Funcionalização vesícula extracelular derivada de plaquetas de implantes ti
5 de agosto de 2021
Aqui, apresentamos um método para o isolamento de Vesículas Extracelulares (EVs) derivados das plaquetas (PL) e seu uso para revestimento de superfícies de implante de titânio (Ti). Descrevemos o método de revestimento de fundição de gota, o perfil de liberação de EVs das superfícies e a biocompatibilidade in vitro de superfícies Ti revestidas de EVs.
A combinação de vesículas extracelulares com biomateriais é uma abordagem desejável para estudos de medicina regenerativa. Assim, este estudo relata a funcionalização de titânio com EVs como ferramenta prática para ortopedia e regeneração óssea. A funcionalização do fundição de gota é um método fácil e de baixo custo comparado com outras estratégias, como armadilha polimérica ou ligação bioquímica.
Inicie a funcionalidade da superfície de titânio lavando os discos de titânio com água deionizada em um copo de vidro. Em seguida, descarte a água antes de lavar os discos com 70% de etanol. Decante a solução para sonicar os implantes lavados a 50 C por cinco minutos em água deionizada.
Depois de descartar a água incubar implantes de titânio em uma solução de hidróxido de sódio de 40% a 50 C por 10 minutos com agitação e, em seguida, sonicar os implantes em água desionizada como demonstrado. Em seguida, realize pelo menos cinco lavagens dos implantes com água desionizada. Até que o pH seja neutro no indicador pH.
Repita o processo de sônica e incubação, como explicado anteriormente, substituindo o hidróxido de sódio por ácido 50%. Realizar as lavagens e sônica com água deionizada antes de armazenar os implantes em uma solução de 70% de etanol. Incubar os implantes de titânio em uma solução de ácido nítrico de 30% por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
Após a incubação realizar pelo menos cinco lavagens com água desionizada até que o pH seja neutro em indicadores de pH. Em seguida, incubar implantes de titânio durante a noite em temperatura ambiente em água deionizada. No dia seguinte, seque os implantes sob vácuo a 40 C por 10 minutos.
Trabalhando sob o armário de cultura celular, coloque implantes de titânio em uma placa de 96 poços com o lado da máquina voltado para cima. Organize para os EVs de vesículas extracelulares soltarem a fundição descongelando a solução de EVs e a solução de vórtice a um pulso de três segundos. Após a mistura, deposite 40 microliters da solução EVs na superfície de titânio para imobilizar um máximo de 4 x 10^11 EVs por implante, de acordo com a concentração determinada pela análise de rastreamento de nanopartículas.
Em seguida, coloque as placas em condições de vácuo a 37 C por aproximadamente duas horas ou até que as gotas estejam completamente secas. Ajuste o tempo de secagem dependendo do número de implantes de titânio e da água presente na câmara de vácuo. A quantidade de EVs liberados de discos de titânio foi medida pela análise de rastreamento de nanopartículas.
No dia 2, cerca de 10^9 EVs foram lançados, seguidos de um lançamento sustentado nos dias 6, 10 e 14. A biocompatibilidade in vitro celular dos EVs de titânio foi avaliada com lactato desidrogenase, ou ensaio de liberação de LDH, a 48 horas após a semeadura celular nos implantes. Os EVs de titânio apresentaram uma quantidade menor de LDH do que o valor citotóxico máximo aceito.
Considerando que o grupo de controle de titânio apresentou níveis mais elevados de atividade LDH. O passo mais importante é a secagem a vácuo do implante revestido. É importante ter certeza de que toda a água é evaporada para obter a fissuração ideal.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para o isolamento de Vesículas Extracelulares (EVs) de lisados plaquetários e sua aplicação no revestimento de superfícies de implantes de titânio. O foco está no método de deposição por gota para funcionalização, no perfil de liberação das EVs e na biocompatibilidade das superfícies revestidas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Medicina Regenerativa
- Ortopedia
- Biomateriais
Antecedentes
- As vesículas extracelulares são importantes na medicina regenerativa.
- O revestimento de biomateriais com VEs pode aumentar sua funcionalidade.
- O titânio é comumente utilizado em implantes ortopédicos.
- Os métodos de funcionalização variam em complexidade e custo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método prático para funcionalização de superfícies de titânio.
