Name: Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a processar escarro para citometria de fluxo com contagem celular precisa e volumes de ressuspensão otimizados. Este método facilita diagnósticos clínicos de alta vazão em pesquisas de saúde pulmonar.

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Queremos agradecer a David Rodriguez por sua ajuda com a preparação da figura. As amostras de sputum foram realizadas no BD LSR II no UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, apoiado pela UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (bolsa CTSA).

Todas as etapas do processamento de escarro são realizadas em um gabinete de segurança biológica com equipamentos de proteção individual adequados.
1. Preparação do reagente antes de iniciar a dissociação do escarro
<ol><li>Descongele 1% Paraformaldeído (PFA), 25 mL por amostra no gelo e mantenha frio até o uso. ATENÇÃO: O PFA é tóxico por inalação e contato com a pele. Prepare o fixador de acordo com as instruções do fabricante e congele a -20 °C em alíquotas de 25 mL até usar.</li>
	<li>Aproxime o peso da amostra e descongele 0,1% Dithiothreitol (DTT) para a etapa 2.2 e leve-a a 37 °C. (As alíquotas de DTT devem ser armazenadas a -20 °C antes do uso.)</li>
	<li>Leve 0,5% N-acetil-L-cisteína (NAC) até 37 °C para a etapa 2.2. (O NAC deve ser feito fresco semanalmente e armazenado a 4 °C antes do uso.)</li>
</ol>2. Dissociação de sputum
<ol><li>Pese a amostra de escarro para determinar os volumes de reagentes de dissociação. NOTA: Considera-se que uma amostra é pequena se o peso inicial for ≤3 g, médio se > 3 g, mas ≤ 8 g, grande se >8, mas ≤16 g, e extra-grande se uma amostra pesa >16 g. As indicações pequenas, médias, grandes e extra-grandes serão utilizadas em todo o protocolo. A quantidade de reagentes necessários para dissociação e rotulagem diferem de acordo com o tamanho da amostra de escarro.</li>
	<li>Transfira uma pequena amostra para um tubo cônico limpo de 50 mL, uma amostra média para uma garrafa descartável de plástico de 250 mL limpa, ou uma amostra grande e extra-grande para uma garrafa descartável de plástico limpa de 500 mL. Adicione 1 mL/g de peso amostral de 0,5% NAC e 4 mL/g de peso amostral de 0,1% DTT.</li>
	<li>Vórtice em velocidade máxima (para 15 s), e depois arrasa em temperatura ambiente (em velocidade máxima) por 15 minutos.</li>
	<li>Diluir a amostra com quatro volumes da Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hank (com base no volume total de amostras + reagentes) para neutralizar o NAC e o DTT; vórtice rapidamente em velocidade máxima e rocha em temperatura ambiente por 5 minutos em velocidade máxima.</li>
	<li>Filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de malha de nylon de 100 μm em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mL para criar uma suspensão unicelular.</li>
	<li>Centrifugar as células a 800 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernasce, combine todas as pelotas em um tubo cônico de 15 mL e depois lave as pelotas com HBSS usando as mesmas condições.</li>
	<li>Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro. NOTA: Uma pequena amostra é resuspendida em 250 μL de HBSS. Uma amostra média é resuspendida em 760 μL de HBSS. Amostras grandes e extra-grandes são resuspendidas em 1460 μL de HBSS.</li>
	<li>Pegue uma alíquota da suspensão da célula para uma contagem de células viva/morta usando o Trypan Blue. NOTA: Para uma amostra pequena, use 5 μL. Para uma amostra média, grande ou extra-grande, use 10 μL. Diluir 1:10 com HBSS.<ol>
<li>Misture 10 μL da diluição do escarro com 30 μL de 0,4% Trypan Blue para obter uma diluição amostral final de 1:40. Carregue nas câmaras de contagem de um hemócito para uma contagem de células. NOTA: Pode ser necessário ajustar a diluição final se os números de células estiverem muito baixos ou muito altos para obter uma contagem precisa. Consultar Guiot et al.20 para distinguir corretamente células de escarro de SECs e detritos é fortemente recomendado aqui. Isso é essencial para uma contagem de células precisa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Da amostra extra-grande, remova 50 x 106 células do total e adicione a um novo tubo com HBSS adicionado o suficiente para criar um volume total de 1700 μL. NOTA: Considere esta uma amostra grande para o restante do protocolo. As amostras restantes podem ser descartadas ou usadas para outros fins.</li>
</ol>3. Mancha de corante anticorpo e viabilidade
<ol><li>Escolha de anticorpos e corante de coloração NOTA: A Tabela 1 mostra os anticorpos e o corante de viabilidade que são utilizados neste protocolo e as populações celulares que identificam.<ol>
<li>Rotule os tubos que contêm as células de escarro (ver Tabela 2 para etiquetas).</li>
		<li>Use tubos de citometria de fluxo de 5 mL (compatíveis com o citômetro de fluxo utilizado) para o tubo de amostra com as células não manchadas e o tubo com o controle do isótipo. Use tubos cônicos de 15 mL para as amostras de sangue e tubo epitelial. NOTA: Estas amostras serão transferidas para tubos de citometria de fluxo após a coloração e fixação de anticorpos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rotule os tubos de compensação (Tabela 3). NOTA: Utilize tubos de citometria de fluxo de 5 mL compatíveis com o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado.</li>
