Shuttle Box Assay como uma ferramenta de aprendizagem associativa para avaliação cognitiva em estudos de aprendizagem e memória usando zebrafish adulto
12 de julho de 2021
A aprendizagem e a memória são métricas potentes no estudo de prejuízos cognitivos induzidos pelo desenvolvimento, dependentes de doenças ou ambientalmente. A maioria das avaliações cognitivas requer equipamentos especializados e compromissos de tempo extensos. No entanto, o ensaio da caixa de transporte é uma ferramenta de aprendizagem associativa que utiliza uma caixa de gel convencional para avaliação rápida e confiável da cognição de zebrafish adulto.
O Ensaio de Asação da Caixa de Transporte rastreia reproduivelmente a progressão e recuperação do comprometimento cognitivo após um trauma por força bruta ou qualquer outro tipo de lesão cerebral em zebrafish. O ensaio shuttle box permite uma medição relativamente simples, rápida e robusta do aprendizado associativo em memória de curto e longo prazo em zebrafish. Para começar, prepare a Caixa de Transporte modificando uma caixa de gel de 30,5 por 19 por 7,5 centímetros com uma peça de 5 por 19 centímetros de plexiglass de grau de aquário adicionada a cada lado em um ângulo de 45 graus.
Em seguida, faça uma linha marcando o meio do tanque para avaliar quando os peixes cruzaram o meio do tanque. Depois de adicionar 800 mililitros de água do sistema à Caixa de Transporte, coloque dois a três peixes em um tanque de retenção contendo água do sistema. Deixe o tanque na sala escura onde o ensaio da caixa de transporte será realizado.
Em seguida, na sala escura, coloque um peixe no centro da Caixa de Transporte. Fixar a tampa e fixar os eletrodos a uma fonte de alimentação. Os peixes devem ser aclimatados no escuro.
Desligue todas as luzes e aclimata o peixe na Caixa de Transporte por 15 minutos. A aclimatação bem sucedida pode ser considerada quando o peixe explora livremente o tanque. Após a aclimatação bem sucedida do peixe, brilhe manualmente uma lanterna de lente vermelha de 800 lúmens aproximadamente dois centímetros da parede da caixa de gel ao lado ocupada pelo peixe.
Não inicie um teste se o peixe estiver descansando ao lado do fio de platina. Brilhe o estímulo leve diretamente sobre o peixe e siga manualmente qualquer movimento lateral do peixe com a luz para garantir a visualização contínua do estímulo. Continue fornecendo o estímulo leve até que qualquer uma das seguintes condições para um teste bem sucedido ou fracassado seja atendida.
Considere o teste bem sucedido se o peixe atravessar a metade do tanque dentro de 15 segundos de exposição à luz. Uma vez que o peixe cruze a metade do caminho, pare o estímulo leve imediatamente. Se o ensaio falhar, use uma fonte de alimentação eletroforese para aplicar um estímulo de choque negativo de 20 milivolts a um ampere, alternando dois segundos, dois segundos fora por 15 segundos com um máximo de quatro choques ou até que o peixe passe a metade da caixa.
Em seguida, termine tanto o estímulo leve quanto negativo. Antes do período de treinamento, garanta uma aclimatação bem sucedida à Caixa de Transporte deixando o peixe em condições escuras por 15 minutos. Em seguida, brilhe manualmente uma lanterna de lente vermelha de 800 lúmen aproximadamente dois centímetros da parede da caixa de gel ao lado ocupada pelo peixe.
Brilhe o estímulo leve diretamente sobre o peixe e siga qualquer movimento lateral do peixe com a luz para garantir a visualização contínua do estímulo. Enquanto a luz está brilhando sobre o peixe, aplique simultaneamente o estímulo de choque adverso de 20 milívolos a um ampere, alternando dois segundos em diante, dois segundos fora por 15 segundos com um máximo de quatro choques ou até que o peixe passe no meio da caixa. Uma vez que isso seja alcançado, termine a luz e o estímulo adverso.
Repita para 25 iterações. Após a conclusão, permita ao peixe outro período de aclimatação de 15 minutos em condições escuras. Durante o período inicial de testes, realize uma aclimatação bem sucedida na Caixa de Transporte por 15 minutos, em seguida, aplique apenas o estímulo leve por até 15 segundos e registre as respostas.
Considere o teste bem sucedido se o peixe atravessar a metade da Caixa de Transporte dentro de 15 segundos após iniciar o estímulo de luz e parar o estímulo leve imediatamente quando o peixe cruza a metade do caminho. Considere o ensaio como falho se o peixe não cruzar a metade da Caixa de Transporte 15 segundos depois de iniciar o estímulo de luz e parar o estímulo de luz após 15 segundos. Durante os testes iniciais, não aplique um estímulo adverso após uma tentativa fracassada.
