Name: Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a analisar produtos de clivagem de TGF-beta na blastocéle de embriões Xenopus laevis. Este protocolo rápido permite isolar proteínas Bmp4 e Bmp7 para estudo de formação de heterodímeros.

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Agradecemos a Mary Sanchez pelo excelente cuidado com os animais. A pesquisa dos autores é apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH/NICHD) que concede R01HD067473-08 e R21 HD102668-01 e pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK/NIH) doação R01DK128068-01.

Todos os procedimentos descritos são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Utah. Os sapos estão alojados em uma instalação aprovada pela IACUC. Sapos machos são eutanizados pela imersão em tricaine seguindo cortando o ventrículo do coração. As sapos fêmeas são alojadas em laboratório por um máximo de 24 horas após a indução hormonal da desova para permitir a coleta de óvulos e depois devolvidas ao centro de cuidados.
1. Coleção de X. laevis Testes
<ol><li>Anestesiar um macho sexualmente maduro em 0,2% tricaine(Tabela 1) por 30-40 min até que o animal não responda ao aperto de garras.</li>
	<li>Use fórceps sem cortes para afastar a pele da parede do corpo. Faça uma incisão horizontal na pele através do abdômen inferior usando uma tesoura cirúrgica. Faça uma incisão paralela na parede do corpo subjacente, e então uma terceira incisão perpendicular através da parede do corpo através da caixa torácica.<ol>
<li>Dobre os retalhos resultantes, localize o ventrículo do coração e corte a base para exsanguinar e garantir a morte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire os corpos de gordura amarelas do abdômen com fórceps sem cortes e localize os testículos de cada lado, subjacentes à base dos corpos gordos. Remova cada teste cortando-o dos corpos de gordura e de todas as vísceras presas usando uma tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Transfira testículos para uma placa de Petri contendo 1x Solução de Barth Modificada (MBS) (Tabela 1). Enxágüe e remova quaisquer vasos sanguíneos aderentes ou vísceras anexadas.<ol>
<li>Transfira um teste para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão de testículo(Tabela 1) para uso imediato e armazene o outro em um tubo cônico de 10 mL preenchido com tampão de testis para uso posterior. Os testis devem ser armazenados a 4 °C quando não forem utilizados e permanecerão viáveis por pelo menos duas semanas. NOTA: Fotografias de isolamento de testículos podem ser encontradas na Referência 15.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coleta e Fertilização de Ovos X. laevis
NOTA: Os sapos devem ser manuseados com luvas de vinil ou mãos lavadas antes e depois de manusear os sapos. Luvas de látex, loções e resíduos de detergente nas mãos humanas danificarão a pele frágil dos sapos.
<ol><li>Na noite anterior à desova, injete 0,3 mL (1200 UI) de gonadotropina coriônica humana(Tabela 1) no saco linfático dorsal de duas ou três fêmeas X. laevis maduras usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 26 G. Use uma agulha nova para cada injeção.</li>
	<li>Após a injeção, coloque as fêmeas em um recipiente selado (não com ar apertado) em uma incubadora biológica de 18 °C. A desova geralmente começa 14-16 h depois. NOTA: Gavetas de plástico ou recipientes plásticos com orifícios de ar cortados na tampa funcionam bem para segurar as fêmeas durante a noite. Certifique-se de que a tampa está firmemente ligada para evitar que os sapos escapem e dessecam na incubadora.</li>
	<li>Segure a fêmea sobre uma placa de Petri de 100 mm contendo 1x MBS e aplique pressão suave no abdômen do sapo para expulsar ovos no prato.</li>
	<li>Corte um pequeno pedaço do testis (~1/5) usando uma lâmina de barbear e transfira-a para um tubo de 1,5 mL contendo ~500 μL de 1x MBS. Esmague com um pilão de pelota ou homogeneizador de tecido. Armazene a suspensão resultante do esperma no gelo ou a 4 °C para fertilização subsequente no mesmo dia.</li>
