Name: Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprenda a preparar grades de amostras em alta temperatura para crio-EM usando aparelho de vitrificação e congelação por imersão. Este método permite estudar estruturas proteicas dependentes de temperatura de forma funcional.

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Os autores agradecem ao Dr. Hervé Remigy da Thermo Fisher Scientific por conselhos úteis. Os experimentos de crio-EM foram realizados na Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). A ASCEM é apoiada pela Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Os autores também agradecem à Sra. Hui-Ju Huang pela assistência na preparação da amostra.

NOTA: Este protocolo tem como objetivo utilizar um aparelho de vitrificação comercial modificado para preparar as amostras de microscopia crio-eletrônica (crio-EM) em temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. A configuração experimental geral é mostrada na Figura 1. O protocolo usa 55 °C como exemplo. Para as condições específicas a outras temperaturas, consultar o quadro suplementar 2 na referência12.
1. Preparação do aparelho de vitrificação
<ol><li>Faça um furo de 1 cm em um tubo de centrífuga de 50 mL em sua extremidade fechada.</li>
	<li>Colocar o tubo na câmara do aparelho de vitrificação na saída de água ultra-sônica, como mostra a Figura 2. NOTA: O objetivo é minimizar a condensação de água, guiando o vapor de água para o trocador de calor através do tubo antes de atingir toda a câmara.</li>
	<li>Ajustar a temperatura do aparelho de vitrificação à temperatura especificada (por exemplo, 55 °C, como indicado na figura 3) e permitir que a câmara do aparelho de vitrificação atinja 55 °C e 100% de humidade relativa. Deixe repousar por pelo menos meia hora para estabilizar as condições antes de iniciar o experimento.</li>
</ol>2. Aquecendo a amostra e as ferramentas
<ol><li>Coloque o banho de água numa placa de aquecimento e ajuste a placa de aquecimento para a temperatura desejada (aqui 55 °C). Verifique com um termômetro para garantir que a água atinja 55 °C.</li>
	<li>Incubar a amostra em banho-maria e pré-aquecer a ponta da pipeta na borda da placa de aquecimento por 2 minutos ou mais antes do experimento de blotting. NOTA: A temperatura mais elevada para a câmara do aparelho de vitrificação é de 60 °C. Para preparar grelhas de temperatura mais elevadas para a experiência cyro-EM (por exemplo, 70 °C), a amostra é incubada em banho-maria a 80 °C, e a média entre a temperatura da amostra e a temperatura do aparelho de vitrificação é estimada como sendo a temperatura real da amostra na grelha (70 °C neste caso). Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes e limitações sobre essa estimativa.</li>
</ol>3. Preparação para o experimento de blotting
<ol><li>Descarga de brilho de uma grade suportada por carbono holey a 25 mA por 30 s, ou alternativa aos valores, dependendo do dispositivo usado.</li>
	<li>Incubar a pinça com a grelha no aparelho de vitrificação durante 2 min ou mais.</li>
	<li>Encha o recipiente de etano com etano de acordo com os procedimentos padrão. Não deixe o etano transbordar. NOTA: Esta etapa leva cerca de 10 minutos e deve ser seguida imediatamente com o experimento de blotting para evitar o congelamento.</li>
	<li>Coloque o papel de filtro de vitrificação na câmara do aparelho de vitrificação não antes de 5 minutos antes da experiência de blotting. NOTA: Colocar o papel de filtro na câmara muito cedo fará com que ele fique muito molhado.</li>
</ol>4. Experiência de blotting
NOTA: Ao segurar a grade, verifique se a grade está estável e se há uma área de contato mínima com a pinça (Figura 4). Isso é feito para manter a melhor eficiência de resfriamento do etano e evitar o gelo não vítreo.
<ol><li>Use uma ponta de pipeta para aplicar 7-9 μL da amostra à grade. Em seguida, aguarde 1-2 s, limpe por 1-1,5 s e mergulhe rapidamente a amostra em etano líquido.</li>
	<li>Transfira a grade do etano líquido para a caixa criogênica, que é armazenada em nitrogênio líquido. NOTA: Esta etapa deve ser executada com muito cuidado, porque a pinça ainda está quente, então todo o tanque de resfriamento está cheio de vapor neste momento.</li>
</ol>5. Verificação de qualidade para as grades
<ol><li>Recorte as grades e carregue-as para um instrumento crio-EM.</li>
	<li>Use a tela de exibição do instrumento crio-EM e a função de baixa dose do software para rastrear a condição de gelo na grade e a distribuição da amostra na grade. NOTA: Muitas vezes, as grades são muito secas, ou a camada de gelo é muito espessa. A taxa de sucesso das grelhas preparadas a altas temperaturas é substancialmente inferior à temperatura ambiente ou a 4 °C. Resultados representativos de grades boas e grades insatisfatórias são mostrados na próxima seção.</li>
	<li>Se a qualidade da grade resultante não for boa, repita o processo de preparação da grade com condições variadas (como tempo de espera, tempo de blotting, etc.). Se a qualidade da grade resultante for boa, repita as mesmas etapas para criar grades a uma temperatura diferente.</li>
</ol>6. Coleta de dados
<ol><li>Transfira as grades de boa qualidade para um instrumento crio-EM de alta resolução.</li>
	<li>Realizar coleta e análise de dados de acordo com os procedimentos estabelecidos. NOTA: Como mostrado em nossa publicação anterior, a resolução da estrutura não é afetada pela alta temperatura12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Na etapa 1 do protocolo, certifique-se de que o tubo de centrífuga foi bem instalado e não cai quando o experimento está em andamento. Devido ao acúmulo de um grande número de gotículas de água na câmara, o que poderia alterar a capacidade de adsorção do papel de filtro, recomenda-se que o tempo total do experimento não exceda 30 min após a câmara do aparelho de vitrificação atingir a temperatura de equilíbrio. Se o tempo de operação exceder 30 min, o operador precisa substituir o papel de filtro e esperar que a cabine e...

