Name: Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a rotular vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetário para monitorar migração e absorção em explantes de cartilagem usando microscopia confocal. Este protocolo simplifica o estudo de vesículas em osteoartrite.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124); pelo PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares; pelo Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); pelo programa de pós-doutorado FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro do FUTURMed, financiado em 50% pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares e em 50% pela ESF; e pelo Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparação da coluna
<ol><li>Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:<ol>
<li>Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.</li>
		<li>Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Durante cada lavagem, espere que a coluna absorva todo o volume. NOTA: Não deixe a coluna secar.</li>
		<li>Cubra a coluna com a tampa após a última lavagem e até a preparação da amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Rotulagem EV
NOTA: Este protocolo de rotulagem EV utiliza uma amostra PL-EV anteriormente isolada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com condições previamente descritas21,22. No entanto, qualquer amostra de EV de qualquer fonte pode ser usada com este protocolo.
<ol><li>Concentre a amostra EV e o controle (PBS) utilizando um tubo de concentração.<ol>
<li>Coloque as amostras em um tubo concentrador de 15 mL ou 500 μL, dependendo do volume inicial da inicialção da amostra EV. Centrifugar os tubos de acordo com as instruções do fabricante até que uma amostra quase seca seja obtida. NOTA: A amostra de controle é necessária para verificar se há qualquer fundo de corante. Embora este método não exija nenhum volume inicial específico, deve-se considerar que cerca de 10% das partículas serão perdidas durante as etapas de purificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend as amostras concentradas com amostras de EV diluentes com 200 μL e o grupo controle com 100 μL e transfira-as para novos tubos de centrífugas de 1,5 mL.</li>
	<li>Separe a amostra de EV em duas alíquotas de 100 μL. Marque um com corante e use-a como tratamento (PKH-PL-EV); deixe o outro não marcado, mas processe-o (NTA-PL-EV) como a amostra EV e use-a para quantificar a concentração de EV pela NTA.</li>
	<li>Prepare a solução de corante 2x, resultando em solução PKH26 de 8 μM em C diluído.</li>
	<li>Misture 1 μL de 1 mM PKH26 linker por 125 μL de C diluído na amostra. Prepare um volume necessário para adicionar às amostras em uma proporção de 1:1.</li>
	<li>Adicione solução de corante 2x ao PKH-PL-EV e controle amostras em uma proporção de 1:1 para alcançar 1x de concentração de corante e 4 μM de concentração PKH26. Adicione o mesmo volume de PBS à amostra NTA-PL-EV. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 5% de solução de gérico bovino albumin-PBS às amostras em uma proporção de 1:1 e certifique-se de que o volume final seja ~400 μL. NOTA: Esta etapa permite a remoção de interações de corantes inespecíficos ou corantes não vinculados.</li>
	<li>Prossiga para separar os EVs rotulados do corante não vinculado e interações não específicas do corante com a coluna.</li>
</ol>3. Isolamento rotulado-EV
<ol><li>Retire a tampa da coluna, adicione 400 μL da amostra (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou controle) e descarte todo o líquido elucido.</li>
	<li>Aguarde que a amostra entre completamente na coluna antes de prosseguir para o próximo passo. Adicione 600 μL de PBS e descarte todo o líquido elucido.</li>
	<li>Aguarde que o PBS entre completamente na coluna antes de prosseguir para a próxima etapa. Adicione 600 μL de PBS e colete uma fração de 600 μL em um 1,5. tubo de centrífugas mL (EVs ou controle). NOTA: Estas etapas são necessárias para remover o excesso de corante das amostras. Outra separação por coluna é necessária para obter EVs mais puros. Assim, as etapas a seguir devem ser realizadas em uma nova coluna equilibrada (etapa 4.1.) ou na mesma coluna após uma etapa inicial de lavagem (etapa 4.2).</li>
	<li>Prepare a coluna para uma nova etapa de separação do EV para obter EVs mais puros. Se for uma nova coluna, repita os passos 2.1. e 2,2. Se for a mesma coluna, lave a coluna com 2,5 mL de isopropanol de 20% e, em seguida, repita as etapas 2.1 e 2.2.</li>
	<li>Adicione 600 μL de EVs previamente elucidos obtidos na etapa 2.5 à coluna e descarte o volume elucido. Aguarde que o líquido entre na coluna completamente antes de prosseguir para o próximo passo.</li>
	<li>Adicione 400 μL de PBS e descarte todo o volume elucido. Aguarde que o líquido entre na coluna completamente antes de prosseguir para o próximo passo.</li>
	<li>Adicione 600 μL de PBS e colete uma fração de 600 μL em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Use os EVs e as amostras de controle para novas análises ou armazene-as durante a noite a 4 oC.</li>
	<li>Armazene as colunas usadas para uso futuro.<ol>
<li>Lave a coluna com 25 mL de isopropanol de 20% e descarte o volume elucido. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de PBS.</li>
		<li>Adicione o buffer de armazenamento removido na etapa 1.1.1 e aguarde que o buffer entre na coluna. Cubra a coluna com a tampa e armazene a 4 oC até o uso subsequente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantificação de EV
<ol><li>Prepare 1:1.000 diluições da amostra NTA-PL-EV e da amostra inicial de PL-EV, conforme descrito pelas duas etapas seguintes.<ol>