	<li>Incline a placa de Petri de 100 mm para derramar o máximo possível de 1x MBS e remova o restante usando uma pipeta de transferência de plástico. Aplique aproximadamente 100 μL de suspensão de esperma, adicione cerca de 1 mL de 0,1x MBS e gire para misturar.<ol>
<li>Depois de 5 min, inunde o prato com água da torneira descalorada ou 0,1x MBS e deixe ficar por 30 minutos. NOTA: A água pode ser desclolorada usando um filtro ou a água da torneira municipal pode ser deixada de pé por pelo menos 24 horas para permitir que o cloro se dissipe em regiões onde o cloro convencional é adicionado à água. Em áreas onde a clororamina é adicionada para desinfetar a água potável, a água deve, em vez disso, ser tratada com um condicionador comercialmente disponível que pode quebrar a cloromina. NOTA: Os ovos são coletados em uma solução de sal alto (1x MBS) para evitar a formação de uma camada de geleia, o que proporcionaria uma barreira à fertilização. Após a fertilização, a solução de baixo sal (água descalorada ou 0,1x MBS) permite a formação de jaleco e os ovos aderirão uns aos outros e ao prato. Os ovos fertilizados irão girar de tal forma que o polo animal pigmentado enfrente para cima dentro de 30 minutos. Se isso não acontecer, e os óvulos parecerem saudáveis sob o microscópio, a viabilidade do esperma é suspeita e pode ser necessário colher novos testículos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Despeje a solução que cobre os ovos e encha a placa de Petri com solução de cisteína recém-preparada(Tabela 1). Gire a solução no prato por 3-5 min até que a camada de geleia seja dissolvida e os ovos não estejam mais grudados um no outro ou no prato.<ol>
<li>Incline o prato e despeje cuidadosamente a solução de cisteína, ou remova com uma pipeta de plástico. Substitua por 1x água da lagoa de DeBoer(Tabela 1). Redemoinho para enxaguar e decantar.</li>
		<li>Repita uma lavagem com a solução de DeBoer, uma com 0,1x MBS e rechee o prato com 0,1x MBS. Depois de remover a camada de geleia, os ovos ficam mais frágeis e não devem ser expostos à interface ar-líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mova os óvulos fertilizados para uma incubadora biológica de 16 °C ou deixe-os no banco à temperatura ambiente. Se deixado à temperatura ambiente, o primeiro decote ocorrerá 1-1,5 h após a fertilização, e os decotes subsequentes ocorrerão aproximadamente a cada 30 minutos. Em contrapartida, se os embriões forem incubados a 15-16 °C, os decotes ocorrerão aproximadamente a cada hora e será possível injetar um número maior de embriões de uma determinada desova.</li>
</ol>3. Microinjeção de Embriões X. laevis
<ol><li>Aqueça e puxe capilares de vidro para um ponto fino usando um puxador de micropipette com as seguintes configurações: Tração de duas etapas; Calor 1: 67,4 °C; Calor 2: 62 °C. NOTA: Estas configurações são específicas para o puxador de micropipette e capilares de vidro utilizados aqui(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando, corte a ponta de uma agulha puxada perto do final usando fórceps Dumont #5. A agulha deve ser afiada, mas não tão fina que a ponta se dobra quando entra em contato com o embrião. A Figura 1 mostra um exemplo de uma agulha apropriadamente puxada que não foi cortada para microinjeção (A) e uma que foi cortada (B).</li>
	<li>Insira a agulha em um suporte de agulha conectado a um microinjetor. Coloque o suporte da agulha em um micromanípulo. Coloque 2-4 μL de RNA sintético tampado codificando a proteína precursora de Tgfß para ser analisada em um pequeno pedaço de parafilme sob um microscópio dissecando.<ol>
