In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios
November 20th, 2021
Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.
O objetivo deste procedimento é avaliar a organização e dinâmica do microtúbulo in vivo. Os neurônios são células polarizadas com compartimentos axonanos, dendráticos e sinápticos distintos, mantidos por seu citoesqueleto subjacente. Microtúbulos formam a maioria do citoesqueleto neuronal, e a dinâmica e orientação determinam eventos-chave durante o desenvolvimento neuronal e a maturação.
Os microtúbulos são compostos por heterodimers alfa e beta tubulin, e são inerentemente polarizados com plus-ends altamente dinâmicos e pontas-negativos estáveis. Durante a polimerização nos plus-ends, um complexo multi-molecular de proteínas de ligação final, associam-se transitoriamente com os perfis e promovem a montagem de dimers de tubulina. Essa técnica nos ajudará a visualizar microtúbulos neurais in vivo.
Usando essa técnica, pode-se determinar a orientação e outros parâmetros de microtúbulos dinâmicos durante o desenvolvimento e regeneração do neurônio C.elegans. Normalmente usamos este repórter para visualizar a dinâmica dos microtúbulos no neurônio sensorial. No entanto, pode-se expressar este repórter em outros tipos de células, como músculos e pele para visualizar microtúbulos dinâmicos nessas células.
Proteínas de ligação final fluorescentes como EBP para GFP aqui, aparecem como cometas. A dinâmica desses cometas tem sido correlacionada com o crescimento concomitante dos microtúbulos, e um indicador-chave para medir a dinâmica e orientação dos microtúbulos. A fim de observar esses cometas em um tipo celular específico, transgene com DNA de EBP-2 e GFP são expressos sob um promotor específico.
Para a expressão nos neurônios PLM, este transgene é expresso sob a responsabilidade de promotor. Esses vermes transgênicos podem ser vistos sob um microscópio estéreo, com fluorescência configurada antes de classificar ou montar. Para a montagem dos worms para imagens de cometas EBP, fazemos um Buffer 10% Argos em M9 buffer.
e coloque uma gota em um escorregador de vidro. Outro slide é usado para pressionar a queda em um filme que se solidifica em um bloco. Usamos 0,1 mínccro, contas de poliestireno como meio de montagem, alguns vermes são colhidos e reinsuidos na solução de contas.
Um deslizamento de cobertura é caçado para imobilizar os vermes e levado para a imagem. Os montados podem ser filmados em qualquer microscópio de fluorescência com uma câmera para imagens de alta resolução. A configuração é equipada com uma unidade de disco giratório para uma aquisição mais rápida e branqueamento de fotos reduzido e toxicidade fotográfica.
O slide é mantido no palco e o campo de vermes é focado e centrado usando a iluminação de campo brilhante. Um objetivo de baixa ampliação como 5X ou 10X pode ser usado para este fim. Os worms podem ser re-focados em um objetivo de alta ampliação como 63X usando a mesma iluminação.
Este objetivo fornece uma resolução espacial ideal para a imagem dos cometas. Um centro fixo do neurônio PLM é feito sob a iluminação da fluorescência para evitar exposição indevida à luz e branqueamento fotográfico do prum. Para a aquisição de imagens usamos enviar software fora de sites.
Usando a configuração de imagem ao vivo no canal brightfield, focamos a região da cauda do worm e centralizamos-na no campo de visão. Isso é seguido pelo foco do neurônio PNM usando configuração de imagem de luz com luz de excitação de 488 nanômetros. Para uma aquisição de lapso de tempo, uma configuração experimental é criada onde o tempo de exposição, a duração do lapso de tempo e o intervalo entre os quadros definem as habilidades temporais da imagem.
Para medições quantitativas alguns filmes de cometas EBP devem ser analisados na Imagem J, que é um software de código aberto. O lapso de tempo adquirido abre como uma vertente de várias imagens, que pode ser visualizada como um filme. Neste lapso de tempo em particular, os cometas podem ser vistos no corpo celular, processo anterior e posterior do neurônio PLM.
Os cometas que se afastam do corpo celular são classificados como plus-end-out, e aqueles que se movem em direção ao corpo celular são classificados como menos-end-out. Para iniciar a análise é traçada uma linha segmentada sobre a região de interesse, que neste caso é o processo interno do neurônio PLM. Este segmento de linha é convertido em um kymograph usando a função de reslice de imagens.
Um kymograph é uma imagem de tempo de distância com vincos diagonais representando os cometas em movimento. Segmentos em linha reta podem ser desenhados nesses traços e parâmetros de medição podem ser definidos usando o menu analisar. Esses parâmetros podem ser convertidos em quantidades e unidades mensuráveis padrão no programa de análise de dados como o Excel.
A largura do traço corresponde ao comprimento do crescimento. O hight representa a duração do crescimento, e o ângulo da linha dá a direção dos cometas. Esses cometas ainda podem ser classificados em plus-end-out e menos-end-out, para encontrar a orientação relativa dos microtúbulos.
A expressão transgênica do GFP EBTA pode ser adaptada para observar a dinâmica dos microtúbulos em vários contextos celulares, como a nova regeneração. Para observar a dinâmica dos microtúbulos nos axônios de classificação da região, o axônio é ferido usando um laser femtosegundo, que pode cortar o axônio precisamente sem causar danos colaterais maciços. Após a lesão, os vermes podem ser recuperados em placas de motor semeadas para observações posteriores.
Os neurônios PLM apresentam regeneração robusta de exoneree, que pode ser observada até seis horas após a lesão. Para evitar que a fototoxicidade regenere novos direitos, a imagem ao vivo é realizada em um microscópio de disco giratório. As aquisições de lapso de tempo dos axônios regeneradores podem mais tarde ser convertidas em kymographs para a análise de cometas.
