Name: Modificação química do resíduo de triptofano em um recombinante Ca2+-ATPase N-domínio para estudar triptofano-ANS FRET (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a modificar quimicamente resíduos de triptofano em domínios de ligação de nucleotídeos recombinantes para estudar transferência de energia FRET entre triptofano e ANS em proteínas.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo número de subvenção da FAI-UASLP C19-FAI-05-89.89 e pelo número de subvenção da CONACYT 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Usoún Común y Capacitación Técnica 2021). Os autores agradecem a assistência técnica de Julian E. Mata-Morales na edição de vídeo.

1. Determinação (em silico)da interação de domínio N da ANS e SERCA
<ol><li>Gerar uma estrutura tridimensional (3D) da proteína (domínio N SERCA) por modelagem molecular utilizando o software de modelagem proteica preferencial50.</li>
	<li>Identificar os resíduos de aminoácidos que formam o local de ligação nucleotídeo utilizando o software de estrutura molecular preferencial51, e determinar a presença dos resíduos de Arg e Lys35; estes são necessários para a vinculação ans e para aumentar a intensidade de fluorescência (rendimento quântico).</li>
	<li>Realizar acoplamento molecular (utilizando o software de acoplamento preferido)52,53,54 para determinar as interações de ATP, isothiocianato fluoresceína (FITC) (que forma uma ligação covalente com Lys515 rotulando o local de ligação nucleotídea) e ANS com resíduos de aminoácidos no local de ligação nucleotídea(Figura 1).</li>
	<li>Calcule a distância molecular (Å) entre o resíduo Trp e o ANS vinculado utilizando a ferramenta de medição no software preferido.</li>
	<li>Realize a simulação de dinâmica molecular do complexo de domínio ANS-N para determinar a estabilidade da interação52,54. Em seguida, realize os experimentos in vitro quando a estabilidade do complexo for confirmada.</li>
</ol>2. Expressão e purificação do recombinante domínio N
<ol><li>Sintetizar a codificação genética para n-domínio40.</li>
	<li>Projete e construa o plasmídeo que contém o gene sintético que codifica para o domínio N40.</li>
	<li>Expresso e purificado por cromatografia de afinidade (Ni-NTA), o recombinante de domínio N projetado. Realize uma SDS-PAGE da proteína purificada para determinar a pureza (Figura 2)40.</li>
	<li>Determine a concentração proteica estudando a absorvância a λ de 280 nm com o coeficiente de extinção do domínio N (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.</li>
</ol>3. Monitore a formação do complexo de domínio ANS-N com base nas alterações de intensidade de fluorescência de domínio ANS e N.
<ol><li>Prepare uma solução de estoque ANS em N,N-dimetilformamida.<ol>
<li>Pesar uma pequena quantidade (1-5 mg) de ANS, e dissolvê-la em 1 mL do volume final de N,N-dimetilformamida, por exemplo, 3,2 mgs (concentração final de 10,69 mM).</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque aquosa de 100 μM ANS utilizando a solução ANS em N,N-dimethylformamida, por exemplo, adicione 9,4 μL da solução ANS de 10,69 mM para 990,6 μL de tampão fosfato de 50 mM com pH 8,0 para obter um volume final de 1 mL.</li>
		<li>Misture as soluções com vórtice 3 a 5 vezes por 15 s. NOTA: No experimento a seguir, utilize apenas a solução de estoque aquoso ANS. Prepare-se recentemente a solução de estoque aquoso da ANS antes de iniciar os experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a solução de estoque NBS em N,N-dimetilformamida.<ol>
<li>Pesar uma pequena quantidade (1-5 mg) de NBS, e dissolvê-la em 1 mL de N,N-dimetilformamida, por exemplo, 5,3 mgs em 1 mL (concentração final de 29,78 mM).</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque aquoso de 1 mM NBS utilizando a solução NBS em N,N-dimethylformamida, por exemplo, adicione 3,36 μL da solução NBS de 29,78 mM a 96,64 μL de 50 mM tampão fosfato com pH 8,0 para obter um volume final de 0,1 mL.</li>