<li>Usando o micromanipulador, abaixe a agulha na gota e use a função de preenchimento no microinjetor para aspirar RNA na agulha. Certifique-se de manter a agulha abaixo da superfície da gota, e observar o progresso sob o microscópio para evitar aspirar ar na agulha. NOTA: Se os anticorpos que reconhecem o domínio prodomínio e/ou ligante do precursor de Tgfß a serem analisados não estiverem disponíveis, a sequência de codificação de uma tag de epitope (por exemplo, V5, myc, Flag) pode ser inserida no quadro cDNA que será usado como modelo para transcrição de RNA. A bioatividade in vivo da proteína marcada deve ser comparada com a de proteína não marcada para garantir que o epítope não interfira com a dobra adequada, o decote ou a atividade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejete uma gota da solução RNA no ar e meça o tamanho da gota usando um micrômetro montado no estágio de injeção ou na ocular do microscópio. Ajuste o tamanho da gota para aproximadamente 10 nL utilizando os controles de tempo e pressão no microinjetor. NOTA: As concentrações de RNA na faixa de 5-20 ng/μL são apropriadas para fornecer 50-200 pg de RNA em cada embrião. Essa quantidade de RNA é geralmente suficiente para detectar produtos de decote em aspirados de 10-20 embriões. É melhor apontar para a menor dose de RNA que dá um sinal detectável em imunoblots. Maiores quantidades de RNA podem causar defeitos gastrulatórios, que interferem na expansão da blastocoele.</li>
	<li>Mova os embriões para um prato de injeção ou bandeja contendo 5% de Ficoll em 0,1x MBS(Tabela 1) quando chegarem ao estágio celular 2-4. Uma placa de Petri de 35 mm equipada com um pedaço de malha de nylon na parte inferior pode servir como uma placa de injeção barata que manterá os embriões imobilizados. Insira a agulha perto do polo animal e injete 10 nL de RNA em uma célula de cada embrião. NOTA: Os embriões podem ser facilmente injetados a qualquer momento entre os estágios de uma e 16 células. Injetar o embrião depois de ter cortado garante que o óvulo foi fertilizado e que o embrião é saudável. A localização exata da injeção não é essencial. Uma descrição mais detalhada da desova, cultura e microinjeção de RNAs em embriões X. laevis pode ser encontrada na Referência 15.</li>
	<li>Transfira os embriões injetados em uma placa de Petri de 35 mm preenchida com 5% de Ficoll em 0,1x MBS(Tabela 1). Coloque as pequenas placas dentro de uma placa de Petri de 150 mm e cubra livremente com uma tampa para evitar que a mídia cultural evapore. Cultura os embriões durante a noite em 15-16 °C. NOTA: A colheita de embriões em Ficoll ajuda a curar o local da injeção. Se forem utilizadas agulhas finas, o cultivo em 2-3% ficoll é suficiente, enquanto 5% ficoll é preferido se o dano aparente for observado. Manter os embriões na solução Ficoll por 1-2 h após a injeção é suficiente para ajudar na cura, mas a incubação noturna não danifica o embrião desde que a solução seja alterada antes do início da gastrulação.</li>
</ol>4. Extração e Análise de Blastocoele de produtos de decote Tgfß
<ol><li>Na manhã seguinte após a injeção, remova a solução Ficoll e remova os embriões mortos ou moribundos. Enxágüe os embriões uma ou duas vezes com 0,1x MBS e cultue os embriões em 0,1x MBS no banco à temperatura ambiente. NOTA: Os embriões também podem ser devolvidos à incubadora biológica de 16 °C para retardar o desenvolvimento.</li>
	<li>Aqueça e puxe capilares de vidro para um ponto fino usando um puxador de micropipette com as seguintes configurações: Tração de dois passos; Calor 1: 67,4 °C; Calor 2: 62 °C. NOTA: Estas configurações são específicas para o puxador e capilar de vidro usado aqui (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando, corte a ponta de uma agulha puxada usando fórceps. Para evitar entupimento, a abertura de uma agulha usada para aspiração blastocoele deve ser maior do que em uma agulha usada para microinjeção. Um exemplo de uma boa agulha puxada e recorada para ser usada para aspiração blastocoele é mostrado na Figura 1C. Insira a agulha de aspiração no suporte da agulha conectada a um microinjetor e conecte o suporte da agulha a um micromanipulador. NOTA: O diâmetro ideal da agulha é determinado empiricamente por tentativa e erro. Agulhas com um grande diâmetro enchem muito rapidamente e tornam mais provável que detritos celulares entrem na agulha. Em contraste, agulhas de diâmetro muito pequeno provavelmente ficam entupidas. Uma vez que uma agulha apropriada é gerada, é útil gerar múltiplas agulhas cortadas na mesma posição.</li>
