Name: Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a usar um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota ex vivo. Este método combina controle experimental rigoroso com preservação da fisiologia intestinal.

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Agradecemos aos membros do passado e presente do laboratório Yissachar por suas valiosas contribuições na otimização do protocolo do sistema de cultura de órgãos intestinais. Agradecemos a Yael Laure pela edição crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Israel Science Foundation (grant No. 3114831), pela Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (grant No. 8165162) e pelo Fundo Gassner para Pesquisa Médica, Israel.

Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal aprovadas pelo comitê de ética para o bem-estar animal.
1. Preparação do experimento
<ol><li>Fabricação do dispositivo de cultura de órgãos intestinais (3 dias)<ol>
<li>Usando uma impressora 3D, imprima os moldes de plástico reutilizáveis para o dispositivo de cultura de órgãos (o dispositivo tem 6 poços, com 24 pequenos e grandes furos, e para a tampa da tampa do dispositivo) (arquivos 3D conectados). NOTA: Estes moldes plásticos podem ser usados para fabricação de inúmeros dispositivos.</li>
		<li>Insira as agulhas de extremidade bruta (22 G & 18 G) na posição apropriada dentro do molde do dispositivo e lance aproximadamente 20 g de mistura de polidimimetilsiloxano (PDMS) (razão de peso de 1:10, base para catalisador) para um conjunto do dispositivo e da tampa.</li>
		<li>Coloque os moldes em uma câmara de vácuo por 30 minutos, para remover bolhas de ar da mistura PDMS.</li>
		<li>Incubar os moldes a 55 °C durante a noite, para completar a polimerização PDMS.</li>
		<li>Quando o PDMS estiver pronto, retire as agulhas do molde e solte cuidadosamente o dispositivo de cultura e a tampa dos moldes de plástico.</li>
		<li>Remova os resíduos PDMS do contorno do poço usando uma lâmina cirúrgica. Conecte o dispositivo PDMS e a tampa do dispositivo em um vidro de cobertura (micro lâminas de 75 mm x 50 mm) usando adesivo de silício não tóxico e deixe as peças para definir durante a noite (aplique a cola no lado liso do dispositivo).</li>
		<li>Insira doze agulhas de 22 G para o lúmen e doze agulhas de 18 G para o poço. Conserte todas as agulhas no lugar usando silicone e deixe-a definida durante a noite. Insira duas agulhas de 18 G na tampa para obter um fluxo de ar adequado dentro e fora do dispositivo de cultura do órgão intestinal.</li>
		<li>Verifique todas as agulhas quanto a vazamentos usando uma seringa cheia de água. Verifique se não há vazamento dos poços enchendo os poços com água.</li>
		<li>Coloque dois nós cirúrgicos em cada agulha de 22 G que serão conectados ao cólon. Coloque o dispositivo e a tampa em um saco de papel autoclave e esterilize em uma autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meio de cultura (0,5 h)<ol>
<li>Em um capuz biológico, misturar o seguinte (em tubo de 50 mL): 37 mL do Meio Modificado de Dulbecco (IMDM) de Iscove, 10 mL de substituição de soro KSR, 1 mL de suplemento B27, 0,5 mL de suplemento N2, 0,5 mL de tampão HEPES de 1 M e 0,5 mL de aminoácidos não essenciais.</li>
		<li>Filtre e armazene o meio completo a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tubulação e preparação de ferramentas cirúrgicas<ol>
<li>Corte o comprimento apropriado dos tubos para o lúmen de entrada, bem de entrada, lúmen de saída e saída bem (12 tubos curtos e 12 tubos longos). Conecte um adaptador apropriado a cada lado do tubo.</li>
		<li>Prepare as ferramentas cirúrgicas: tesoura reta, fórceps finos 4x e fórceps afiados de 2x.</li>
		<li>Coloque os tubos e as ferramentas cirúrgicas em um saco de papel autoclave e esterilize-os usando uma autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a entrada luminal (estimulação desejada - bactérias, fezes, drogas, etc.).<ol>
<li>Antes do experimento, determine a carga bacteriana da cultura bacteriana, por diluições seriais12, e cultura sob condições aeróbicas e/ou anaeróbicas.</li>
		<li>Após calcular a carga bacteriana, diluir as culturas bacterianas em meio de cultura tecidual estéril para obter a concentração bacteriana necessária. Para amostras fecais, filtrar usando um coador de 100 μm. NOTA: Para estimulação não bacteriana (drogas, metabólitos, etc.), diluir a substância à concentração necessária utilizando o meio de cultura intestinal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de configuração de experimento
<ol><li>Dentro da incubadora de cultura de órgãos, ligue a unidade de aquecimento e coloque-a a 37 °C.</li>
	<li>Configure as bombas, bem como as seringas de entrada e saída.</li>
	<li>Entrada média de cultura de tecido<ol>
<li>Em uma capa de fluxo biológica ou laminar, encha as seringas de poço de entrada com meio de cultura completa. O volume final depende da duração do experimento e da taxa de fluxo; geralmente 1 mL/h mais meio adicional para expurgo.</li>
		<li>Conecte os tubos às seringas usando o adaptador Luer-lock. Coloque as seringas enchidas nas bombas de seringa.</li>
		<li>Limpe as seringas de entrada. Certifique-se de que o meio do poço flua de todos os tubos para um copo de lixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entrada luminal<ol>