		<li>Misture as soluções com vórtice 3 a 5 vezes por 15 s. NOTA: Prepare recentemente a solução de estoque aquoso NBS antes de iniciar os experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Titule o domínio N com ANS e registe o espectro de fluorescência por excitação em λ=295 nm a 25 °C.<ol>
<li>Obtenha a linha de base do espectro de fluorescência.<ol>
<li>Coloque 1 mL de tampão fosfato de 50 mM com pH 8.0 em um cuvette de quartzo de fluorescência de 1 mL.</li>
			<li>Posicione a célula na câmara celular termo-indicada (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação λ para 295 nm.</li>
			<li>Regisso espectro de fluorescência (305 - 550 nm). NOTA: O espectro de fluorescência do tampão fosfato de 50 mM com pH 8.0, que serve como amostra em branco, é subtraído de todos os espectros de fluorescência obtidos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Obtenha o espectro de fluorescência intrínseca do domínio N.<ol>
<li>Coloque 900 μL de tampão de fosfato de 50 mM com pH 8.0 em um cuvette de quartzo de fluorescência.</li>
			<li>Adicione 100 μL de suspensão de domínio N (10 μM) para obter uma concentração final de domínio N de 1 μM em um volume final de 1 mL.</li>
			<li>Homogeneize suavemente usando uma micropipette 20 vezes para garantir a homogeneidade da solução. NOTA: A proteína deve ser recém-purificada para obter espectros de fluorescência intrínseca de alta qualidade, por exemplo, o domínio N recombinante purificado só pode ser usado por uma semana após a purificação.</li>
			<li>Posicione a célula na câmara celular termo-indicada (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação λ para 295 nm.</li>
			<li>Regisso espectro de fluorescência intrínseca de domínio N (305-550 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione ANS e obtenha o espectro de fluorescência por excitação em λ=295 nm.<ol>
<li>Adicione uma alíquota de 2 μL de 100 μM ANS solução de estoque aquoso ao domínio N suspenso (1 μM) para obter uma concentração final ans de 0,2 μM.</li>
			<li>Homogeneize suavemente usando uma micropipette 20 vezes para garantir a homogeneidade da solução.</li>
			<li>Posicione a célula na câmara celular termoestabilidade (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação de λ para 295 nm.</li>
			<li>Regisso espectro de fluorescência (305-550 nm).</li>
			<li>Repita as adições ans e a gravação de espectros de fluorescência acima de 1:1 relação molar ANS:N-domínio.</li>
			<li>Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.</li>
			<li>Plote todos os espectros em um único gráfico.</li>
			<li>Determine se os espectros formam um padrão semelhante ao FRET. Os espectros de fluorescência de domínio ANS-N formam um padrão semelhante ao FRET(Figura 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Titulação de fluorescência intrínseca de domínio N por modificação química Trp com NBS.
<ol><li>Repetir as etapas 3.3.1 e 3.3.2.</li>
	<li>Adicione uma alíquota de 1 μL de 1 mM NBS solução de estoque aquoso ao domínio N suspenso (1 μM) para obter uma concentração final de 1 μM NBS.</li>
	<li>Homogeneize suavemente usando uma micropipette 20 vezes para garantir a homogeneidade da solução.</li>
	<li>Posicione a célula na câmara celular termoestabilidade (25 °C) do espectrofluorômetro e ajuste a excitação de λ para 295 nm.</li>
	<li>Regisso espectro de fluorescência (305-550 nm) (Figura 3B).</li>
	<li>Repita a gravação do espectro de adição de NBS e fluorescência até que seja observada a saciação mínima de fluorescência intrínseca do domínio N40. No domínio N, isso geralmente ocorre em uma razão molar de 5-6 NBS/N-domínio40. NOTA: NBS sacia rapidamente (<5 s) a fluorescência intrínseca do domínio N; observa-se uma diminuição na intensidade da fluorescência. Prossiga imediatamente para o próximo passo, pois a NBS também pode reagir com outros resíduos de aminoácidos47.</li>
	<li>Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.</li>
	<li>Plote todos os espectros em um único gráfico(Figura 3B).</li>
</ol>5. Titular o domínio N modificado pelo NBS com ANS registrando espectros de fluorescência a 25 °C.