Realize testes de memória de curto prazo imediatamente após o período inicial de testes. Induzir lesão cerebral dramática e esperar por um período de quatro horas antes do teste. Em seguida, aclimatar o peixe na Caixa de Transporte por 15 minutos.
Avalie a memória de curto prazo aplicando apenas o estímulo de luz por até 15 segundos e regise se o peixe cruza a metade da caixa antes que a luz seja desligada, considerada como prova passada, ou não cruze a metade dentro dos 15 segundos considerados como teste falho. Repita o passo acima 25 vezes com um período de descanso de 30 segundos entre cada teste e regise o número de testes bem-sucedidos e fracassados. Realize testes de memória de longo prazo quatro dias após os testes iniciais.
Induzir lesão cerebral traumática e esperar por um período de quatro horas antes do teste, em seguida, aclimatar o peixe na Caixa de Transporte por 15 minutos. Avalie a memória de longo prazo aplicando apenas o estímulo de luz por até 15 segundos e regise se o peixe cruza a metade da caixa antes que a luz seja desligada, considerada como prova passada, ou não cruze a metade dentro dos 15 segundos considerados como teste falho. Repita as 25 vezes acima com um período de descanso de 30 segundos entre cada teste e regise o número de testes bem-sucedidos e fracassados.
A visão geral instrutiva dos paradigmas de aprendizagem e memória para avaliação cognitiva é mostrada aqui. O peixe não danificado aos oito meses, adulto jovem, 18 meses, adulto de meia-idade e 24 meses, idoso, exigiu um número semelhante de ensaios para aprender o comportamento de evitar a luz vermelha. Depois de utilizar o modelo de lesão cerebral traumática de força bruta grave, ou STBI, o peixe em diferentes idades exigiu um número semelhante de ensaios para dominar o ensaio em um a cinco dias após a lesão.
No primeiro dia seguinte ao STBI, peixes de todas as idades exigiram um número semelhante de ensaios para aprender o comportamento, que foi significativamente maior do que os controles não danificados. O peixe não danificado rapidamente dominou a Shuttle Box, alcançando cinco testes positivos consecutivos em aproximadamente 17 ensaios, enquanto um dia após uma lesão cerebral leve, ou um TBI leve, os peixes apresentam um aumento significativo no número de ensaios para aprender o comportamento. Esse déficit aumentou após dois TCE leves e foi ainda mais elevado após três leves lesões de TCE.
Peixes intactos apresentam um ligeiro aumento na diferença percentual de ensaios bem sucedidos na memória imediata e memória atrasada em relação ao período inicial de testes. Após um único TBI leve, os peixes apresentaram déficits significativos e imediatos de memória em comparação com peixes não danificados. Essa tendência continuou com repetidas lesões com déficits crescentes após dois TBI leves e três TBI leves.
O tempo de estímulos adversos aplicados é crítico. Emparelhar os estímulos adversos com a luz e sua remoção simultânea solidifica sua associação e é crucial para o paradigma. O ensaio permite uma avaliação rápida ou aprendizado associativo complexo que possa ser usado para investigar impactos do desenvolvimento, do envelhecimento e do meio ambiente no comprometimento cognitivo.
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Visão Geral
O teste da caixa de transferência é uma ferramenta de avaliação cognitiva utilizada para medir a aprendizagem associativa em peixes-zebra adultos, particularmente no contexto de comprometimentos cognitivos devido a traumas. Este método permite a avaliação rápida da memória de curto e longo prazo após lesões cerebrais, facilitando o estudo da dinâmica de aprendizagem e memória em uma configuração simples.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Cognição
Antecedentes
- O ensaio com caixa de transporte é uma ferramenta inovadora que aprimora a avaliação cognitiva em peixes-zebra.
- Ele simplifica o processo de avaliação em comparação com métodos tradicionais que exigem equipamentos especializados.
- Este modelo é particularmente útil para estudar os efeitos cognitivos de trauma contuso e outras lesões neurais.
- O ensaio investiga tanto as capacidades de aprendizado quanto a dinâmica de recuperação após lesão.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para acompanhar a recuperação cognitiva em peixes-zebra após lesões cerebrais.
- Examinar como a idade e a lesão afetam a aprendizagem e a memória, conforme avaliado pelo ensaio da Caixa de Transferência.
- Fornecer insights sobre os mecanismos de aprendizagem associativa em resposta a estímulos.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal utilizada é uma caixa de gel modificada projetada para avaliações do comportamento de peixes-zebra.
- O modelo biológico principal consiste em peixes-zebra adultos submetidos a avaliações e desafios cognitivos após trauma cerebral.
- O método inclui períodos sistemáticos de aclimatação, estímulos luminosos e choques elétricos leves para avaliar a memória.