A duração e direção da distância dos cometas podem então ser interpretadas em termos de orientação e dinâmica de microtúbulos. Minha orientação crítica e dinâmica são determinantes fundamentais de processos celulares civis como divisão celular, migração e manutenção da arquitetura celular. Embora existam muitas ferramentas disponíveis para a medição da dinâmica microtúbula na medição in vivo pode ser desafiadora.
Autoflorescência, toxicidade fotográfica, artefato de expressão e intensidades variáveis relatadas são algumas das dificuldades encontradas durante a observação ao vivo de proteínas de ligação final, para avaliar a dinâmica dos microtúbulos. Utilizando um transgênico integrado com baixa concentração de DNA deportado e baixa iluminação, este estudo abordou métodos para mitigar alguns desses desafios. Os módulos de imagem e análise descritos aqui podem ser estendidos para outros repórteres baseados em microtúbulos e transporte de proteínas.
Isso não é apenas aplicável aos neurônios c.elegância, mas pode ser aplicado a outros tipos de células e sistemas de modelos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para a imagem in vivo de microtúbulos dinâmicos usando a proteína de ligação à extremidade EBP marcada com fluorescência no neurônio do microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans. O protocolo visa visualizar a dinâmica dos microtúbulos, permitindo que os pesquisadores avaliem a orientação e o comportamento dessas estruturas do citoesqueleto durante o desenvolvimento e regeneração neuronal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Dinâmica do Citoesqueleto
- Imagem por Fluorescência
Fundo
- Os microtúbulos são integrais para a estrutura e função neuronal, influenciando o desenvolvimento e a maturação.
- Eles são compostos por tubulina alfa e beta e exibem comportamento dinâmico crítico para os processos neuronais.
- As proteínas de ligação à extremidade desempenham um papel crucial na promoção da montagem e dinâmica dos microtúbulos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para visualizar a dinâmica dos microtúbulos in vivo.
- Analisar o comportamento dos microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração neuronal em C. elegans.
- Adaptar a técnica para uso em vários tipos de células além dos neurônios.
Métodos Utilizados
- Foi empregada microscopia de fluorescência com uma unidade de disco rotativo para a obtenção de imagens.
- C. elegans serviu como o modelo biológico, focando nos neurônios PLM.
- A expressão transgênica de EBP-2 fundida com GFP foi utilizada para marcação.
- Os vermes foram montados usando esferas de poliestireno e observados sob um microscópio de fluorescência.
- A imagem em time-lapse e a análise foram realizadas usando ImageJ para medições quantitativas da dinâmica dos microtúbulos.
Principais Resultados
- Os cometas observados representam microtúbulos dinâmicos, com movimento classificado como plus-end-out ou minus-end-out.
- O método permitiu a avaliação da direção de crescimento, duração e dinâmica dos microtúbulos, especialmente após lesão axonal.
- As observações indicaram regeneração robusta de axônios com padrões claros de orientação dos microtúbulos.
Conclusões
- Este estudo facilita a visualização e análise da dinâmica dos microtúbulos em neurônios, avançando a compreensão do comportamento neuronal durante o desenvolvimento e respostas a lesões.
- Os resultados têm implicações para a exploração de mecanismos neuronais e plasticidade em vários contextos biológicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding microtubule dynamics in neurons provides critical insights into axonal integrity and regeneration, which are central to neurodegenerative disease mechanisms and neuroprotective target validation. This in vivo assay enables quantitative assessment of cytoskeletal behavior, supporting early-stage hypothesis testing in neuronal health and repair pathways. The approach offers a scalable, genetically tractable system for de-risking targets involved in cytoskeletal regulation and neuronal resilience.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule orientation and dynamics as functional readouts for target engagement in neuronal models.
- Operational Value: Provides a quantitative, imaging-based assay to assess compound effects on axonal microtubule behavior in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative readouts of microtubule growth direction and dynamics via comet analysis in kymographs.
- Operational Value: Establishes a standardized, adaptable platform for live imaging that can be applied across genetic backgrounds and neuronal subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking microtubule dynamics to axonal regeneration outcomes following injury.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of repair processes, enabling predictive modeling of neurotherapeutic efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional cytoskeletal readouts that inform target validation and lead optimization in neuroscience programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microtubule-regulating targets through direct visualization of plus-end dynamics in axons.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantifiable outputs (comet trajectory, orientation) for compound screening in neuronal models.
- Analytics: Generates measurable parameters (growth velocity, duration, direction) from kymograph analysis to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects dynamic microtubule behavior to regenerative capacity, supporting continuity from hit identification to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: The transgenic reporter system can be redeployed across cell types and disease models, enhancing platform sustainability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking molecular perturbations to functional cytoskeletal outcomes in neurons.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging protocols with minimal variability through controlled mounting and low-phototoxicity acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based biomarkers of axonal health and regenerative potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in cytoskeletal stability and neuronal repair mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic C. elegans handling, fluorescence microscopy, and kymograph-based image analysis.
- Dependent on spinning disk confocal or equivalent high-speed, low-phototoxicity imaging systems for longitudinal studies.
- Necessitates standardization of promoter-driven expression and mounting protocols across labs for reproducible comet detection.
- Adaptation to other cell types requires validation of promoter specificity and microtubule reporter compatibility.
- Practical limitations include potential overexpression artifacts and photobleaching, mitigated by low-expression transgenes and controlled illumination.