<ol><li>Execute a etapa 3.3.3 usando o domínio N modificado NBS que foi gerado na Etapa 4.</li>
	<li>Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.</li>
	<li>Plote todos os espectros em um único gráfico(Figura 3C).</li>
	<li>O espectro de fluorescência gerado(Figura 3C) suporta ou refuta a ocorrência de FRET, ou seja, quando o TRAS ocorre, a fluorescência ans não aumenta e vice-versa.</li>
</ol>6. Evidência de ANS vinculando-se ao domínio N quimicamente modificado por excitação em λ=370 nm.
<ol><li>Execute o Passo 3.3.3 usando o n-domínio N modificado NBS que foi gerado na Etapa 4, mas alterando a excitação λ para 370 nm.</li>
	<li>Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando um software adequado.</li>
	<li>Plote todos os espectros em um único gráfico(Figura 3D).</li>
	<li>Confirme a vinculação ans ao domínio N observando o aumento da intensidade de fluorescência ans. A vinculação ans ao domínio N mostra um aumento de fluorescência quando excitada em λ=370 nm(Figura 3D). Como controle, o espectro de fluorescência de ANS (sozinho) em tampão fosfato de 50 mM com pH 8.0 foi obtido emocionante em λ de 295 e 370 nm(Figura 4, não mostrado em vídeo). NOTA: A relação estequiométrica de NBS:Trp necessária para modificação química depende do grau de enterramento do resíduo de Trp na proteína em estudo46,47,55,56. Portanto, recomenda-se determinar a relação molar NBS:protein/(Trp), de antemão.</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os espectros de fluorescência do complexo de domínio ANS-N exibem um padrão semelhante ao FRET quando excitados em um λ de 295 nm, enquanto a distância molecular (20 Å) entre o resíduo Trp e ANS parece suportar a ocorrência de FRET(Figura 1). A modificação química trp por NBS resulta em um domínio N menos fluorescente (Figura 3B, Spectrum f); portanto, a transferência de energia não é possível. Os espectros de fluorescência ans são semelhantes aos do domínio N n...

A transferência de energia de ressonância föster (FRET) tornou-se uma técnica padrão para determinar a distância entre estruturas moleculares após a ligação ou interação em estudos de estrutura proteica e função1,2,3,4. Em ATPases tipo P, o FRET tem sido utilizado para investigar a estrutura e a função do ânticulum sarco-endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, por exemplo, flutuações estruturais durante o ciclo catalítico foram analisadas em toda a proteína pelo FRET7.
Os doadores de FRET são diversos, e variam de pequenas moléculas fluorescentes (extrínsecas) a proteínas fluorescentes9,10. Os resíduos de triptofano (Trp) (devido à sua fluorescência) são úteis para identificar alterações estruturais nas sequências de aminoácidos proteicos11,12. A intensidade de fluorescência do Trp depende substancialmente da polaridade de seu ambiente circundante13,14. A ligação de ligante geralmente gera rearranjos estruturais em proteínas/enzimas15,16. Se o Trp estiver presente ou localizado próximo ao local de ligação proteica, as flutuações estruturais frequentemente afetam o grau de exposição de Trp à mídia aquosa13,14; assim, a mudança na polaridade resulta na saciedade da intensidade de fluorescência trp13,14. Assim, a propriedade fluorescente do Trp é útil para a realização de estudos de ligação de ligantes para enzimas. Outros fenômenos físicos também podem levar à fluorescência trp saciando17,18,19,20, por exemplo, FRET e mudanças na polaridade média. A transferência de energia do estado animado de Trp para um fluoróforo também tem aplicações potenciais, por exemplo, determinação de afinidade de pequenos ligantes em proteínas21. De fato, o Trp tem sido usado principalmente como doador de fluorescência em estudos de FRET em proteínas22,23,24, por exemplo, em estudos de terbium (Tb3+)FRET, um resíduo de Trp é usado frequentemente como antena para transferência de energia para Tb3+25,26,27. A Trp apresenta várias vantagens sobre outros doadores de FRET devido ao seu caráter constitutivo inerente à estrutura proteica, o que elimina a necessidade de processos preparatórios que possam afetar a função/estrutura da proteína estudada24. Assim, a identificação de decaimentos radiativos (transferência de energia e mudanças na polaridade média que são induzidas por rearranjos estruturais proteicos) é importante para tirar conclusões precisas sobre ligaduras em estudos estruturais proteicos13,14,19,28.