	<li>Coloque embriões em uma bandeja de injeção ou prato recheado com 0,1x MBS quando chegarem cedo ao estágio gastrula médio (estágio 10-11).</li>
	<li>Insira a agulha abaixo da superfície do embrião perto do polo animal. Pressione o botão de preenchimento no microinjetor enquanto olha através do microscópio dissecando para manter um olho na agulha e no embrião. Ao longo de alguns segundos, o nível de fluido claro aumentará na agulha e o embrião entrará em colapso e se tornará côncavo.<ol>
<li>Se a matéria branca turva entrar na agulha, solte o botão de preenchimento e pulso o botão de injeção uma ou mais vezes para ejetar qualquer matéria nublada, que consiste em detritos celulares que provavelmente contêm proteases. NOTA: Se a blastocoele entrar em colapso e os detritos celulares entrarem na agulha assim que o botão de preenchimento for pressionado, isso indica que a abertura na agulha é muito grande. Se a blastocoele não entrar em colapso, mas a matéria branca entra na agulha imediatamente, isso mostra que a agulha foi inserida muito profundamente e está tocando o chão blastocoele. Ejete a matéria branca, e passe para o próximo embrião. A taxa de aspiração pode ser mais cuidadosamente controlada pulsando o botão de preenchimento em vez de pressioná-lo continuamente. Isso é particularmente importante se a abertura na agulha for maior do que a ideal.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita o passo 4.5 até que o fluido tenha sido aspirado a partir da blastocoele de 10-20 embriões. NOTA: Geralmente, o fluido blastocoele aspirado de 10-20 embriões é suficiente para detectar produtos de decote em imunoblots. No entanto, isso pode variar dependendo da qualidade do anticorpo e deve ser determinado empiricamente.</li>
	<li>Coloque um pedaço de parafina na bandeja de injeção e pipeta 1 μL de água sem nuclease sobre ele. Submergir a agulha sob a gota de água e pressione o botão de injeção para dissipar o fluido blastocoele na água.<ol>
<li>Alternativamente, ejete o fluido diretamente no parafilme, mas neste caso, pulso o botão de injeção em vez de segurá-lo para baixo. Isso expulsa o fluido sob menor pressão, impedindo-o de achatamento no parafilme, dificultando a elaboração em uma pipeta.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira o fluido blastocoele para um tubo de microcentrífuga estéril no gelo. Espere colher aproximadamente 0,3-0,5 μL de fluido blastocoele por embrião. Adicione água sem nuclease para ajustar o volume final a 30 μL.</li>
	<li>Transfira os embriões esgotados por fluido blastocoele para um tubo separado no gelo. Remova o excesso de 0,1x MBS e adicione 200 μL de tampão de embrião refrigerado (4 °C) (10 μL por embrião)(Tabela 1). Pipeta os embriões para cima e para baixo 10-20 vezes usando uma micropipette até que eles estejam totalmente homogeneizados e nenhum aglomerado permaneça.</li>
	<li>Centrifugar os embriões homogeneizados em uma microcentrifuuagem refrigerada a 10.000 x g por 10 min. Remova 160 μL do supernante usando uma pipeta P200 e transfira para um novo tubo no gelo, tomando cuidado para evitar as proteínas da gema branca e outros detritos celulares na metade inferior do tubo.<ol>
<li>Repita a microcentrifugação uma vez e transfira 128 μL do supernatante claro para um novo tubo no gelo. Neste ponto, os lises de embrião limpos e o fluido blastocoele podem ser armazenados a -80 °C pelo tempo desejado. NOTA: Com algumas exceções, as proteínas precursoras de Tgfß não são secretadas na blastocoele e só serão detectadas nos lises embriões empobrecidos. Em contraste, os produtos de decote da família Tgfß são vistos principalmente no fluido blastocoele. É útil para colher e analisar tanto os licosatos embrionários quanto o fluido blastocoele para a maioria dos propósitos. No mínimo, isso fornece um controle positivo para garantir que o precursor seja robustamente traduzido e estável. Além disso, permite comparar proporções relativas de produtos de decote com precursores entre diferentes tipos selvagens ou proteínas mutantes, identificar mutações que permitem que precursores intactos sejam secretados em fluido blastocoele (por exemplo, mutações dentro do motivo de consenso do PC que permitem dobrar e secreção adequada sem decote, nesse caso o precursor intacto é detectado tanto no embrião quanto no fluido blastocoele) ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram desdobrados, proteínas não cleaváveis (nesse caso, o precursor será detectado no lise embrião, mas os produtos de decote estarão ausentes no fluido blastocoele).</li>