<li>Prepare 1 mL de 1:10 diluído NTA-PL-EV e 1 mL de PL-EV inicial diluído com PBS filtrado através de um filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Prepare 1 mL de uma diluição de 1:100 das amostras diluídas anteriores com PBS filtrado através de um filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete a amostra NTA-PL-EV diluída de 1:100 ou a amostra inicial de PL-EV usando uma seringa estéril na bomba NTA. Siga as instruções e recomendações do fabricante para a concentração de partículas e a determinação da distribuição de tamanho. NOTA: Como a concentração de EV depende do volume de inicialização da amostra, pode ser necessário ler diluições intermediárias e fazer ajustes para obter uma determinação correta do NTA.</li>
</ol>5. EVs usados como tratamento para OA movidos a inflamação
<ol><li>Lave a cartilagem duas vezes com PBS e extirpar-a usando um soco de biópsia de 3 mm de diâmetro em condições estéreis. NOTA: Realize o procedimento das etapas 5.1 a 5.6 em um capô de cultura celular.</li>
	<li>Coloque as explantas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEM-F12 suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina a 37 oC, 5% DE CO2e 80% de umidade.<ol>
<li>Para estabelecer um modelo de OA orientado para inflamação, suplementar o meio de cultura celular com oncostatina M de 10 ng/mL e 2 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNFα).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trate as explantas com 1 × 109 partículas/poço de EVs rotulados (PKH-PL-EV) ou controle em meio de cultura celular complementado com oncostatina M e TNFα. NOTA: Meça o volume da amostra contendo 1 × 109 partículas/poço e use o mesmo volume para o controle.</li>
	<li>Remova o meio das placas de cultura celular de 96 poços contendo explants de cartilagem. Adicione 200 μL do meio de cultura celular descrito na etapa 5.3 para cada poço. NOTA: Se as placas de 96 poços tiverem estado em contato com o soro bovino fetal (FBS), lave cada poço três vezes com 200 μL de PBS para remover quaisquer EVs do FBS.</li>
	<li>Pare o ensaio in vitro em horários diferentes: 0, 1, 2, 3, 4 e 5h.</li>
	<li>Lave os poços de cultura celular contendo as explantas de cartilagem duas vezes com 200 μL de PBS.</li>
	<li>Adicione 100 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) ao tecido para fixá-lo por 3h a 4 oC. NOTA: As etapas que envolvem a PFA devem ser realizadas em um capô de fumaça seguindo as recomendações da Ficha de Dados de Segurança.</li>
	<li>Retire o PFA, adicione 100 μL de PBS, armazene o tecido fixo a 4 °C e processe as amostras dentro de 48 h.</li>
</ol>6. Preparação e visualização de microscopia
NOTA: Este procedimento histológico consiste em desidratação, incorporação de parafina e etapas de reidratação. Essas etapas podem reduzir a fluorescência geral do corante (uma limitação mencionada na folha de dados para PKH26). Portanto, outros procedimentos, como a secção congelada, podem ser mais adequados para visualização de EV por microscopia confocal.
<ol><li>Incorpore os tecidos fixos em blocos de parafina. Corte o tecido em seções de 6 μm de espessura.</li>
	<li>Desparafinar as seções de tecido. NOTA: Todas as etapas que utilizam xileno devem ser realizadas em um capô de fumaça.<ol>
<li>Mergulhe as seções teciduais em xileno por 30 min, 100% etanol por 2 min, 96% etanol por 2 min, 75% etanol por 1 min, e finalmente em água destilada por 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize as seções teciduais.<ol>
<li>Prepare uma solução de citrato de sódio Triton-0,1% de 0,1% para permeabilizar o tecido. Adicione uma gota de 20 μL em cada seção de tecido e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave cada seção duas vezes com 20 μL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em um slide microscópico, adicione uma gota de meio de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) com um meio de montagem aquoso para preservar a fluorescência. Cubra a lâmina contendo 3 seções teciduais da etapa 6.3.1.</li>
	<li>Incubar os slides durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz.</li>
	<li>Armazene a 4 °C, protegido da luz até a microscopia confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+synovium%2C+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li>
<li>Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+articular+cartilage+defects%3A+Focus+on+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li>
<li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).</li>
<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li>
<li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li>
<li>Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).</li>
<li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li>
<li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li>
<li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li>
<li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).</li>
<li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).</li>
<li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).</li>
<li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).</li>
<li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA%2C+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).</li>
<li>de Miguel Pérez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%2C+intracellular+sorting%2C+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li>
<li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+Current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029(2015).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li>
<li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li>
<li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo <sup cla...