Em estudos estruturais proteicos, um fluoróforo extrínseco, ou seja, 8-anilino-1-naftalina sulfonato (ANS), tem sido usado principalmente em experimentos relacionados a dobra/desdobramento de proteínas28,29. A ANS se liga a proteínas/enzimas no estado nativo, geralmente nos locais de ligação dos substratos31,32,33; um aumento no rendimento quântico da fluorescência ans (ΦF) (ou seja, um aumento na intensidade da fluorescência) é induzido por excitar a proteína em λ=370 nm quando interações adequadas de ANS com Arg e Seus resíduos em bolsões hidrofóbicos ocorrem34,35,36,37. Em diversos estudos, foi relatada a ocorrência de FRET (quando excitante no λ dentro de 280-295 nm) entre resíduos de Trp (doadores) e ANS (aceitador), que se baseia no seguinte: 1) sobreposição do espectro de emissão de fluorescência de Trp e espectro de excitação da ANS, 2) identificação de uma distância adequada entre um ou mais resíduos Trp(s) e ANS para transferência de energia, 3) alto rendimento quântico ans quando ligado em bolsões de proteína, e 4) padrão de FRET característico no espectro de fluorescência da proteína na presença de ANS3,17,27,37,38.
Recentemente, a vinculação de ligantes ao domínio de ligação nucleotídea (n-domínio) em SERCA e outros ATPases do tipo P foram investigadas utilizando n-domínios recombinantes projetados40,41,42,43,44,45,46. A engenharia molecular do domínio N da SERCA tem sido usada para mover o único resíduo de Trp (Trp552Leu) para uma estrutura mais dinâmica (Tyr587Trp) que esteja próxima ao local de ligação de nucleotídeos, onde variações de fluorescência (saciamento) podem ser usadas para monitorar alterações estruturais na ligação34. Os resultados experimentais demonstraram que a ANS se liga (como ATP) ao local de ligação nucleotídea no recombinante purificado SERCA N-domínio34. Curiosamente, a fluorescência ANS aumenta ao vincular-se ao domínio N após a excitação a um λ de 295 nm, enquanto a fluorescência intrínseca do domínio N diminui34, produzindo assim um padrão FRET que sugere a formação de um par Trp-ANS FRET.
O uso de NBS foi proposto para determinar o conteúdo de resíduos de Trp em proteínas47 por ensaio de absorvância de proteínas modificadas. NBS modifica o grupo indol altamente absorvente de Trp para o oxindole menos absorvente47,48. Isso resulta na perda (saciamento) da propriedade fluorescente Trp40. Assim, a modificação química mediada pelo NBS de resíduos de Trp pode ser usada como ensaio para definir o papel do Trp (como doador) quando o FRET é hipótese.