	</ol></li>
	<li>Proteínas deglycosilato presentes no fluido blastocoele com PNGase F neste momento, seguindo as instruções do fabricante. NOTA Não há necessidade de desglicar as proteínas precursoras presentes no lise embrionário, uma vez que representam reguloso endoplasmático (ER)--formas residentes do precursor que não possuem os complexos oligossacarídeos ligados ao N removidos pela PNGase F. Em contrapartida, os produtos de decote presentes no fluido blastocoele passaram pela rede trans-Golgi (TGN) onde os carboidratos são modificados e agora podem ser removidos pela PNGase F. Após a deglycosylation, os produtos de decote migram como uma banda mais fortemente condensada em géis SDS, o que pode ajudar na visualização, quantificação e identificação precisa de produtos de decote. Isso não é estritamente necessário, mas pode ser útil, por exemplo, se você está tentando distinguir entre homodimers e heterodimers com base em padrões de migração ou se um produto de decote contém carboidratos heterogêneos que fazem com que ele migrem como uma banda ampla e difusa.</li>
	<li>Adicione 5 μL de redução de 4x tampão de amostra(Tabela 1) a 15 μL de fluido blastocoele e 15 μL de lise de embrião esclarecido. Adicione 5 μL de tampão de amostra 4x não redutor(Tabela 1) aos 15 μL restantes do fluido blastocoele. Aqueça a 100 °C por 5 min e coloque no gelo. NOTA: Analisar proteínas em condições não redutoras é essencial para analisar a formação de ligantes homodimericos ou heterodimericos, mas não é necessário se analisar apenas locais de decote ou níveis de proteínas cortadas. Com algumas exceções, fragmentos de prodomínio são secretados como monômeros. Além disso, as proteínas precursoras presentes no lisenato embrionário são desdobradas principalmente, monômeros residentes do ER. Assim, não há necessidade de analisar esses produtos em condições não redutoras.</li>
	<li>Resolva proteínas precursoras e produtos de decote por eletroforese em 15% de Géis SDS/poliacrilamida.</li>
	<li>Transfira proteínas do gel para uma membrana PVDF usando transferência eletroforética.</li>
	<li>Incubar membranas com anticorpos apropriados que reconhecem o prodomínio e o domínio de ligantes (ou tags de epítope inseridas nesses domínios), lave e incuba com anticorpos secundários adequados. Visualize proteínas com chemiluminescência ou imagem fluorescente.</li>
</ol>

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<li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li>
<li>Sopory, S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSopory%2C+S+%22Analysis+of+Growth+Factor+Signaling+in+Embryos%22">Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos</a>. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).</li>
<li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Activation+of+Bmps%3A+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li>
<li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As principais vantagens do protocolo descrito aqui são que ele pode ser concluído relativamente rapidamente, não requer reagentes caros e fornece uma fonte de produtos concentrados de decote Tgfß em condições fisiológicas. Outra vantagem é que permite analisar proteínas marcadas por epítope e, assim, contornar a escassez de anticorpos disponíveis comercialmente que reconhecem a maioria dos prodomínios da família Tgfß. Embora também seja possível analisar o decote das proteínas precursoras tgfß marcadas por epitope em cél...