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular1. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA4. As terapias baseadas em células são restritas principalmente devido ao número limitado de condrócitos fenotipicamente estáveis ou chondroprogenitors capazes de reparar efetivamente a cartilagem3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da doença e regenerar grandes lesões de cartilagem é de suma importância.
Vesículos extracelulares (EVs) têm sido sugeridos como um tratamento para OA por diferentes autores5,6. Os EVs são corpos membranous secretados pela maioria dos tipos de células, estão envolvidos na sinalização intercelular, e têm sido mostrados para exercer os efeitos terapêuticos das células-tronco7,8,9, devido ao qual recentemente despertaram interesse em medicina regenerativa10. Os EVs derivados de células estromais mesenquimais (MSCs) são os principais EVs terapêuticos investigados para OA, embora outras células relacionadas à articulação tenham sido usadas como fontes de EV, por exemplo, condroprogenitors ou células imunes11,12.
Concentrados plaquetas, como plaquetas plaquetas (PLs), são usados para melhorar a cicatrização de feridas em diferentes lesões, como úlceras córneas13,14,15 ou na regeneração do tecido tendinoso16,devido à hipótese de que o componente EV dos concentrados plaquetas pode ser responsável por esses efeitos17 . Alguns estudos relacionados a doenças relacionadas à articulação utilizam EVs derivados de plaquetas (PL-EVs) como tratamento para amenizar as condições osteoartríticas. Os PL-EVs melhoram a proliferação de condrocitos e a migração celular ativando a via Wnt/β-catenin18, promovendo a expressão de marcadores condrogênicos em condrócitos osteoartréticos19, ou mostrando níveis mais elevados de proteínas condrogênicas e menos anormalidades tissulares em coelhos osteoartrrápticos tratados com PL-EVs18.
Os EVs contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que são liberados para a célula-alvo, estabelecendo a comunicação célula-célula, que é a principal característica relacionada às suas aplicações terapêuticas20. Os efeitos dos EVs dependem de suas células de alcance e posterior liberação de carga. Esse efeito pode ser confirmado indiretamente por alterações causadas nas células, como atividade metabólica ou modificação da expressão genética. No entanto, esses métodos não permitem a visualização de como os EVs chegam às células para exercer sua função. Assim, este artigo apresenta um método para rotular esses EVs derivados de PL para serem utilizados como tratamento para explantas de cartilagem OA orientadas por inflamação. A microscopia confocal foi utilizada para monitorar a absorção e progressão de EV para os condrócitos presentes nas explantas em um lapso de tempo de 5h.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo de centrífuga</td><td>SPL ciências da vida</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringa BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Preparado a 20% com água Milli-Q</td></tr><tr><td>96 poços placa de cultura</td><td>SPL ciências da vida</td><td></td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>Etanol absoluto Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>Usado para preparar etanol de 96% e 75% com água Milli-Q</td></tr><tr><td>Punção de biópsia com êmbolo 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino&nbsp; Albumina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Preparado a 5% com</td></tr><tr><td>explantes de cartilagem</td> PBS <td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de concentração 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de concentração 500 &micro; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX meio</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Blocos de tecido de parafina embutidos</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td>Taxa de serviço</td></tr><tr><td>Colunas mini-HD Exo-spin</td><td>Sistemas de orientação celular</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro; m filtro de seringa</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield com DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>Prepare uma solução estoque para uma concentração final de 0,1 &micro; g/&micro; L diluído em PBS-0,1% BSA</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>Preparado a 4% com PBS e armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit de Ligação de Células Fluorescentes Vermelhas para Rotulagem Geral de Membranas Celulares</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 e Dliuent C incluído</td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alfa;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA-005</td><td>Preparar uma solução estoque para uma concentração final de 0,01 &micro; g/&micro; L diluído em PBS-0,1% BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Usado para preparar uma solução de citrato de sódio a 0,1% Triton-0,1% com água Milli-Q</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 rotor</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Dispositivo Malvern</td><td>NS300</td><td>com laser embutido em &lambda;= 532 nm e câmera sCMOS</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>microscópio</tr><tr><td>confocal A78100101 TCS-SPE</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em explants de cartilagem