<li>Encha as seringas de entrada luminal com tratamento de estimulação (bactérias, drogas, etc.). O volume depende da duração do experimento e da taxa de fluxo (geralmente 30 μL/h mais meio adicional para expurgo).</li>
		<li>Conecte os tubos às seringas usando o adaptador Luer-lock. Coloque as seringas enchidas nas bombas de seringa.</li>
		<li>Purgue as seringas de entrada. Certifique-se de que a estimulação flua de todos os tubos em um copo de lixo. Tenha cuidado para não contaminar as diferentes estimulações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saídas<ol>
<li>Coloque as seringas vazias nas bombas de seringa de saída (ajuste o modo de bomba para 'retirada').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuração do dispositivo<ol>
<li>Defina a taxa de fluxo do regulador que controla a mistura de gás (95% O2 + 5% CO2) para um fluxo suave e mínimo.</li>
		<li>Examine o dispositivo em um capô laminar.</li>
		<li>Lave as agulhas do dispositivo com IMDM estéril para lavar as agulhas.</li>
		<li>Adicione 500 μL de meio de cultura estéril em cada poço do dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação para dissecção tecidual<ol>
<li>Coloque as ferramentas cirúrgicas estéreis dentro do capô laminar.</li>
		<li>Encha uma seringa de 10 mL com IMDM estéril e conecte uma agulha estéril (autoclaved) de 22 G para descarga do cólon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Culturas de órgãos
<ol><li>Sacrifício de camundongos e dissecção de tecido<ol>
<li>Em um bairro laminar, sacrifício ratos de 12 a 14 dias de idade por decapitação. Borrife os ratos com 70% de etanol e coloque os ratos em uma placa de plástico.</li>
		<li>Usando tesouras afiadas e fórceps, disseca o rato e retire o trato digestivo do estômago para o ânus cortando toda a gordura e tecidos conjuntivos. Corte o cólon e coloque-o em um prato novo. NOTA: Minimize o contato com o tecido do cólon. Não toque na parte do meio do tecido do cólon. Segure o tecido suavemente e apenas nas bordas do tecido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavagem e lavagem de cólon<ol>
<li>Sob um microscópio de dissecção, lave suavemente o teor de cólon com IMDM estéril (no lado proximal) com a seringa preparada de 10 mL (passo 2.7.2). Depois de remover as fezes do tecido intestinal, coloque o cólon em uma nova placa de 6 poços preenchida com 0,5 mL de IMDM estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conectando o cólon ao dispositivo<ol>
<li>Pegue o tecido e conecte-o cuidadosamente à agulha de 22 G e faça uma gravata apertada com os dois fios. Neste ponto, é imprescindível manter a orientação correta do cólon para o fluxo de lúmen (proximal = entrada, distal = saída). Repita as etapas 3.2-3.3 para todos os 6 tecidos.</li>
		<li>Verifique se as travas luer da agulha de entrada estão vazias do meio. Se não, esvazie-os. Adicione estímulos à agulha de entrada Trava luer (para evitar a entrada de bolhas de ar no lúmen). Repita esta etapa para cada cólon com a estimulação apropriada.</li>
		<li>Verifique se todos os tecidos estão conectados e coloque a tampa na parte superior do dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conectando o dispositivo de cultura de órgãos às bombas<ol>
<li>Coloque o dispositivo na câmara pré-aquecida controlada pela temperatura (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte o fluxo de gás<ol>
<li>Conecte o adaptador de gás à tampa da tampa usando a agulha de entrada apropriada.</li>
		<li>Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo. NOTA: Conecte o lado do cólon proximal às banheiras de entrada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purgue o lúmen com as entradas de estimulação.<ol>
<li>Flua suavemente a estimulação luminal através do intestino e verifique o fluxo médio nos tubos de saída.</li>
		<li>Lave o meio externo.</li>
		<li>Lave o meio externo 3 vezes (coloque as bombas a uma taxa de 600 μL/min tanto para entrada quanto para saída). Cada lavagem leva 1 min (começando esvaziando o poço).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comece a experiência.<ol>
<li>Inicie as bombas nas seguintes taxas: Taxa de fluxo: lúmen: entrada- 30 μL/h, saída- 35 μL/h Meio externo: entrada- 1000 μL/h, saída- 950 μL/h NOTA: O tempo de experiência pode variar entre 30 min e 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fim do experimento (até 24 h para culturas de órgãos de cólon)<ol>
<li>Desconecte todos os tubos do dispositivo.</li>
		<li>Desconecte os tecidos das agulhas e continue para as leituras desejadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
<li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell%2Fleucocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um protocolo otimizado para culturas de órgãos ex vivo gut que Yissachar et al. desenvolveram recentemente (dados publicados9 e inéditos). O sistema de cultura de órgãos intestinais suporta a cultura multiplexada de fragmentos intestinais intactos, mantendo o fluxo luminal. Fornece controle total sobre o ambiente intra e extra-luminal (incluindo dose de estimulação, tempo de exposição e taxa de fluxo) e preserva a estrutura ingênua do tecido intestinal e sua complexid...

