Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo
August 9th, 2021
Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.
Este protocolo resolve desafios comuns experimentados com o processamento de escarro que tornaram difícil no passado o uso com citometria de fluxo para fins de diagnóstico clínico de alto rendimento. Este protocolo foi projetado para economizar tempo usando peso de escarro para determinar volumes de manchas de anticorpos e corantes. Durante a incubação de manchas, a contagem de células pode ser realizada para as etapas a jusante.
É importante obter uma contagem de células precisa para determinar o volume correto de re-suspensão para evitar quaisquer problemas ao executar no cítmetro de fluxo. Este protocolo pode fornecer informações sobre áreas de pesquisa que investigam a saúde pulmonar. Por exemplo, doenças como DPOC, asma, câncer de pulmão ou os efeitos do COVID poderiam ser estudadas.
Demonstrando o procedimento estará o Dr. Michael Lai, um cientista de pesquisa e desenvolvimento do meu laboratório. Para começar, pese a amostra de escarro para determinar os volumes dos reagentes de dissociação. Transfira a amostra para o vaso de tamanho apropriado com base no peso da escarro, em seguida, adicione um mililitro por grama de 0,5% NAC e quatro mililitros por grama de 0,1%DTT.
Vórtice as amostras em velocidade máxima por 15 segundos e rocha a velocidade máxima por 15 minutos à temperatura ambiente. Diluir esta amostra com a solução de sal balanceada 4X Hanks ou HBSS para neutralizar o NAC e o DTT. E depois de um rápido vórtice, balance a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos.
Filtrar a suspensão celular através de um coador de células de malha de nylon de 100 micrômetros em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros para criar uma suspensão unicelular. Pelota pelas celas. Depois de aspirar o supernasce, combine pelotas em um tubo cônico de 15 mililitros e lave com HBSS nas mesmas condições.
Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro. Pegue uma alíquota da suspensão celular e misture 10 microlitres da diluição da escarro com 30 microliters de azul trypan de 0,4%, em seguida, carregue nas câmaras de contagem de um hemocitômetro para uma contagem de células vivas/mortas. Etiquetar escarro em tubos de compensação.
Adicione anticorpo HBSS e corante a cada tubo de célula de escarro e tubos de compensação conforme indicado no texto. Adicione as células de escarro aos tubos de ensaio e adicione contas de compensação aos tubos de compensação mencionados no texto. Incubar todos os tubos no gelo protegidos da luz por 35 minutos.
Em seguida, depois de encher os tubos com HBSS gelado, centrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos a 800 vezes G.Para tubos de compensação, aspire o supernatante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de HBSS frios aos tubos de compensação e armazene os tubos no gelo em uma área protegida por luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo. Em seguida, aspire o supernatante da escarro sem manchas, isótipo, sangue e tubos epiteliais.
Solte as pelotas apertando os tubos. Adicione dois mililitros de 1%PFA aos tubos de isótipo e isótipo não contidos e 10 mililitros ao sangue e tubos epiteliais. Incubar os tubos no gelo de forma protegida pela luz por 30 minutos, depois rapidamente vórtice em velocidade máxima e incubar novamente por mais 30 minutos.
Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, centrifugar os tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.600 vezes G.Aspirar o máximo de supernascer possível sem perturbar a pelota celular e mexer o tubo com os dedos para soltar as células, em seguida, adicionar 200 microliters de HBSS frios aos tubos não manchados e isótipo. Calcule e adicione o volume necessário de HBSS para a ressuspensão do sangue e do tubo epitelial de acordo com a contagem total de células.
Armazene todas as amostras em tubos de compensação protegidos da luz no gelo a quatro graus Celsius até que a análise da citometria de fluxo seja realizada. Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado. Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia ou NIST para garantir que as tensões de dispersão dianteira e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos.
Defina a taxa de fluxo para médio para LSRII ou alta para Navios EX. Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares em escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação para ajustar as tensões de acordo. Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial.
O peso da escória foi usado para determinar os volumes de anticorpos ou corantes para coloração. A correlação entre peso de escarro e rendimento celular não foi forte. As amostras de escarro foram divididas em quatro categorias de peso, agrupadas na distribuição do rendimento celular.
Cada anticorpo utilizado foi titulado em uma concentração na fase do planalto com o maior índice de coloração foi escolhido como concentração de trabalho. Em todas as categorias de peso, a contaminação média da SEC foi inferior a 20% com o percentual de células viáveis mostradas. Apresentada é a estratégia de gating utilizada para análise.
Contas NIST foram usadas para definir um portão que foi aplicado à amostra de escarro para eliminar detritos. Pequenos detritos foram ainda eliminados pelo portão de largura. O corante de viabilidade foi usado para eliminar células mortas, enquanto o portão singlet removeu doublets.
A rotulagem de anticorpos anti-CD45 permitiu a separação de células de escarro única vivas em uma célula sanguínea e um compartimento de células não-sanguíneas. Os perfis obtidos entre Navios EX, LSRII e Lyric foram comparados. A estratégia de gating para eliminar os detritos, células mortas, dobras e comparar perfis sanguíneos e não-sanguíneos é mostrada.
Esta técnica nos permitiu aplicar esses métodos para detectar o risco de câncer de pulmão para uso como um teste clínico não invasivo.
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Visão Geral
Este protocolo resolve desafios comuns experimentados com o processamento de escarro, facilitando seu uso com citometria de fluxo para diagnósticos clínicos de alto rendimento. Ele enfatiza a importância da contagem precisa de células e do volume de re-suspensão para uma análise bem-sucedida de citometria de fluxo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Citometria de Fluxo
- Biologia Celular
- Pesquisa em Saúde Pulmonar
Fundo
- O processamento do escarro tem apresentado desafios historicamente para a citometria de fluxo.
- Contagens precisas de células são cruciais para uma análise eficaz.
- As áreas de pesquisa incluem DPOC, asma, câncer de pulmão e COVID-19.
- Este protocolo visa simplificar a análise de escarro para diagnósticos clínicos.
Propósito do Estudo
- Proporcionar um método eficiente para dissociar o escarro em uma suspensão de células únicas.
- Caracterizar subconjuntos celulares usando plataformas padrão de citometria de fluxo.
- Aprimoramento da pesquisa em saúde pulmonar e doenças relacionadas.
Métodos Utilizados
- Determinação dos volumes de anticorpos e corantes de coloração com base no peso do escarro.
- Realização de contagens celulares durante a incubação de coloração.
- Utilização de citometria de fluxo para análise posterior.
- Caracterização de subconjuntos celulares para insights de pesquisa.
Principais Resultados
- O protocolo desassocia com sucesso o escarro em suspensões de células únicas.
- Contagens precisas de células são alcançadas, facilitando uma citometria de fluxo eficaz.
- Insights sobre saúde pulmonar e mecanismos de doenças são fornecidos.
- O processo simplificado aprimora as capacidades de diagnóstico clínico.
Conclusões
- Este protocolo oferece um método confiável para análise de escarro.
- Ele aborda desafios anteriores no processamento de escarro para citometria de fluxo.
- Os resultados apoiam pesquisas adicionais em doenças relacionadas aos pulmões.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