Os membros da superfamília Fator de Crescimento Transformador ß (Tgfß) são sintetizados como proteínas precursoras inativas e dimerizadas. Os precursores são então cortados por membros da família proproteína convertase (PC), seja dentro da via secreta ou fora das células. Isso cria um mais fraco ligante ativo e ligado a dissulfeto e dois fragmentos de prodomínio1. Embora seja sabido há mais de 30 anos que o prodomínio dos precursores da família Tgfß é necessário para gerar um ligante ativo2, o entendimento de como os prodomínios contribuem para a função ligante é incompleto.
Embora o entendimento do processo de ativação proteolítica dos membros da família Tgfß permaneça incompleto, há um interesse crescente em entender quais motivos de consenso do PC são cleaved in vivo, se o decote ocorre em um compartimento subcelular específico ou extracelular, e se o prodomínio permanece covalentemente ou não covalentemente associado à ligadura3. Vários estudos têm demonstrado que o prodomínio não só guia a dobra de ligadura antes do decote4,5, mas também pode influenciar a estabilidade do fator de crescimento e a faixa de ação6,7,8,9, conduzir a formação de homodimers ou heterodimers10, ancorar o ligante na matriz extracelular para manter a latência de ligadura11, e em alguns casos, funcionar como um ligante em seu próprio direito de ativar heterologos sinalização12. Mutações heterozygous no prodomínio de muitos membros da família Tgfß estão associadas a olhos, ossos, rins, esqueléticos ou outros defeitos em humanos3. Esses achados destacam o papel crítico do prodomínio na geração e manutenção de um ligante ativo e ressaltam a importância de identificar e decifrar o papel dos produtos de decote desenvolvidos durante o amadurecimento proteolítico dos precursores da família Tgfß.
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para aspirar produtos de decote gerados durante a maturação de precursores da família Tgfß a partir da blastocoele de embriões X. laevis e, em seguida, analisá-los em imunoblots. Este protocolo pode ser usado para determinar se um ou mais motivos de consenso do PC em uma proteína precursora são cortados in vivo10,13, identificar os PC(s) endógenos que apertam cada motivo13,14, compare a formação in vivo de homodimers da família Tgfß versus heterodimers10 ou analise se mutações de pontos associadas a doenças humanas em precursores de Tgfß afetam sua capacidade de formar ligantes diméricos funcionais.

