises de perfil de comprimento podem ser uma ferramenta poderosa para distinguir e caracterizar diferentes grupos e caminhos em vários habitats. Aqui, o protocolo descreve a extração e otimização da detecção do cofato F420 aplicando extração em fase sólida combinada com análise de cromatografia líquida de alto desempenho independente de abordagens biológicas culturais ou moleculares. O método foi aplicado para obter informações adicionais sobre a expressão do cofator F420 de comunidades microbianas em solos, lodo anaeróbico e culturas puras e foi avaliado por experimentos de espiadura. Assim, o estudo conseguiu gerar diferentes perfis de comprimento da cauda F420 para methanogênios hidroeotróficos e acetoclásticos em culturas puras metogênicas controladas, bem como de amostras ambientais, como lodo digestor anaeróbico e solos.

Culturas puras de termófila de metanosarcina e termofílico de Metanoculleus, ambos termofílicos methanogênicos Archaea, foram cultivadas em mídia adequada, como descrito anteriormente29,30. Para a termófila de metanoosacina, o metanol foi usado como fonte de energia, enquanto o termofílico de Metanoculleus foi cultivado em H2/CO2. O crescimento foi verificado pela avaliação microscópica, enquanto ...

Um método para a extração do cofato F420 de culturas puras foi otimizado para a separação e análise cromatográfica líquida do comprimento da cauda F420 em cultura pura e amostras ambientais.

Extração do Cofactor F420 para Análise do Comprimento da Cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

O cofator F420 desempenha um papel importante no metabolismo primário e secundário de muitos procariotes. Medir essa molécula em amostras ambientais permite uma compreensão mais profunda de sua prevalência e função. Esta técnica permite a análise do cofator em materiais amostrais difíceis, como lodo e solo.Assim, a lise do material e a pré-purificação antes da análise são as etapas centrais. O protocolo inclui diferentes etapas durante a preparação da amostra. Essas etapas devem ser planejadas e preparadas muito bem antes de iniciar o processamento da amostra.Por exemplo, a preparação de tampões frescos é importante. Para começar a lise amostral, coloque cinco gramas da amostra em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de lyse 2X às amostras, e leve o volume a 10 mililitros com água destilada para atingir uma concentração final de 0,5 gramas por mililitro.Vórtice as amostras diluídas por 20 segundos seguidos de autoclaving por 30 minutos a 121 graus Celsius. Para amostras secas como solo florestal, traga para um volume final de 20 mililitros com água destilada após autoclavação, e vórtice a amostra diluída novamente por 20 segundos, como demonstrado. Uma vez que as amostras esfriem, centrifute a amostra lysate por cinco minutos a 11.000 x g, e colete o supernante.Prepare uma extração de cinco mililitros de fase sólida ou coluna SPE preenchida com 100 miligramas de ânion misto de ânion misto sorbent condicionando o trocador de ânion com três mililitros de metanol. Em seguida, equilibre o trocador de ânion com três mililitros de água destilada. Carregue até nove mililitros do supernacido do lysate centrifusado na coluna SPE.Lavar sequencialmente as impurezas da coluna com cinco mililitros de acetato de amônia de 25 mililitros e cinco mililitros de metanol. Após a lavagem, elute o cofactor F420 com um mililitro de tampão de eluição. Predefinir o forno a 40 graus Celsius, e definir o detector de fluorescência para 420 nanômetros de comprimento de onda de extinção e 470 nanômetros de comprimento de onda de emissão.Em seguida, filtre a amostra elucida da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 míclico. Injete 50 microliters da amostra filtrada no sistema HPLC e separe o cofator F420 através do modo gradiente usando uma combinação de fases móveis como descrito no manuscrito. Analise a composição e concentração do cofato F420.O crescimento de culturas puras de methanogênios foi verificado por microscopia. Em microscopia de contraste de fase, aglomerações de antanogênicos são visíveis, que emitem uma luz azulada quando o cofator F420 é animado com luz ultravioleta. A área de pico do cofato recuperado F420 após a SPE com diferentes volumes das culturas termofílicos de Methanoculleus foi analisada.A estratégia de desintegração autoclavante alcançou a área de pico mais alta, concluindo a máxima eficiência de extração usando um tratamento de pressão-temperatura. A análise da distribuição do comprimento da cauda revelou as diferenças na concentração global do cofator F420 e na distribuição do comprimento da cauda F420 das culturas puras de metogenia em amostras ambientais. Ao aplicar este procedimento, esteja ciente de coletar completamente o volume total do buffer de eluição ou registrar o volume exato de fluxo..Esta técnica abre caminho para a exploração do cofato F420 em amostras mais complexas, como solos e lodo e permite insights mais profundos sobre o impacto ecológico desta molécula.

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Aprenda a extrair o cofator F420 para análise do comprimento da cauda poliglutama em culturas puras e amostras ambientais. Este método otimizado utiliza cromatografia líquida para estudar o metabolismo de procariotos.

Extração do Cofactor _F420 para Análise do Comprimento da Cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais

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