	<li>Adicione a quantidade de HBSS, anticorpos e/ou corantes a cada um dos tubos de células de escarro e tubos de compensação, conforme indicado na Tabela 2 e Na Tabela 3, respectivamente. NOTA: Adicione tampão (HBBS), anticorpos e corante a todos os tubos antes de adicionar células ou contas de compensação para garantir que o tempo de coloração de todos os tubos seja consistente.</li>
	<li>Adicione as quantidades de volume de células de escarro listadas na Tabela 2 aos tubos de ensaio.</li>
	<li>Adicione contas de compensação aos tubos de compensação conforme listado na Tabela 3.</li>
	<li>Incubar todos os tubos (tubos de ensaio e compensação) no gelo, protegidos da luz, por 35 minutos. Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado e centrífuga a 4 °C por 10 min a 800 x g.</li>
	<li>Para os tubos de compensação, aspire o supernante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de HBSS frio aos tubos de compensação, armazene-os no gelo a 4 °C e proteja-os da luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo.</li>
	<li>Aspire o supernatante do isótipo, sangue e tubos epiteliais não contidos após a centrifugação (passo 3.6 da seção de coloração de anticorpos) e solte as pelotas apertando os tubos.</li>
</ol>4. Fixação com 1% de paraformaldeído (PFA)
<ol><li>Adicione a PFA fria de 1% (que deve ser descongelada até agora) aos tubos não localizados, isótipo, sangue e epitelial; 2 mL para os tubos de isótipo e isótipo não manchados, e 10 mL para os tubos sanguíneos e epiteliais.</li>
	<li>Incubar os tubos no gelo, protegidos da luz por 1h. Vórtice rapidamente em velocidade máxima após 30 min.</li>
	<li>Encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, tubos de centrífugas a 4 °C por 10 min a 1600 x g.</li>
	<li>Aspire o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota celular e aperte o tubo com os dedos para soltar as células.</li>
	<li>Adicione 200 μL de HBSS frio aos tubos de isótipo e isótipo não manchados.</li>
	<li>Calcule o volume de HBSS para resuspensão do sangue e tubo epitelial de acordo com a contagem total de células. NOTA: Volume de resuspensão = 0,15 x [contagem total de células (etapa 8 de dissociação de escarro) / 106]. Use 50 x 106 como contagem de células para uma amostra extra-grande.</li>
	<li>Armazene todos os tubos de amostra e compensação, protegidos da luz no gelo a 4 °C até que a análise da citometria de fluxo seja realizada. NOTA: Este protocolo não foi testado para armazenamento por mais de 24 horas.</li>
</ol>5. Aquisição de dados no cicímetro de fluxo
<ol><li>Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado. NOTA: Esta seção do protocolo pressupõe que a pessoa que opera o citômetro de fluxo é treinada no uso do instrumento disponível a eles, especialmente no que diz respeito aos procedimentos diários, incluindo a verificação da estabilidade dos sistemas ópticos e fluidos, técnicas para padronizar a dispersão de luz e intensidade de fluorescência, bem como calcular e aplicar a matriz de compensação correta.</li>
	<li>Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) para garantir que as tensões de dispersão para a frente e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir todo o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos. NOTA: Esta etapa é crucial para garantir que detritos menores que 5 μm possam ser eliminados por meio da análise pós-aquisição. Dependendo do citómetro de fluxo utilizado, esteja atento que as menores contas não estão sendo excluídas com o limiar (ao usar o LSR II ou o Lyric) ou com o alto discriminador (usando o citômetro de fluxo Navios EX). Para o Navios EX, foi utilizado um ganho de 2 para a dispersão dianteira e lateral, uma tensão de 236 para dispersão para a frente e 250 para dispersão lateral. Para o LSR II, foi utilizada uma tensão de dispersão para a frente de 165 e uma tensão de dispersão lateral de 190.</li>
	<li>Defina a vazão para médio (LSR II) ou alto (Navios EX). NOTA: A taxa média ou alta de fluxo para a maioria dos instrumentos pode ser usada para adquirir os tubos de escarro. É importante notar que o uso muito lento de uma taxa de fluxo ou muito diluído da amostra pode resultar na fixação das células, resultando em um aumento do vórtice que não é desejado. Portanto, a adesão ao volume calculado de resuspensão na etapa 4.6 deve resultar em densidade celular que pode ser adquirida rapidamente, mas não entupir a máquina.</li>
	<li>Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares na escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação sobre como ajustar as tensões de acordo. NOTA: Certifique-se de que todos os parâmetros necessários sejam selecionados na janela de seleção de parâmetros antes da aquisição ou que os dados não sejam adquiridos.</li>
	<li>Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial. NOTA: Se a suspensão da célula estiver muito concentrada para permitir que o citômetro de fluxo execute as amostras sem entupimento, as amostras podem ser diluídas com HBSS.</li>
</ol>