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.

Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas é usada para calcular...

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Este protocolo simples permite rotular EVs e monitorá-los através de microscopia confocal. Por exemplo, a imagem EV pode ajudar na avaliação da distribuição de EV ao usá-la na terapêutica. Esta técnica permite monitorar a migração e a absorção de EV facilmente em explants de cartilagem, com microscopia confocal sem qualquer função especial.O mesmo protocolo pode ser usado para EVs para experimentos in vitro ou in vivo. Certifique-se de que as colunas sejam preparadas com antecedência, e que o volume inicial de EVs seja suficiente para atingir a concentração final de partículas desejada, considerando que cerca de 10% das partículas serão perdidas durante a etapa de purificação. Comece concentrando a vesícula extracelular, ou EV, amostra e o controle.Coloque as amostras em um tubo concentrador de 15 mililitros ou 500 microliters, dependendo do volume inicial da amostra de EV. Centrifugar os tubos de acordo com as instruções do fabricante até que uma amostra quase seca seja obtida. Suspenda as amostras concentradas de EV com 200 microlitres, e o grupo controle com 100 microlitres de C diluído, e transfira-as para novos tubos de centrífugas de 1,5 mililitro.Separe a amostra de EV em duas alíquotas de 100 microliters cada. Marque uma das alíquotas com corante e use-a como tratamento. Deixe o outro sem identificação, mas processe-o como a amostra EV, e use-a para quantificar a concentração de EV por análise de rastreamento de nanopartículas.Prepare a solução de corante 2x de modo que a concentração resultante da solução PKH26 em C diluído seja de oito micromolar. Misture um microliter de um divisor PKH26 por 125 microlitres de C diluído na amostra. Prepare o volume necessário para adicionar às amostras em uma proporção de 1:1.Adicione a solução de corante 2x aos EVs derivados de plaquetas PKH e controle amostras em uma proporção de 1:1, para atingir 1x de concentração de corante, e quatro concentrações de PKH26 micromolar. Adicione o mesmo volume de PBS à amostra de EV derivada da plaqueta NTA. Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.Adicione 5% de solução de albumina-PBS de soro bovino às amostras em uma proporção de 1:1, e certifique-se de que o volume final seja de aproximadamente 400 microliters. Prossiga para separar os EVs rotulados das interações de corante não vinculado e corante não específico com a coluna. Remova a tampa da coluna, adicione 400 microliters de EVs derivados de plaquetas PKH, EVs derivados de plaquetas NTA ou controle e descarte todo o líquido elucido.Aguarde que a amostra entre completamente na coluna antes de prosseguir para o próximo passo. Adicione 600 microliters de PBS e descarte todo o líquido elucido. Aguarde que o PBS entre completamente na coluna antes de prosseguir para a próxima etapa.Adicione 600 microliters de PBS e colete uma fração de 600 microliters em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Para uma nova coluna, repita as etapas envolvendo a concentração das amostras mencionadas no início do protocolo. Adicione 600 microliters de EVs previamente elucidos à coluna e descarte o volume elucido.Em seguida, adicione 400 microliters de PBS e descarte todos os volumes elucidos. Adicione 600 microliters de PBS à coluna e colete uma fração de 600 microliters em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave a cartilagem duas