O intestino é um órgão altamente complexo que contém uma ampla gama de tipos celulares (células epiteliais, células do sistema imunológico, neurônios e muito mais) organizado em uma estrutura particular que permite que as células interajam e se comuniquem entre si e com o conteúdo luminoso (microbiota, alimentos, etc.) 1. Atualmente, a caixa de ferramentas de pesquisa disponível para análise de interações host-microbiota inclui culturas in vitro células e modelos in vivo animais2. Os modelos in vivo animal fornecem uma construção fisiológica de tecido3, mas com baixo controle experimental e capacidade limitada de manipular as condições do experimento. Sistemas de cultura in vitro, por outro lado, usam células primárias ou linhas celulares que podem ser complementadas com micróbios4,oferecendo controle rigoroso sobre os parâmetros do experimento, mas não têm a complexidade celular e a arquitetura tecidual. Ensaios in vitro modernos permitem o uso avançado de amostras de tecido humano saudável e patológico, como organoides epiteliais derivados de fontes humanas ou camundongos5,6, e amostras que imitam o microambiente mucosal7. Outro exemplo é o ensaio "intestino em um chip", que inclui a linha celular epitelial cólon humana (Caco2), matriz extracelular e canais microfluidos para imitar a condição fisiológica do intestino invariante8. No entanto, por mais avançados e inovadores que as amostras in vitro possam ser, elas não mantêm uma arquitetura de tecido normal ou uma composição celular ingênua.
Para lidar com isso, Yissachar et al. desenvolveram recentemente um sistema de cultura de órgãos ex vivo 9 (Figura 1) que mantém fragmentos intestinais intactos ex vivo,beneficiando-se das vantagens tanto dos modelos in vivo quanto in vitro. Este sistema de cultura de órgãos ex vivo gut é baseado em um dispositivo de cultura personalizado que suporta uma cultura multiplexada de seis tecidos de cólon, permitindo examinar entradas experimentais em condições comparáveis enquanto controla as entradas e saídas do sistema. Trabalhos recentes demonstraram que esse sistema é valioso para analisar respostas intestinais a bactérias intestinais individuais9, amostras inteiras de microbiota humana10 e metabólitos microbianos11. Este sistema permite, pela primeira vez, o estudo dessas interações entre hospedeiros e microbiotas precoces com alto nível de controle sobre os componentes hospedeiros, microbianos e ambientais. Além disso, permite monitorar e manipular o sistema durante todo o experimento, em tempo real.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Figura 1: Esquemas do dispositivo de cultura intestinal. Todo um fragmento de tecido intestinal é anexado às portas de saída e entrada da câmara (superior), com bombas regulando o fluxo médio dentro do lúmen e na câmara média externa. Todo o dispositivo (inferior) contém 6 dessas câmaras. Este número foi modificado a partir de Yissachar et al. 2017. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge Blunt Needle</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Blunt Needle</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Multiuso Selant 100% Silicone</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a Vácuo Cúbico VDC-21+ 2 Prateleiras</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>Slide de Vidro 1 mm de espessura</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Mini Incubadora im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E Bomba</td><td></td> de Vácuo <td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>Plugues de Acoplamento de Tubo de Giro Rápido de Plástico</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>soquetes de acoplamento de tubo de giro rápido de plástico</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastômero de Silicone</td><td>Dow</td><td></td><td>Polidimetilsiloxano, Tubulação PDMS</td></tr><tr><td></td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 Materiais: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x), Sem Soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Buffer HEPES (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Meio Dulbecco's Modificado de Iscove com Vermelho de Fenol (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Não Aminoácido Essencial (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas Cirúrgicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Tesoura</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Afiada</td><td>F.S.T</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>Fio Cirúrgico Trançado de Seda</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Reta</td><td>F.S.T</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Fina</td><td>F.S.T</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Órgãos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro; m Gene</td><td>de Vida do</td><td></td><td></td>Filtro</tr><tr><td>0.22 &micro; m Filter</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer Lock Seringa</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Microscópio Estéreo</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de Ar de Precisão Recirculante "CUBE" CUBE-2-LIS</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bomba de Seringa</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>NEP-NE-1600-EM</td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