Todos os autores são funcionários antigos ou atuais da bioAffinity Technologies.

O conteúdo celular da escarro inclui uma grande variedade de células amplas, muitas vezes acompanhadas por muitos detritos37. Além disso, a análise da escarro requer um controle de qualidade que confirme que a amostra é coletada do pulmão em vez da cavidade oral38. Portanto, não é tão simples analisar a escarro por citometria de fluxo como é para o sangue, por exemplo, que libera uma suspensão celular muito mais limpa e homogênea. Este protocolo abordou todas essas questões...

Os avanços técnicos no hardware e software de citómetros de fluxo permitiram identificar muitas populações celulares distintas simultaneamente1,2,3,4. A utilização do citómetro de fluxo na pesquisa de células hematopoiéticas, por exemplo, levou a uma compreensão muito melhor do sistema imunológico2 e da hierarquia celular do sistema hematopoiético5, bem como a distinção diagnóstica de uma infinidade de diferentes cânceres sanguíneos6,7,8. Embora a maioria das células de escarro sejam de origem hematopoiética9,10,11, a citometria de fluxo não tem sido amplamente aplicada à análise de escarro para fins diagnósticos. No entanto, vários estudos sugerem que a avaliação das populações de células imunes na escarro (o subconjunto mais significativo de células) pode ser de grande ajuda no diagnóstico e/ou monitoramento de doenças como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)12,13,14,15. Além disso, a existência de marcadores epiteliais específicos que podem ser usados na citometria de fluxo permite o interrogatório do subconjunto mais significativo de células em escarro, células epiteliais pulmonares.
Além da capacidade de analisar muitas populações celulares distintas de diferentes origens teciduais, um citômetro de fluxo pode avaliar um grande número de células em um período relativamente curto. Em comparação, os tipos de análises cológicas baseadas em slides muitas vezes requerem pessoal e/ou equipamento altamente especializados. Essas análises podem ser intensivas em mão-de-obra, o que leva a apenas uma proporção da amostra de escarro que está sendo analisada16.
Três questões críticas limitam o uso generalizado de escarro na citometria de fluxo. A primeira questão diz respeito à coleta de escarro. A saliva é coletada através de uma tosse que expele muco dos pulmões para a cavidade oral, posteriormente cuspindo em um copo de coleta. Uma vez que o muco viaja através da cavidade oral, há uma alta chance de contaminação sec. Essa contaminação complica a análise da amostra, mas o problema é facilmente corrigido em uma plataforma citométrica de fluxo, como mostrado neste estudo.
Nem todo mundo pode produzir escarro espontaneamente; por isso, vários dispositivos foram desenvolvidos para auxiliar na coleta de escarro de forma não invasiva17. O nebulizador é um desses dispositivos e tem sido mostrado para produzir amostras de escarro confiáveis18,19,20. Embora o nebulizador seja uma forma muito eficaz de coleta não invasiva, seu uso ainda requer uma configuração em uma instalação médica com pessoal especializado21. Em contraste, dispositivos portáteis como a flauta pulmonar22,23,24 e o acapella16,25 podem ser usados em casa, pois são muito fáceis de usar. Estes dispositivos de assistência são seguros e econômicos.
Para nós, a acapella deu resultados consistentemente melhores do que a flauta pulmonar16 e, portanto, o dispositivo de acapella foi escolhido para coleções de escarro. Uma amostra de coleta de 3 dias foi decidida porque o objetivo principal do uso de escarro é desenvolver um teste de detecção de câncer de pulmão16. Foi demonstrado que uma amostra de 3 dias aumenta a probabilidade de detecção de câncer de pulmão em comparação com uma amostra de 1 ou 2 dias26,27,28. No entanto, outros métodos de coleta de escarro podem ser preferíveis para diferentes propósitos. Se um método de coleta de escarro diferente for utilizado do que o descrito aqui, recomenda-se titular cuidadosamente cada anticorpo ou corante usado para análise citométrica de fluxo; muito poucos dados estão disponíveis sobre como diferentes métodos de coleta de escarro afetam as proteínas-alvo para citometria de fluxo.
A segunda questão que amortece o entusiasmo pelo uso de escarro para diagnósticos, principalmente relacionados à citometria de fluxo, é o número de células. O problema é a coleta de células viáveis suficientes para uma análise confiável. Dois estudos demonstraram que amostras de escarro coletadas por métodos não invasivos, com a ajuda de um dispositivo auxiliar, contêm células viáveis suficientes que podem ser utilizadas em diagnóstico clínico ou estudos de pesquisa16,24. No entanto, nenhum desses estudos abordou a questão dos números celulares relativos à citometria de fluxo.
Para os estudos que formam a base para este protocolo, foram coletadas amostras de escarro de participantes de alto risco para o desenvolvimento de câncer de pulmão seguindo diretrizes institucionais aprovadas para cada local de estudo. Os participantes de alto risco foram definidos entre 55 e 75 anos, tendo fumado 30 anos de embalagem e não ter parado de fumar nos últimos 15 anos. Os pacientes foram mostrados como usar o dispositivo de acapella de acordo com as instruções do fabricante29 e coletaram escarro por três dias consecutivos em casa. A amostra foi mantida na geladeira até a última coleta. No último dia de coleta, a amostra foi enviada ao laboratório durante a noite com um pacote frio congelado. As amostras foram processadas em uma única suspensão celular no dia em que foram recebidas. Com este método de coleta de escarro, mais do que suficientes células viáveis são obtidas para uma análise citométrica de fluxo confiável.
Por fim, e relacionado com a emissão anterior do número de células, é a questão de como liberar as células de escarro de seu ambiente mucinoso. Como as células podem ser mantidas viáveis e criar uma única suspensão celular que não obstrua o citómetro de fluxo? Baseado no trabalho inicial de Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, este protocolo descreve um método fácil e confiável para o processamento de escarro em uma única suspensão celular adequada para análise citométrica de fluxo. Este método tem utilizado diretrizes bem estabelecidas na citometria de fluxo32,33,34 para desenvolver uma estratégia eficiente de rotulagem de anticorpos para identificar células hematopoiéticas e epiteliais em escarro e fornecer configurações de instrumentos, medidas de controle de qualidade e diretrizes de análise padronizando a análise de escarro em uma plataforma citométrica de fluxo.

<table><tbody><tr><td>1% Paraformaldeído Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtros de células de nylon M, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de falcão cônico de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-humano CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-humano CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-citoqueratina humana</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Isotipo PanCK, CD3 e CD19</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 anti-humano CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus Contas de compensação</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning Frasco estéril descartável de poliestireno 250 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>Frasco estéril descartável de poliestireno Corning 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& Contas em T</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de Viabilidade Fixável</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 05 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 20 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 30 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-humano CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 anti-humano EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206 / EpCAM Isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 anti-humano CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>EMD</td><td>Solução SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

