Desenvolvimento de uma tira imunocromatográfica de fluxo lateral para detecção rápida e quantitativa de compostos de pequenas moléculas

O procedimento descreve a preparação do ouro coloidal e a montagem das tiras imunocromatográficas. Em primeiro lugar, o ácido cloroauúrico e citrato de sódio foram usados para a síntese de ouro coloidal. O citrato de sódio foi adicionado à solução de ácido cloroaurico e fervido para obter ouro coloidal com tamanho de partícula adequado.

Síntese, o anticorpo de ouro coloidal conjugado. Após a centrifugação, partículas de ouro coloidais foram dissolvidas em solução apropriada e, em seguida, resuspended para obter solução de ouro coloidal. Submergir a membrana de fibra de vidro na conjugação para preparar a almofada conjugada.

Solte antígeno artificial e anticorpos secundários na membrana NC como linha T e linha C. Conecte a membrana NC, a membrana absorvente, a amostragem e a membrana de fibra de vidro na placa de PVC, respectivamente. Corte a placa de papel montada em uma tira de 3,5 milímetros de largura.

Confect full percent gold cloreto solução e 1% solução de citrato de sódio, respectivamente. Ligue o agitador magnético e coloque o frasco em uma batedeira. Adicione 120 mililitros destilados água em um frasco de fundo redondo e aqueça-a para ferver em um agitador magnético termostático.

Mantenha a ebulição e adicione rapidamente 0,5 mililitros de ácido cloroaurico completo e cinco mililitros de 1% de citrato de sódio. Continue aquecendo por 5 a 10 minutos. Observe a cor da solução mudando de amarelo pálido para tinto vinho.

Desligue a potência da batedeira magnética termostática, esfrie até a temperatura ambiente e coloque a mistura em uma garrafa limpa. Armazene a quatro centígradas. As nanopartículas de ouro mostram o efeito Tyndall.

O tamanho e a morfologia das nanopartículas de ouro foram determinados pela espectroscopia ultravioleta e pela imagem do microscópio eletrônico de transmissão. Adicione 100 microliters solução de cloreto de sódio a oito tubos. Ajuste as soluções de ouro coloidal para pH 5 a 12 usando 0,1 mol por litro de carbonato de potássio.

Adicione 100 microliters de solução de ouro coloidal a oito tubos contendo cloreto de sódio. Fique para o poste vários minutos após a mistura. Observe a mudança de cor de cada solução de tubo e regise o tubo que permanece vermelho.

Escolha o valor do pH com a menor quantidade de carbonato de potássio adicionado e uma cor de solução estável como o valor ideal de pH para preparar conjugado. Adaptou a mesma abordagem. Observei a mudança de cor e grave o tubo que permanece vermelho.

Escolha a quantidade de anticorpos com a menor concentração de mAB e uma cor de solução estável como a quantidade mAB ideal. Pegue 10 mililitros de solução de ouro coloidal e use 0,1 mol por litro de carbonato de potássio para ajustar a solução ao valor ideal de pH. Adicione lentamente os SSd mABs com a concentração apropriada e agite à temperatura ambiente por 30 minutos.

Centrifugar a mistura a 2000 RPM por 20 minutos a quatro centígradas. Remova o precipitado contendo impurezas do ouro coloidal precipitado. Centrifugar a mistura a 10.000 RPM por 40 minutos.

Descarte o supernatante. O precipitado é conjugado de ouro coloidal mAB. Adicione ácido clorídrico Tris, BSA, Tween 20 e PEG 20.000, em seguida, misture bem para preparar o tampão de resuspensão.

Adicione o tampão de resuspensão e dissociar o precipitado. A tira do material da membrana, incluindo membrana de celulose de vidro, membrana de celulose de poliéster e placa de PVC. O material da membrana, precisa rastrear e avaliar por microscópio estéril para se livrar da inhomogeneidade.

Primeiro, coloque a membrana NC na placa de PVC a dois centímetros da borda da extremidade da seção da placa. Em segundo lugar, solte dois miligramas por mililitro SSd-BSA na membrana NC a dois centímetros da borda superior como linha de teste e solte 1,5 miligramas por IgG anti-rato de ouro mililitro na membrana NC a dois centímetros da borda inferior como linha de controle. Conecte a almofada absorvente à folha de PVC acima da membrana NC e sobreponha-se à membrana NC por dois milímetros.

Corte a membrana de fibra de vidro para cinco centímetros de comprimento e dois centímetros de largura e use como uma almofada conjugada. Submergir a membrana de fibra de vidro na solução conjugada de nanopartículas de ouro mAB. Mergulhe por um tempo para fazer as nanopartículas de ouro mAB absorção.

Seque a membrana larga na incubadora a 37 graus. Cole a almofada conjugada pré-tratada sob a membrana NC e o comprimento sobreposto com a membrana NC deve ser de 0,1 centímetros. Corte a membrana Fusion3 em 1,8 centímetros de comprimento e 3,5 centímetros de largura e use como almofada de amostra.

Em seguida, coloque a almofada de amostra na placa de PVC e sobreponha-se com a almofada conjugada por dois milímetros. Corte, monte a placa de papel em tiras de largura de 3,5 milímetros usando uma máquina de corte e compacta usando um sistema de laminação em lote. Finalmente, coloque as tiras de teste na concha.

Sele-os em um saco de papel alumínio contendo dessecante e a loja longe da luz. O ICS está agora montado. Solte 50 microliters de solução amostral no orifício da amostra para observar o processo de cromatografia.

Em seguida, analise as tiras usando um leitor de tiras portátil. A máquina pode fornecer a razão da linha de teste para a linha de controle. Avalie a especificidade, sensibilidade, repetibilidade e estabilidade do teste ics.

As soluções de ouro coloidal preparadas foram lidas. Análises de microscópio eletrônico de transmissão revelaram que as partículas tinham forma poliédrica e foram uniformemente distribuídas com um diâmetro médio de 14 nanômetros. Imagens de microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução mostraram um padrão de franja contínua com um espaçamento de 0,117 nanômetros de nanopartículas de ouro.

A absorção visível ultravioleta indicou que diferentes tamanhos de partículas de ouro coloidal podem ser obtidos alterando a proporção de sódio citrato e ácido cloroaurico. No experimento quantitativo, as tiras com os resultados dos testes de saikosaponin D foram digitalizadas usando um leitor portátil de ICS. Calculamos uma curva padrão relacionando não-concentrações de saikosaponina D à absorção correspondente em cada concentração.

Após investigação metodológica, o método pode ser aplicado para detecção quantitativa e semi-qualitativa de compostos de pequenas moléculas. Este procedimento inclui a preparação de ouro coloidal, síntese de nanopartículas de ouro mAB conjugado, montagem da tira e investigação metodológica. Este trabalho fornece um protocolo detalhado para o desenvolvimento de tira imunocromatográfica para uso na detecção rápida e quantitativa de pequenas moléculas.

Depois de assistir a este vídeo espero que você tenha um bom entendimento para a preparação da tira imunocromatográfica. Obrigado por assistir e boa sorte para suas experiências.