A estrutura do tecido intestinal facilita interações próximas e mutualísticas entre o hospedeiro e a microbiota intestinal. Essas conversas cruzadas são cruciais para a manutenção da homeostase local e sistêmica; alterações na composição da microbiota intestinal (disbiose) associam-se a uma ampla gama de doenças humanas. Os métodos de dissecar as interações hospedeira-microbiota englobam uma troca inerente entre a preservação da estrutura tecidual fisiológica (ao usar modelos animais in vivo) e o nível de controle sobre os fatores experimentais (como em sistemas simples de cultura celular in vitro). Para lidar com essa troca, Yissachar et al. desenvolveram recentemente um sistema de cultura de órgãos intestinais. O sistema preserva uma construção ingênua de tecido de cólon e mecanismos celulares e também permite um controle experimental rigoroso, facilitando experimentações que não podem ser prontamente realizadas in vivo. É ideal para dissecar respostas de curto prazo de vários componentes intestinais (como elementos epiteliais, imunológicos e neuronais) a perturbações luminais (incluindo micróbios anaeróbicos ou aeróbicos, amostras inteiras de microbiota de camundongos ou humanos, drogas e metabólitos). Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um protocolo otimizado para a cultura de órgãos de múltiplos fragmentos de intestino usando um dispositivo de cultura intestinal feito sob medida. As respostas do hospedeiro às perturbações luminais podem ser visualizadas pela coloração da imunofluorescência de seções de tecido ou fragmentos de tecido de montagem total, hibridização de fluorescência in-situ (FISH) ou imagens de lapso de tempo. Este sistema suporta uma ampla gama de leituras, incluindo sequenciamento de próxima geração, citometria de fluxo e vários ensaios celulares e bioquímicos. No geral, este sistema tridimensional de cultura de órgãos apoia a cultura de grandes tecidos intestinais intactos e possui amplas aplicações para análise de alta resolução e visualização de interações hospedeira-microbiota no ambiente intestinal local.

O sistema de cultura de órgãos intestinais mantém a viabilidade tecidual ex vivo. A avaliação da viabilidade tecidual foi feita durante todo o período cultural. Fragmentos de tecido de cólon foram incubados no sistema de cultura de órgãos intestinais e fixados após a cultura de 2/12/24 h. A integridade da camada da célula epitelial intestinal (IEC) foi validada pela coloração da imunofluorescência usando anticorpos E-cadherin e citokeratin-18. Da mesma forma, foram detectadas células de cálice cheias de muco no ...

Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

O sistema de cultura de órgãos intestinais combina as vantagens dos ensaios in vitro e in vivo e, portanto, serve como um passo experimental intermediário entre ensaios in vitro simples e complexos. A principal vantagem dessa técnica é a combinação de controle experimental apertado com a preservação da fisiologia intestinal. Este método fornece insights para a análise de respostas intestinais a estímulos específicos com alto nível de controle sobre o hospedeiro, microbiano e os componentes ambientais.Demonstrando o procedimento estarão Alon Shemesh, um estudante de mestrado do meu laboratório, e o Dr. Sivan Amidror, nosso gerente de laboratório. Para começar, insira as agulhas de ponta bruta na posição apropriada dentro do molde do dispositivo e lance aproximadamente 20 gramas de mistura de polidimometiletilatosiloxano ou PDMS, para um conjunto do dispositivo e da tampa. Coloque os moldes em uma câmara de vácuo por 30 minutos para remover bolhas de ar da mistura PDMS e, em seguida, incubar os moldes a 55 graus Celsius durante a noite para completar a polimerização do PDMS.Quando o PDMS estiver pronto, retire as agulhas do molde e solte cuidadosamente o dispositivo de cultura e a tampa dos moldes de plástico. Remova os resíduos PDMS do contorno do poço usando uma lâmina cirúrgica. Conecte o dispositivo PDMS e a tampa do dispositivo em um vidro de cobertura de 75 por 50 milímetros de microslides usando adesivo de silício não tóxico e deixe as peças definidas durante a noite.Aplique o colado no lado liso do dispositivo. Insira 12, 22 agulhas de calibre para o lúmen e 12, 18 agulhas de bitola para o poço. Conserte todas as agulhas no lugar usando silicone e deixe-a definida durante a noite.Purgue as seringas de entrada e certifique-se de que o meio-poço flua de todos os tubos em um copo de lixo, em seguida, purgar as seringas de entrada e certifique-se de que as estimulações fluem de todos os tubos em um copo de lixo, tomando cuidado para não contaminar as diferentes estimulações. Depois de sacrificar o rato, use tesouras afiadas e fórceps para dissecá-lo e tirar o trato digestivo do estômago para o ânus, cortando toda a gordura e tecidos conjuntivos. Corte o cólon e coloque-o em um prato novo.Minimize o contato enquanto segura o tecido suavemente e apenas nas bordas. Realize a descarga do cólon sob um microscópio de dissecção. Lave suavemente o teor de cólon com IMDM estéril com a seringa preparada de 10 mililitros, conforme descrito no texto.Depois de remover as fezes do tecido intestinal, coloque o cólon em uma nova placa de seis poços preenchida com 0,5 mililitros de IMDM estéril. Em seguida, pegue o tecido do cólon e conecte-o cuidadosamente à agulha de calibre 22, fazendo uma gravata apertada com os dois fios. Mantenha a orientação correta do cólon para o fluxo de lúmen, de tal forma que o proximal e distal seja igual à entrada e saída, respectivamente.Repita a descarga do cólon e a agulha para todos os tecidos. Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo e inicie o experimento iniciando as bombas nas taxas desejadas. Células de cálice cheias de muco no epitélio colonico e secreção de muco dentro do lúmen foram detectadas, bem como proliferando IEC nas criptas coloniais, como indicado pela coloração ki67.Esses resultados mostraram que o sistema de cultura intestinal mantém a função intestinal e a estrutura ex-vivo. Após duas horas de bactérias filamentosas segmentadas, ou SFB, introdução, filamentos típicos de SFB foram detectados em estreita associação com o intestino delgado villi usando fluorescência na hibridização situ. Além disso, uma microscopia eletrônica de transmissão apresentou SFB dentro de alguns mícrons da borda do pincel de epitélio do intestino delgado.Perfis de expressão genética de amostras de tecido inteiro foram produzidos em triplicado duas horas após a infusão com SFB. As culturas de controle foram infundidas com suspensões fecais de camundongos monocolonizados livres de germes ou bacteroides. Essas mudanças persuadidas pela SFB foram principalmente de pequena amplitude em comparação com o controle livre de germes.A orientação do cólon é muito importante. Tome cuidado extra ao amarrar o cólon na agulha. A gravata adequada evitará a contaminação do poço com o teor de lúmen.Uma ampla gama de técnicas de leitura pode seguir este protocolo, como sequenciamento de próxima geração, imagem, classificação celular e muito mais. Estas leituras fornecem novas informações sobre interações de microbioma hospedeiro em saúde e doenças.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra um modelo intestino-microrganismo in vitro para estudar a viabilidade bacteriana. Uma cocultura de células Caco-2 e HT29-MTX é incubada com bactérias pré-tratadas sob condições digestivas simuladas. A integridade da barreira epitelial é avaliada usando resistência elétrica transepitelial, e frações do meio, muco...

Modelo intestinal in vitro para avaliar adesão bacteriana e internalização

Neste vídeo, descrevemos a metodologia para configurar um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações entre fragmentos de tecido intestinal de camundongos e bactérias intestinais específicas. O dispositivo consiste em dois pares de portas de entrada e saída, a primeira conectando o lúmen do tecido intestinal e fornecendo a suspensão bacteriana específica a ele, e a segunda fornecendo continuamente meios aos poços do dispositivo para manter a viabilidade do tecido...

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Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

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o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Órgão Cultura Colon e seu uso em Antimicrobial host Estudos de Defesa

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Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

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Aprenda a usar um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota ex vivo. Este método combina controle experimental rigoroso com preservação da fisiologia intestinal.

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