- Avaliar a biocompatibilidade de superfícies de titânio revestidas com vesículas extracelulares (EV).
- Fornecer uma alternativa economicamente viável às técnicas existentes de funcionalização.
Métodos Utilizados
- Isolamento de EVs de lisados de plaquetas.
- Método de deposição por gotejamento para revestimento de superfícies de titânio.
- Limpeza de discos de titânio com água desionizada e etanol.
- Sonicação de implantes para melhorar a preparação da superfície.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de EVs a partir de lisados de plaquetas.
- Revestimento eficaz de superfícies de titânio utilizando o método de deposição por gota.
- Perfil de liberação demonstrado de EVs a partir de superfícies revestidas.
- A biocompatibilidade in vitro de superfícies de titânio revestidas com EVs foi confirmada.
Conclusões
- O método de deposição por gotejamento é uma abordagem viável para a funcionalização de titânio.
- As superfícies de titânio revestidas com EV mostram potencial para aplicações ortopédicas.
- Este método oferece uma alternativa de baixo custo para a funcionalização de biomateriais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a funcionalização de implantes de titânio com vesículas extracelulares derivadas de plaquetas de forma de baixo custo e escalável, a fim de aumentar o potencial osteogênico em aplicações ortopédicas. Ao melhorar a bioatividade do biomaterial por meio da sinalização mediada por vesículas extracelulares (EV), ele apoia a validação precoce de alvos em estratégias de regeneração óssea. A abordagem oferece uma plataforma reprodutível para reduzir os riscos no desenvolvimento pré-clínico de terapias regenerativas baseadas em implantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de sinalização osteogênica mediadas por EVs em superfícies de biomateriais.
- Valor Operacional: Oferece um método padronizado e de baixo custo para o preparo de superfícies de implantes bioativas destinadas à triagem funcional.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera perfis quantificáveis de liberação de EVs mensuráveis por análise de rastreamento de nanopartículas para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Permite revestimento superficial reprodutível por meio de deposição por gotejamento, possibilitando avaliação consistente de compostos ou biomateriais in vitro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra liberação sustentada de VE por até 14 dias, favorecendo sinalização bioativa prolongada em modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Confirma biocompatibilidade por meio do ensaio de LDH, reduzindo o risco de citotoxicidade na avaliação inicial de implantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere na sequência de descoberta a pré-clínico ao permitir a preparação de superfícies para triagem bioativa, desenvolvimento de ensaios e validação de implantes em processos de regeneração óssea.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos osteogênicos induzidos por EVs em substratos de titânio.
- Triagem: Permite o revestimento padronizado e reprodutível de implantes para avaliação consistente de compostos bioativos ou vesículas.
- Análises: Fornece dados quantitativos de liberação de EVs por meio de rastreamento de nanopartículas e indicadores de biocompatibilidade por ensaio de LDH.
- Pesquisa Translacional: Conecta a funcionalização de EVs em fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de dados de liberação sustentada e biocompatibilidade.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e de baixo custo para funcionalização de implantes à base de titânio em diversos programas de medicina regenerativa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao validar a atividade osteoindutiva mediada por EVs em superfícies de implantes.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de lavagem, sonicação e secagem a vácuo.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios tardios ao permitir a avaliação precoce da biocompatibilidade e bioatividade do implante.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de avançar/não avançar ajustadas ao risco nos processos de desenvolvimento de biomateriais ortopédicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na isolamento de vesículas extracelulares e na análise de rastreamento de nanopartículas.
- Depende do acesso a equipamentos de secagem a vácuo e ao monitoramento de pH para a preparação da superfície.
- Necessita da padronização da concentração de vesículas extracelulares e do volume das gotas entre os lotes de produção.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes geometrias e áreas superficiais de implantes de titânio.
- Limitado pela necessidade de manipulação asséptica durante as etapas de deposição e secagem das vesículas extracelulares.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Titanium Discs Wash
1:43
Titinium Passivation and Extracellular Vesicles (EVs) Drop Casting
3:04
Results: Accumulative EV Release of Titanium Functionalized Surfaces and In Vitro Cell Biocompatibility of Titanium-EVs
3:50
Conclusion