vezes com PBS e extive-a usando um soco de biópsia de três milímetros de diâmetro em condições estéreis.Coloque as explantas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEM-F12, suplementada com estreptomicina de penicilina de 1%a 37 graus Celsius, 5%CO2 e 80% de umidade. Para estabelecer um modelo de OA orientado pela inflamação, suplementar o meio de cultura celular com 10 nanogramas por mililitro de oncostatina M e dois nanogramas por mililitro de fator de necrose tumoral-alfa. Trate as explantas com 1 vezes 10 a 900 por poço de EVs derivados de plaquetas PKH, ou controle, em meio de cultura celular suplementado com oncostatina M e fator de necrose tumoral-alfa.Remova o meio das placas de cultura celular de 96 poços contendo explants de cartilagem. Adicione 200 microliters do meio de cultura celular a cada poço descrito no manuscrito. Pare o ensaio in vitro a cada hora de zero a cinco horas.Lave os poços de cultura celular contendo as explantas de cartilagem duas vezes com 200 microliters de PBS. Adicione 100 microlitadores de 4%de paraformaldeído ao tecido para corrigi-lo por três horas a quatro graus Celsius. Remova o PFA, adicione 100 microliters de PBS, armazene o tecido fixo a quatro graus Celsius e processe as amostras dentro de 48 horas.Imagens tiradas em diferentes pontos de tempo mostram como os EVs entram no tecido até chegarem aos condrócitos, e entram nos condrócitos ao longo do tempo. Os EVs rotulados já estavam localizados em torno de condrócitos após uma hora de incubação. Certifique-se de que o volume inicial de EVs é suficiente para atingir a concentração final de partículas desejada.Outra coisa importante a se lembrar é usar os EVs rotulados nas próximas 24 horas. Se não usá-lo dentro de 24 horas, pode ocorrer uma diminuição da fluorescência. Essa técnica ajudará os pesquisadores a melhorar a imagem EV e a estudar EVs em biologia e terapêutica.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para visualizar e quantificar a captação celular de vesículas extracelulares ou EVs. Este ensaio utiliza imagens fluorescentes 3D usando um microscópio confocal e permite distinguir EVs internalizados daqueles aderidos à superfície celular.

Ensaio de captação de vesículas extracelulares: um método para visualizar e quantificar a captação celular de vesículas extracelulares usando a técnica de imagem de fluorescência 3D

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho completo para isolamento rápido das vesículas extracelulares de sangue total humano e caracterização de marcadores específicos pela análise de controle de nanopartículas baseada em fluorescência. Os resultados apresentados mostram um elevado nível de reprodutibilidade e podem ser ajustados para sobrenadantes de cultura de células.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.

Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D

Descrevemos um protocolo para rotular pequenas vesículas extracelulares derivadas do macrófago com corantes PKH e observar sua absorção in vitro e na medula espinhal após a entrega intratecal.

Absorção de Vesículos Extracelulares Fluorescentes Em Vitro e na Medula Espinhal

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Aprenda a rotular vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetário para monitorar migração e absorção em explantes de cartilagem usando microscopia confocal. Este protocolo simplifica o estudo de vesículas em osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

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