Este protocolo descreve a modificação química do único resíduo de Trp por NBS no recombinante N-domínio da SERCA como modelo proteico. Os resultados experimentais demonstram que a intensidade da fluorescência ans ainda aumenta no n-domínio34 quimicamentemodificado por NBS, que carece de fluorescência intrínseca. Portanto, o ensaio é útil para demonstrar a ausência de TRAS entre o resíduo Trp e o ANS quando vinculado ao n-domínio34,40,49. Assim, este ensaio (modificação química NBS de Trp) é útil para provar a presença do par Trp-ANS FRET em proteínas.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>8-Anilino-1-naftalenossulfônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Fluoróforo</td></tr><tr><td>Bis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>Chemical modificação</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>Preparação da solução de estoque</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Etiqueta de fluorescência química</td></tr><tr><td>Cubeta de fluorescência</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>Ensaio de fluorescência</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro de fluorescência</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>Ensaio</td></tr> <tr>de fluorescência<td>Sua armadilha e comércio; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>Purificação de proteínas</td></tr><tr><td>IPTG, sem dioxano</td><td>American Bionalytical</td><td>AB00841-00010</td><td>Expressão de proteínas</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>Purificação de proteínas</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td>Fluorescência ensaio</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>Ensaio de fluorescência</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Ensaio de fluorescência</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Ensaio de fluorescência</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>Ensaio de fluorescência</td></tr><tr><td>Precision plus std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>Preparação de</td></tr><tr><td>tampão Fosfato de sódio monobásico</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>Preparação de tampão</td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0,2 um</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td>Filtração de solução</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>PÁGINA SDS</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

modificação química do resíduo de triptofano em um recombinante ca2+-atpase n-domínio para estudar triptofano-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

O reticulum sarco/endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA) é um ATPase do tipo P que foi cristalizado em várias conformações. Informações funcionais detalhadas podem, no entanto, ser obtidas a partir de domínios recombinantes isolados. O domínio recombinante de ligação de nucleotídeo (domínio N) recombinante (Trp552Leu e Tyr587Trp) exibe fluorescência saciada na ligação de ligantes. Um fluoróforo extrínseco, ou seja, 8-anilino-1-naftalina sulfonato (ANS), liga-se ao local de ligação de nucleotídeos através de interações eletrostáticas e hidrofóbicas com resíduos de Arg, His, Ala, Leu e Phe. A vinculação ans é evidenciada pelo aumento da intensidade da fluorescência quando excitada em um comprimento de onda (λ) de 370 nm. No entanto, quando animado em λ de 295 nm, o aumento da intensidade de fluorescência parece estar acoplado à extinção da fluorescência intrínseca do domínio N. Os espectros de fluorescência exibem um padrão de transferência de energia de ressonância Föster (FRET) sugerindo assim a presença de um par Trp-ANS FRET, que parece ser suportado pela curta distância (~20 Å) entre Tyr587Trp e ANS. Este estudo descreve uma análise do par Trp-ANS FRET por modificação química Trp (e saciamento de fluorescência) que é mediada por N-bromosuccinimide (NBS). No domínio N quimicamente modificado, a fluorescência ANS aumentou quando excitada em um λ de 295 nm, semelhante a quando excitada em um λ de 370 nm. Assim, a modificação química mediada pelo NBS do resíduo Trp pode ser usada para sondar a ausência de FRET entre Trp e ANS. Na ausência de fluorescência trp, não se deve observar um aumento da fluorescência da ANS. A modificação química dos resíduos de Trp em proteínas pela NBS pode ser útil para examinar os resíduos de FRET que estão próximos ao ANS vinculado. Este ensaio provavelmente também será útil ao usar outros fluoroforos.

O acoplamento molecular mostra a vinculação da ANS ao local de ligação nucleotídea do domínio N via interações eletrostáticas, bem como hidrofóbicas(Figura 1). A distância molecular (20 Å) entre o resíduo Trp e o ANS (vinculado ao local de ligação nucleotídeo) suporta a ocorrência de FRET(Figura 1). O recombinante N-domínio projetado (projetado) foi obtido com alta pureza por cromatografia de afinidade(Figura 2) e foi adequado para ...

O ANS se liga ao domínio N recombinante Ca2+-ATPase. Os espectros de fluorescência exibem um padrão semelhante ao FRET após a excitação em um comprimento de onda de 295 nm. A modificação química mediada pelo NBS de Trp sacia a fluorescência do domínio N, o que leva à ausência de transferência de energia (FRET) entre o resíduo Trp e o ANS.