<table><tbody><tr><td>&szlig;-mercaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>AC125470100</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Fisher</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Cálcio</td><td>Fisher</td><td>C109-500</td><td></td></tr><tr><td>Pilão de Pellets Descartáveis / Moedor de Tecidos</td><td>Fisher</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 fórceps</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro, 1 X 90 mm</td><td>Narshige</td><td>G-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Coriônico humano gonadotrofina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de injeção, 1 mL</td><td>Fisher</td><td>8881501368</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Agulha, 26 G</td><td>Fisher</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor de Picoliter</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Narashige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>TRS5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr></tbody></table>

análise do fator de crescimento transformador ß produtos de decote familiar secretados na blastocoele de embriões xenopus laevis

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Os dois braços da superfamília Fator de Crescimento Transformador ß (Tgfß), representados por ligantes de proteína morfogenética Tgfß/Nodal ou Bone (Bmp), respectivamente, desempenham papéis essenciais no desenvolvimento embrionário e na homeostase adulta. Membros da família Tgfß são feitos como precursores inativos que escurecem e dobram dentro do ânticulo endoplasmático. O precursor é posteriormente cortado em fragmentos de ligante e prodomínio. Embora apenas o ligante dimeric possa engajar receptores Tgfß e ativar a sinalização a jusante, há um reconhecimento crescente de que a moiety prodomínio contribui para a atividade de ligante. Este artigo descreve um protocolo que pode ser usado para identificar produtos de decote gerados durante a ativação das proteínas precursoras de Tgfß. Os precursores de RNA são primeiro microinjetados em embriões X. laevis. No dia seguinte, os produtos de decote são coletados da blastocoele de embriões do estágio gastrula e analisados em manchas ocidentais. Este protocolo pode ser concluído relativamente rapidamente, não requer reagentes caros e fornece uma fonte de produtos concentrados de decote Tgfß em condições fisiológicas.

O objetivo do experimento descrito abaixo foi determinar se bmp4 e Bmp7 formam heterodimers (dimers compostos de um ligante Bmp4 e um ligante Bmp7), homodimers (compostos por dois ligantes Bmp4 ou dois Bmp7), ou uma mistura de cada um quando são co-expressos em X. laevis. Os dados apresentados na Figura 2 são extraídos de um estudo publicado anteriormente10. Figura 2A é um esquema que mostra produtos de decote gerados pela matura...

Quando as proteínas precursoras do Fator de Crescimento Transformador são expressas em embriões xenopus laevis, elas escurecem, são cortadas e são secretadas na blastocoele, que começa no final da blastula até o estágio gastrula inicial. Descrevemos um método para aspirar produtos de decote da cavidade blastocoele para análise de imunoblot.

Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Este protocolo pode ser usado para estudar o processo pelo qual uma gama mais ampla de proteínas precursoras segregadas, incluindo membros da família TGF-beta, são convertidas em proteínas ativas após o decote protelítico. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece métodos muito rápidos e baratos para obter um produto de decote TGF-beta altamente concentrado in vivo sob condição visualizada. Para começar, após a injeção no dia seguinte, remova a solução Ficoll e quaisquer embriões mortos ou moribundos, depois enxágue os embriões uma ou duas vezes com MBS e cultue os embriões em MBS no banco à temperatura ambiente ou a 16 graus Celsius na incubadora para retardar o desenvolvimento.Aqueça e puxe os capilares de vidro para um ponto fino usando um puxador de micropipette com as configurações desejadas. Usando fórceps, corte a ponta de uma agulha puxada. Para evitar entupimento, a abertura da agulha de aspiração blastocele deve ser maior do que a agulha de microinjeção.Insira a agulha de aspiração no suporte da agulha conectada ao microinjetor e conecte o suporte da agulha ao micromanipulador. Coloque embriões de estágio gastrula precoces e médios em uma bandeja ou prato de injeção preenchidos com MBS. Insira a agulha abaixo da superfície do embrião perto do polo