A tecnologia crio-EM para a resolução das estruturas de complexos proteicos tem continuado a melhorar, particularmente no sentido da obtenção de estruturas de alta resolução 1,2. Nesse ínterim, o cenário de sua aplicação também foi ampliado pela variação das condições da amostra, como pH ou ligantes, antes do processo de vitrificação3, que envolve a preparação de grades de amostra seguidas de congelamento por imersão 4,5. Outra condição importante é a temperatura. Embora os experimentos de crio-EM, como a cristalografia de raios-X, sejam realizados a baixas temperaturas, a estrutura resolvida pela crio-EM reflete a estrutura no estado da solução antes da vitrificação. Até recentemente, a maioria dos estudos de crio-EM de análise de partícula única (SPA) usa amostras que são mantidas no gelo (ou seja, a 4 °C) antes da vitrificação6, embora vários estudos usem amostras em torno da temperatura ambiente 7,8,9,10 ou tão alto quanto 42 °C 11. Em um relatório recente, realizamos estudos dependentes da temperatura da enzima reducionoisorase cetola-ácida (KARI) do arqueão termofílico Sulfolobus solfataricus (Sso) em seis temperaturas diferentes de 4 °C a 70 °C12. Nossos estudos sugerem que é importante preparar grades de amostras a temperaturas funcionalmente relevantes e que o crio-EM é o único método estrutural praticamente viável para resolver a estrutura do mesmo complexo proteico em múltiplas temperaturas.
A maior dificuldade para a vitrificação em altas temperaturas é minimizar a condensação de vapor e alcançar gelo fino. Aqui relatamos o protocolo detalhado usado para preparar grades de amostras em altas temperaturas em nosso estudo anterior do Sso-KARI 12. Assumimos que os leitores ou espectadores já são experientes nos procedimentos gerais de preparação de amostras e processamento de dados para experimentos de crio-EM e enfatizamos os aspectos relevantes para a alta temperatura.

<table><tbody><tr><td>Tubo Falcon</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>tamanho: 50 mL</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Ted Pella</td><td>47000-100</td><td>&Oslash; 55/20mm, Grau 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>Leica</td><td></td><td>banho-maria</td></tr><tr><td>K100X</td><td>Ciências de Microscopia</td><td></td> Eletrônica descarga <td>incandescente</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh grade</td><td>Ted Pella</td><td>658-200--100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>imagem de baixa dose Vitrobot</td></tr><tr><td>Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Vitrobot</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

As grades de amostras para experimentos de microscopia crioeletrônica (crio-EM) são geralmente preparadas a uma temperatura ideal para o armazenamento de amostras biológicas, principalmente a 4 °C e, ocasionalmente, à temperatura ambiente. Recentemente, descobrimos que a estrutura proteica resolvida a baixa temperatura pode não ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de archaea termofílicas. Um procedimento foi desenvolvido para preparar amostras de proteína em temperaturas mais altas (até 70 °C) para análise crio-EM. Mostramos que as estruturas de amostras preparadas em temperaturas mais altas são funcionalmente relevantes e dependentes da temperatura. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras em alta temperatura, usando 55 °C como exemplo. O experimento utilizou um aparelho de vitrificação modificado com um tubo de centrífuga adicional, e as amostras foram incubadas a 55 °C. Os procedimentos detalhados foram ajustados para minimizar a condensação de vapor e obter uma fina camada de gelo na grade. Exemplos de experimentos bem-sucedidos e malsucedidos são fornecidos.