Modificação química do resíduo de triptofano em um recombinante Ca2+-ATPase N-domínio para estudar triptofano-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Esses ensaios podem ajudar a esclarecer o papel dos resíduos de triptofano em proteínas ao realizar estudos de vinculação da ANS. A fluorescência ans aumenta ao se ligar a locais estruturais específicos em proteínas. Às vezes, o local de ligação da ANS se localiza perto de um resíduo de triptofano com uma distância que sugere a existência de FRET entre o triptofano e a ANS.A NBS media a modificação química dos resíduos de triptofano em proteínas, saciando sua fluorescência. Portanto, esses ensaios permitem determinar se os resíduos de triptofano contribuem para o aumento da intensidade de fluorescência da ANS pelo FRET. Neste trabalho, utilizamos um domínio de ligação de nucleotídeos recombinantes projetados da SERCA contendo mutações, com o objetivo de localizar um triptofano próximo ao local de ligação nucleotídeo onde a ANS também se liga.Este ensaio é rápido e fácil de executar, daí sua principal vantagem. Determinação no silico da interação ANS e SERCA N-Domain. Gerar uma estrutura tridimensional da proteína por modelagem molecular usando o software de modelagem proteica preferido.Identifique os resíduos de aminoácidos que formam o local de ligação nucleotídeo utilizando o software estrutural molecular preferido e determine a presença de resíduos de arginina e lisina. Estes são necessários para a vinculação ans e aumentar a intensidade de fluorescência. Devido à presença de resíduos de arginina e de lise no local de ligação nucleotídeos da SERCA, hipótesemos a vinculação da ANS ao N-Domínio.No modelo 3D, os resíduos de aminoácidos que formam o local de ligação ATP são identificados e destacados em laranja. Da mesma forma, a mutação tyrosine-para-triptofano está localizada e destacada em azul. Realizar acoplamento molecular com ATP, FITC e ANS.Os resultados de acoplamento mostram que a ANS se encaixa bem no local de ligação nucleotídeo, da mesma forma que ATP e FITC. FITC rotula o local de ligação de nucleotídeos. Calcule a distância molecular entre o resíduo do triptofano e a ANS.20 angstroms parece ser uma distância adequada para fret. Realize a simulação dinâmica molecular do complexo ANS N-Domain para determinar a estabilidade da interação. Um tempo de simulação de 10 nanossegundos mostra a estabilidade do complexo.Prossiga para realizar os experimentos in vitro. Expressão e purificação do recombinante N-Domain. Expresso e purificado, por cromatografia de afinidade, o recombinante N-Domain projetado.Realize um SDS-PAGE da proteína purificada para determinar a pureza. Determine a concentração de proteínas por absorvância em um comprimento de onda de 280 nanômetros com o coeficiente de extinção do N-Domain. Monitore a formação do complexo ANS N-Domain com base nas alterações de intensidade de fluorescência do ANS e N-Domain.Prepare uma solução de estoque ANS em N, N-Dimethylformamida. Pesar uma pequena quantidade de ANS, entre um a cinco miligramas. Dissolva ANS em um mL de volume final de N, N-Dimethylformamida.Prepare uma solução de estoque ANS de 100 micromolar usando a solução ANS em N, N-Dimethylformamida. Misture a solução com vórtice de três a cinco vezes. Prepare a solução de estoque NBS em N, N-Dimethylformamida.Pesar uma pequena quantidade de NBS, de um a cinco miligramas. Dissolva o NBS em um mL de N, N-Dimetilformamida. Prepare uma solução de estoque NBS milimona usando a solução NBS em N, N-Dimethylformamida.Misture a solução com vórtice de três a cinco vezes. Titule o N-Domain com ANS e registe o espectro de fluorescência para excitação a um comprimento de onda de 295 nanômetros a 25 graus. Obtenha a linha de base do espectro de fluorescência.Coloque um mL de tampão de fosfato de 50 milimilas com pH oito em um cuvette de quartzo de fluorescência de um mL. Posicione a célula na câmara celular termostata do espectotômetro e ajuste o comprimento de onda de excitação para 295 nanômetros. Regisso espectro de fluorescência.O espectro de fluorescência do vazio mostra o pico da água, que tem que ser subtraído mais tarde. Obtenha o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain. Coloque 900 microliters de 50 mililitros tampão de fosfato com pH 8 em um cuvette de quartzo de fluorescência.Adicione 100 microliters de suspensão N-Domain para produzir uma concentração final de um micromolar N-Domain. Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Posicione a célula na câmara termosta do Espectotômetro.Defina o comprimento de onda de excitação para 295 nanômetros. Registo o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain. Adicione ANS e obtenha o espectro de fluorescência por excitação em um comprimento de onda de 295 nanômetros.Adicione uma alíquota de dois microliter de 100 soluções de estoque ANS micromolar ao N-Domain suspenso para obter uma concentração final de 0,2 micromolar ANS. Homogeneize suavemente, utilizando uma micropipette para garantir a homogeneidade desta solução. Regisso espectro de fluorescência.Repita as adições ans e a gravação espectral de fluorescência, conforme descrito acima para uma relação molar de 1:1 ANS N-Domain. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software. Plote todos os espectros em um único gráfico Determine se um padrão semelhante ao FRET é formado pelo espectro.Os espectros de fluorescência ans n-domain formam um padrão semelhante ao FRET. Titulação intrínseca de floresnce do N-Domain por modificação química do triptofano com NBS. Obtenha novamente o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain.Adicione uma alíquota de um microliter de uma solução de estoque de NBS mililitro ao N-Domain suspenso para obter uma concentração final de um NBS micromolar. Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Regisso espectro de fluorescência.Repita a adição de NBS e a gravação espectral da fluorescência até que seja observada a saciação mínima de fluorescência intrínseca do N-Domain. Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software.Plote todos os espectros em um único gráfico. Titular o N-Domain modificado NBS com ANS registrando espectros de fluorescência a 25 graus. Adicione ANS e obtenha o espectro de fluorescência por excitação em um comprimento de onda de 295 nanômetros.Homogeneize suavemente usando uma micropipette para garantir a homogeneidade da solução. Regisso espectro de fluorescência. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software.Plote todos os espectros em um único gráfico. Os espectros de fluorescência gerados suportam ou refutam a ocorrência de FRET. Ou seja, quando o FRET ocorre, a fluorescência ans não aumenta e vice-versa.Evidência de ans vinculando-se ao N-Domain quimicamente modificado por excitação a um comprimento de onda de 370 nanômetros. Adicione ANS ao N-Domain modificado NBS e regissou o espectro de fluorescência intrínseca do N-Domain por excitação a um comprimento de onda de 370 nanômetros. Subtraia o espectro em branco de cada espectro usando software.Plote todos os espectros em um único gráfico. Confirme a vinculação ans ao N-Domain pela intensidade crescente de fluorescência ans. A vinculação ans ao N-Domain mostra um aumento de fluorescência quando excitada em um comprimento de onda de 370 nanômetros.Visão geral dos resultados. O complexo de 295 nanôs do painel A.ANS exibe um padrão semelhante ao FRET quando excitante em um comprimento de onda de 295 nanômetros. Painel B.NBS saciar a fluorescência intrínseca N-Domain modificando quimicamente o único resíduo de triptofano no N-Domain quimicamente modificado.Painel C.A fluorescência ANS aumenta quando excitante em um comprimento de onda de 295 nanômetros. Painel D.A fluorescência ANS também aumenta quando excitante em um comprimento de onda de 370 nanômetros. Portanto, a excitação direta da ANS em um comprimento de onda de 295 nanômetros é a principal fonte de fluorescência ans quando está vinculado ao local de ligação ATP. Conclusões.Estes ensaios podem ser usados para determinar a existência de FRET entre resíduos de triptofano e ANS em proteínas. O esclarecimento da FRET, confirmação ou não, entre triptofano e ANS permitirá tirar melhores conclusões em estudos estruturais proteicos. O ensaio também pode ser útil ao usar outros fluoroforos.

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Biochemistry

Bioquímica

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