O sputum, amplamente utilizado para estudar o conteúdo celular e outras características microambientais para entender a saúde do pulmão, é tradicionalmente analisado por meio de metodologias baseadas em citologia. Sua utilidade é limitada porque a leitura dos slides é demorada e requer pessoal altamente especializado. Além disso, detritos extensos e a presença de muitas células epiteliais escamosas (SECs), ou células da bochecha, muitas vezes torna uma amostra inadequada para o diagnóstico. Em contraste, a citometria de fluxo permite fenotipagem de alto rendimento de populações celulares, excluindo simultaneamente detritos e SECs.
O protocolo aqui apresentado descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular, mancha de anticorpos e fixar populações celulares, e adquirir amostras em uma plataforma citométrica de fluxo. Uma estratégia de gating que descreve a exclusão de detritos, células mortas (incluindo SECs) e doublets de células é apresentada aqui. Além disso, este trabalho também explica como analisar células de escarro única viáveis baseadas em um aglomerado de diferenciação (CD)45 populações positivas e negativas para caracterizar subconjuntos de linhagem hematopoiética e epitelial. Uma medida de controle de qualidade também é fornecida pela identificação de macrófagos específicos do pulmão como evidência de que uma amostra é derivada do pulmão e não é saliva. Finalmente, foi demonstrado que este método pode ser aplicado a diferentes plataformas citométricas, fornecendo perfis de escarro do mesmo paciente analisado em três citómetros de fluxo; Navios EX, LSR II e Lyric. Além disso, este protocolo pode ser modificado para incluir marcadores celulares adicionais de interesse. Um método para analisar uma amostra de escarro inteira em uma plataforma citométrica de fluxo é apresentado aqui que torna a escarro favorável para o desenvolvimento de diagnósticos de alta produtividade de doenças pulmonares.

Este protocolo foi desenvolvido com um ambiente de laboratório clínico em mente. O foco durante o desenvolvimento do protocolo foi a simplicidade, eficiência e reprodutibilidade. Verificou-se que o passo mais demorado no processamento da escarro era contar as células. Portanto, o protocolo é configurado de tal forma que o processamento de escarro e rotulagem celular possam ser realizados independentemente da contagem celular sem perda de tempo. Uma contagem de células precisa, que ainda é necessária para diluir a amostra...

Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.

Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Este protocolo resolve desafios comuns experimentados com o processamento de escarro que tornaram difícil no passado o uso com citometria de fluxo para fins de diagnóstico clínico de alto rendimento. Este protocolo foi projetado para economizar tempo usando peso de escarro para determinar volumes de manchas de anticorpos e corantes. Durante a incubação de manchas, a contagem de células pode ser realizada para as etapas a jusante.É importante obter uma contagem de células precisa para determinar o volume correto de re-suspensão para evitar quaisquer problemas ao executar no cítmetro de fluxo. Este protocolo pode fornecer informações sobre áreas de pesquisa que investigam a saúde pulmonar. Por exemplo, doenças como DPOC, asma, câncer de pulmão ou os efeitos do COVID poderiam ser estudadas.Demonstrando o procedimento estará o Dr. Michael Lai, um cientista de pesquisa e desenvolvimento do meu laboratório. Para começar, pese a amostra de escarro para determinar os volumes dos reagentes de dissociação. Transfira a amostra para o vaso de tamanho apropriado com base no peso da escarro, em seguida, adicione um mililitro por grama de 0,5% NAC e quatro mililitros por grama de 0,1%DTT.Vórtice as amostras em velocidade máxima por 15 segundos e rocha a velocidade máxima por 15 minutos à temperatura ambiente. Diluir esta amostra com a solução de sal balanceada 4X Hanks ou HBSS para neutralizar o NAC e o DTT. E depois de um rápido vórtice, balance a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos.Filtrar a suspensão celular através de um coador de células de malha de nylon de 100 micrômetros em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros para criar uma suspensão unicelular. Pelota pelas celas. Depois de aspirar o supernasce, combine pelotas em um tubo cônico de 15 mililitros e lave com HBSS nas mesmas condições.Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro. Pegue uma alíquota da suspensão celular e misture 10 microlitres da diluição da escarro com 30 microliters de azul trypan de 0,4%, em seguida, carregue nas câmaras de contagem de um hemocitômetro para uma contagem de células vivas/mortas. Etiquetar escarro em tubos de compensação.Adicione anticorpo HBSS e corante a cada tubo de célula de escarro e tubos de compensação conforme indicado no texto. Adicione as células de escarro aos tubos de ensaio e adicione contas de compensação aos tubos de compensação mencionados no texto. Incubar todos os tubos no gelo protegidos da luz por 35 minutos.Em seguida, depois de encher os tubos com HBSS gelado, centrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos a 800 vezes G.Para tubos de compensação, aspire o supernatante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de HBSS frios aos tubos de compensação e armazene os tubos no gelo em uma área protegida por luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo. Em seguida, aspire o supernatante da escarro sem manchas, isótipo, sangue e tubos epiteliais.Solte as pelotas apertando os tubos. Adicione dois mililitros de 1%PFA aos tubos de isótipo e isótipo não contidos e 10 mililitros ao sangue e tubos epiteliais. Incubar os tubos no gelo de forma protegida pela luz por 30 minutos, depois rapidamente vórtice em velocidade máxima e incubar novamente por mais 30 minutos.Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, centrifugar os tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.600 vezes G.Aspirar o máximo de supernascer possível sem perturbar a pelota celular e mexer o tubo com os dedos para soltar as células, em seguida, adicionar 200 microliters de HBSS frios aos tubos não manchados e isótipo. Calcule e adicione o volume necessário de HBSS para a ressuspensão do sangue e do tubo epitelial de acordo com a contagem total de células.Armazene todas as amostras em tubos de compensação protegidos da luz no gelo a quatro graus Celsius até que a análise da citometria de fluxo seja realizada. Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado. Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia ou NIST para garantir que as tensões de dispersão dianteira e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos.Defina a taxa de fluxo para médio para LSRII ou alta para Navios EX. Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares em escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação para ajustar as tensões de acordo. Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial.O peso da escória foi usado para determinar os volumes de anticorpos ou corantes para coloração. A correlação entre peso de escarro e rendimento celular não foi forte. As amostras de escarro foram divididas em quatro categorias de peso, agrupadas na distribuição do rendimento celular.Cada anticorpo utilizado foi titulado em uma concentração na fase do planalto com o maior índice de coloração foi escolhido como concentração de trabalho. Em todas as categorias de peso, a contaminação média da SEC foi inferior a 20% com o percentual de células viáveis mostradas. Apresentada é a estratégia de gating utilizada para análise.Contas NIST foram usadas para definir um portão que foi aplicado à amostra de escarro para eliminar detritos. Pequenos detritos foram ainda eliminados pelo portão de largura. O corante de viabilidade foi usado para eliminar células mortas, enquanto o portão singlet removeu doublets.A rotulagem de anticorpos anti-CD45 permitiu a separação de células de escarro única vivas em uma célula sanguínea e um compartimento de células não-sanguíneas. Os perfis obtidos entre Navios EX, LSRII e Lyric foram comparados. A estratégia de gating para eliminar os detritos, células mortas, dobras e comparar perfis sanguíneos e não-sanguíneos é mostrada.Esta técnica nos permitiu aplicar esses métodos para detectar o risco de câncer de pulmão para uso como um teste clínico não invasivo.