A visão geral de baixa ampliação é mostrada na Figura 5A,B. O Painel A é um exemplo de uma grade bem-sucedida. Há um gradiente de gelo do canto superior esquerdo (mais espesso) para o canto inferior direito (mais fino ou vazio). Essa grade facilita a localização de uma espessura apropriada da camada de gelo na área do meio adequada para a coleta de dados, como as caixas azul e verde. A grade B está muito seca. Os quadrados na grade têm contraste brilhante, o que significa qu...

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras a temperaturas tão altas quanto 70 °C, antes do congelamento por imersão para experimentos de crio-EM.

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

As funções das proteínas são dependentes da temperatura e são ótimas à temperatura. Este protocolo fornece uma maneira de resolver estruturas de proteínas em temperaturas mais altas. Esta abordagem pode fornecer estruturas funcionalmente relevantes e melhorar a compreensão da dependência da temperatura das estruturas proteicas.Demonstrando o procedimento estará Yuan-Chih Chang, Gerente da instalação EM da Academia Sinica Cryo. Comece fazendo um orifício de um centímetro em um tubo de centrífuga de 50 milímetros em sua extremidade fechada. Coloque o tubo na câmara do aparelho de vitrificação na saída de água ultra-sônica.Configure a temperatura do aparelho de vitrificação para a temperatura especificada e permita que a câmara do aparelho de vitrificação atinja 55 graus Celsius e 100% de umidade relativa. Deixe repousar por pelo menos meia hora para estabilizar as condições antes de iniciar o experimento. Coloque o banho de água em uma placa quente e ajuste a placa quente para a temperatura desejada.Verifique com um termômetro para garantir que a água atinja 55 graus Celsius. Incubar a amostra no banho-maria e pré-aquecer a ponta da pipeta na borda da placa quente por dois minutos ou mais antes do experimento de blotting. Descarga de brilho em uma grade suportada por carbono holey a 25 miliamperes por 30 segundos.Coloque o papel de filtro de vitrificação na câmara do aparelho de vitrificação o mais tardar cinco minutos antes da experiência de blotting. Incubar a pinça com a grelha no aparelho de vitrificação durante dois minutos ou mais. Construa o recipiente de etano com etano de acordo com os procedimentos padrão, garantindo que o etano não transborde.Use uma pipeta para aplicar de sete a nove microlitros da amostra na grade. Em seguida, aguarde de um a dois segundos, apague por um a um segundo e meio e mergulhe rapidamente a amostra em etano líquido. Transfira a grade do etano líquido para a caixa de crio armazenada em nitrogênio líquido.Corte as grades e descarregue-as para adquirir microscópio eletrônico ou instrumento Cryo EM. Use a tela de exibição do instrumento Cryo EM e a função de baixa dose do software para rastrear a condição de gelo na grade e a distribuição da amostra na grade. Se a qualidade da grade resultante não for boa, repita o processo de preparação da grade com condições variadas, como tempo de espera, tempo de blotting, etc.Se a qualidade da grade resultante for boa, repita as mesmas etapas para criar grades a uma temperatura diferente. Transfira as grades de boa qualidade para um instrumento Cryo EM de alta resolução. Realizar coleta e análise de dados de acordo com os procedimentos estabelecidos.No caso da grade bem-sucedida, um gradiente de gelo formado com gelo mais espesso no canto superior esquerdo da grade e gelo mais fino no canto inferior direito. Caixas azuis e verdes adequadas para a coleta de dados foram observadas na grade de sucesso. Um contraste brilhante foi observado na outra grade.Indicando uma camada fina, de gelo ou uma ausência de gelo. Apenas dois quadrados foram considerados adequados para a coleta de dados na segunda grade. Uma das grades consistia de gelo principalmente na forma cristalina, o que era inadequado para a coleta de dados.Por outro lado, a outra grade mostrou que a camada de gelo estava em um estado amorfo adequado para a coleta de dados. A preparação do como um recipiente e outros precisam ser completos de acordo com um ponto de tempo. O controle de tempo e o término do experimento com rapidez e precisão são os mais importantes.Dependendo dos resultados obtidos com este protocolo, o pesquisador pode ter que ter mais cuidado na configuração das condições simples.

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