- O teste envolve ensaios sequenciais que avaliam as capacidades de memória de curto e longo prazo em diferentes intervalos após a lesão.
- O treinamento é repetido por múltiplas iterações para estabelecer uma medida consistente da eficácia da aprendizagem.
Resultados Principais
- O teste do Shuttle Box demonstrou uma relação significativa entre a gravidade da lesão cerebral e o número de tentativas necessárias para que os peixes-zebra aprendessem comportamentos de esquiva.
- Peixes-zebra sem lesão dominaram rapidamente o comportamento de esquiva, enquanto aqueles com lesões precisaram de mais tentativas.
- As respostas foram observadas em diferentes grupos etários, indicando padrões de aprendizado consistentes independentemente da idade após a lesão.
- Avaliações de memória de longo e curto prazo revelaram perfis distintos de recuperação com base no momento da avaliação cognitiva após a lesão.
Conclusões
- Este estudo valida o ensaio do Shuttle Box como uma ferramenta valiosa para investigar o comprometimento cognitivo e a recuperação.
- Os conhecimentos obtidos contribuem para uma melhor compreensão dos processos de aprendizagem associativa em peixes-zebra, com implicações para pesquisas sobre lesões cerebrais.
- Os resultados destacam o potencial do peixe-zebra como um modelo eficaz para estudar os mecanismos de recuperação neurocognitiva.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio do Shuttle Box fornece um método rápido e reprodutível para avaliar a aprendizagem associativa e a memória em peixes-zebra, permitindo a detecção precoce de déficits cognitivos após lesão cerebral traumática. Sua simplicidade e requisitos mínimos de equipamentos permitem triagens em larga escala na neurociência de descoberta, facilitando a validação de alvos para compostos neuroprotetores ou neurorestauradores. A capacidade do ensaio de acompanhar a progressão cognitiva e a recuperação em diferentes faixas etárias aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos de doenças neurodegenerativas e TBI.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de déficits de aprendizagem e memória após lesão cerebral, apoiando a identificação de alvos e a elucidação de vias.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da medição reprodutível do comprometimento cognitivo e da recuperação em um modelo vertebrado.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que revertam os déficits de aprendizagem, melhorando as decisões de avançar ou interromper projetos no estágio inicial de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para testes subsequentes de compostos, estabelecendo o desempenho cognitivo basal e os déficits induzidos por lesão.
- Valor Operacional: Fornece leituras padronizadas e quantitativas (ensaios até o critério) que aumentam a reprodutibilidade do ensaio e a consistência entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Permite prontidão para alto rendimento por meio de ciclos curtos de treinamento e manipulação mínima, apoiando testes repetidos em diferentes grupos de tratamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar déficits cognitivos em peixes-zebra adultos após lesão cerebral traumática, refletindo fenótipos clínicos.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, acompanhando a recuperação da memória imediata e tardia ao longo de dias.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta a tomada de decisões ao dissociar os efeitos sobre a memória imediata e a memória tardia, direcionando estratégias de intervenção específicas para o mecanismo envolvido.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio Shuttle Box insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes, fornecendo uma desvinculação mecanicista para desfechos cognitivos em programas de doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição da aprendizagem associativa como indicador funcional da integridade do circuito neural após lesão.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de aclimatação padronizada, associação de estímulos e pontuação baseada em tentativas, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (tentativas bem-sucedidas dentro de 15 segundos) que permitem comparação estatística da eficácia da aprendizagem entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao avaliar tanto a memória de curto prazo (4 horas) quanto a de longo prazo (4 dias), refletindo a dinâmica temporal da recuperação cognitiva.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para testes iterativos entre genótipos, idades e regimes de tratamento, reduzindo o desenvolvimento redundante de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de aprendizado e memória.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros fixos de estímulo (intensidade da luz, duração do choque, limites de tentativas) e critérios de pontuação cegos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de deficiências cognitivas, reduzindo o risco de falha em estágios avançados do desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que revertam déficits de aprendizado sem afetar a memória tardia, indicando seletividade de mecanismo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de peixes-zebra, neurociência comportamental e eletrofisiologia básica para a aplicação do estímulo.
- Depende do acesso a um ambiente escuro, fonte de alimentação para eletroforese e modificação padronizada da câmara de gel com divisórias de plexiglass.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de aclimatação, do tempo de estímulo e das definições de ensaio para garantir a comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a modelos larvais ou espécies alternativas, devido a diferenças de tamanho, tolerância ao choque e acuidade visual.
- Limitado pela sensibilidade do ensaio aos estados de estresse e motivação, os quais podem influenciar o desempenho independentemente da função cognitiva, conforme observado nos requisitos de aclimatação do protocolo.