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para identificar e contar várias células imunes no fluido de lavagem broncoalveolar. Inicialmente, células imunes únicas são identificadas usando um corante de viabilidade, seguido pela coloração diferencial de proteínas marcadoras de superfície, permitindo a enumeração precisa de cada tipo de célula.

Identificação e Enumeração de Células Imunes no Lavado Broncoalveolar por Citometria de Fluxo

O uso de amostragem em escova citocitária para coletar linfócitos e monócitos da endocérvice é uma técnica minimamente invasiva que fornece amostras para análise da imunidade do trato genital feminino. Neste protocolo, descrevemos a coleta de amostras de cytobrush e o isolamento de células imunes para ensaios de citometria de fluxo.

Coleção, isolamento e Citometria de Fluxo de Análise de Amostras endocervix Humano

Este método demonstra uma técnica para avaliar a função dos granulócitos medindo simultaneamente a fagocitose de bactérias e a explosão oxidativa. A citometria de fluxo baseada em imagem permitiu a identificação de três subconjuntos distintos de granulócitos ativados que diferiam em sua capacidade funcional relativa.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar partículas carregadas de alérgenos por citometria de fluxo. partículas de material particulado ambiental podem agir como portadores de alérgenos adsorvidos. Mostramos aqui que a citometria de fluxo, um método largamente usado para caracterizar os sólidos em suspensão&gt; 0,5 um de diâmetro, pode ser usado para medir estas partículas carregadas com alérgeno.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.

Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Os protocolos aqui descritos fornecem um guia para visualizar e quantificar a atividade de proteases neutrófilos na escarro humana. As aplicações dessa análise abrangem desde a avaliação de tratamentos anti-inflamatórios, até validação de biomarcadores, triagem de medicamentos e grandes estudos clínicos de coorte.

Monitoramento de Elastase e Cathepsin G Atividade em Amostras de Espiuma Humana

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Aprenda a processar escarro para citometria de fluxo com contagem celular precisa e volumes de ressuspensão otimizados. Este método facilita diagnósticos clínicos de alta vazão em pesquisas de saúde pulmonar.

Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

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