animal.Pressione o botão de preenchimento no microinjetor enquanto observa a agulha e o embrião através de um microscópio de dissecação. Ao longo de alguns segundos, o nível de fluido claro sobe na agulha e o embrião entra em colapso e se torna côncavo. Pulso o botão de injeção uma ou mais vezes para ejetar qualquer matéria branca nublada que entre na agulha contendo detritos ou proteases.Para detectar os produtos de decote em imunoblots, aspire o fluido blastocele de 10 a 20 embriões ou mais, dependendo do anticorpo. Pipeta um microliter de água sem núcleo em uma peça de parafina colocada na bandeja de injeção. Submergir a agulha na gota d'água e pressione o botão de injeção para dissipar o fluido blastocele na água.Alternativamente, para ejetar o fluido diretamente no parafilme e evitar que ele se achate, pulso o botão de injeção para expulsar o fluido sob menor pressão. Transfira o fluido blastocele colhido para um tubo de microcentrifuuge estéril no gelo e adicione água sem núcleo para ajustar o volume final a 30 microliters. Para detectar proteínas precursoras TGF-beta, transfira os embriões esgotados do fluido blastocele para um tubo separado no gelo.Remova o excesso de MBS e adicione 200 microliters de tampão de lise de embrião pré-refrigerado. Para homogeneizar totalmente os embriões, pipeta para cima e para baixo 10 a 20 vezes até que não restem aglomerados. Centrifugar os embriões homogeneizados em uma microcentrifuuagem refrigerada a 10.000 vezes G por 10 minutos, depois remova 160 microliters do supernatante usando uma pipeta P200 e transfira para um novo tubo no gelo, tendo o cuidado de evitar as proteínas de gema branca e outros detritos celulares na metade inferior do tubo.Repita a microcentrifugação uma vez e transfira 128 microlitres do supernatante claro para um novo tubo no gelo. Neste ponto, os lises de embrião limpos e o fluido blastocele coletado podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius pelo tempo desejado. Deglycosillate as proteínas cortadas presentes no fluido blastocele modificado através da rede trans-Golgi com PNGase F seguindo as instruções do fabricante.Os produtos desglicosylated migrariam como uma banda mais condensada em géis SDS, o que pode ajudar na identificação precisa. Para avaliar os monômeros do fragmento de prodomínio e proteínas desdobradas na blastocele e na lise, analise as proteínas em condições de redução adicionando cinco microliters de redução de tampão amostral 4X a 15 microliters blastocele fluido e 15 microliters de embrião esclarecido. Para avaliar a formação de ligantes homodimericos ou heterodimericos cerrados na blastocele, analise as proteínas em condições não redutoras adicionando cinco microliters de tampão amostral 4X não redutor aos 15 microliters restantes do fluido blastocele, em seguida, aqueça-o por cinco minutos e coloque-o no gelo.Após o uso deste protocolo, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE e os imunoblots foram sondados com anticorpos que reconheceram a tag de epítope mícica. Sob as condições de redução, nos lysates de embriões expressando apenas Bmp4 ou Bmp7, uma única banda correspondente aos monômeros Bmp4 cerrados e uma banda migratória mais lenta correspondente aos monômeros Bmp7 cerrados foram detectados. Ambas as bandas foram detectadas em embriões co-expressando Bmp4 e Bmp7.Quando as proteínas foram separadas em condições não redutoras, uma única faixa de mobilidade intermediária Bmp4 e 7 heterodôs madura foi detectada juntamente com uma quantidade de traço de homodimer Bmp4 nos embriões co-expressando Bmp4 e Bmp7. A formação de heterodimer Bmp4 e Bmp7 também foi observada quando os níveis de proteína Bmp7 eram altos. No entanto, neste caso, o excesso de Bmp7 formou homodimers e embriões co-expressos Bmp4 e Bmp7.Esses resultados demonstraram que Bmp4 e 7 formam preferencialmente heterodimers quando co-expressos em embriões xenopus laevis. Neste experimento, coletar blastocele pura é o passo mais importante que requer uma experiência precisa de manuseio de agulhas. Então continue tentando e corrigindo erros.Este procedimento testa se os heterodimers BMP formam e quais aminoácidos são importantes para isso. Próximo passo, o rato knockin pode ser gerado para perguntar se esses aminoácidos são funcionalmente importantes durante o desenvolvimento dos mamíferos.

analysis-transforming-growth-factor-family-cleavage-products-secreted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis

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