Name: Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a realizar imagem óptica mesoscópica de corações inteiros de rato usando microscopia de folha de luz e protocolo de clareamento tecidual. Este método preserva a organização tridimensional para estudos cardíacos.

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Este projeto recebeu financiamentos do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do contrato de subvenção n.º 952166 (REPAIR), MUR no âmbito do programa FISR, projeto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projeto PERCARE.

Todos os manuseamentos e procedimentos de animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos e em conformidade com os princípios e regulamentos do Ministério da Saúde italiano. O protocolo experimental foi aprovado pelo Ministério da Saúde italiano (protocolo número 647/2015-PR). Todos os animais foram fornecidos pela ENVIGO, Itália. Para esses experimentos, foram utilizados 5 camundongos machos C57BL/6J de 6 meses de idade.
1. Preparação da solução
<ol><li>Prepare paraformaldeído a 4% (PFA) em salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,6) em um exaustor químico. Conservar as alíquotas de PFA a -20 °C durante vários meses.</li>
	<li>Preparar solução de hidrogel: Misture 4% de acrilamida, 0,05% de bis-acrilamida, 0,25% de Initiatior AV-044 em 0,01 M PBS em um exaustor químico. Mantenha os reagentes e a solução no gelo durante toda a preparação. Conservar as alíquotas de hidrogel a -20 °C durante vários meses.</li>
	<li>Preparar solução de Limpeza: Misture ácido bórico a 200 mM, Dodecil-Sulfato de Sódio (SDS) a 4% em água deionizada; pH 8,6 em um exaustor químico. Conservar a solução entre 21-37 °C para evitar a precipitação SDS.</li>
	<li>Preparar solução fresca de Tyrode no dia do experimento: Adicionar 10 mM de glicose, 10 mM de HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl2 e 4,7 mM de KCl; titula para pH 7,4 usando 1 M de NaOH.</li>
</ol>2. Isolamento cardíaco
<ol><li>Injete 0,1 mL de 500 UI de heparina por via subcutânea 30 min antes do procedimento de isolamento cardíaco.</li>
	<li>Encha uma seringa de 30 ml e três placas de Petri de 6 cm com solução fresca de Tyrode. Faça uma pequena fenda (3-4 mm de profundidade) na borda de uma das placas de Petri e coloque-a sob um microscópio estereoscópico.</li>
	<li>Fixe uma cânula de 1 mm de diâmetro na seringa e insira-a na fenda da placa de Petri. Certifique-se de que não existem bolhas de ar na seringa.</li>
	<li>Encha uma seringa de 20 ml com 4% de PFA e mantenha-a no exaustor químico. Prepare uma placa de Petri vazia sob o capô.</li>
	<li>Anestesiar o ratinho com isoflurano/oxigénio a 3% a um caudal de 1,0 L/min e sacrificá-lo por luxação cervical de acordo com as regras de bem-estar animal em vigor.</li>
	<li>Após o sacrifício, remova o pelo sobre o peito e abra o peito para ter acesso total ao coração.</li>
	<li>Isole o coração, mergulhe-o na placa de Petri previamente preenchida com 50 mL de Solução de Tiroide. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a aorta imediatamente perto do arco aórtico para ter o coração exposto.</li>
	<li>Transfira o coração sob um microscópio estereoscópico e realize cuidadosamente a canulação. Não insira a cânula muito profundamente na aorta (não mais de 2 mm) para evitar danos nos tecidos.</li>
	<li>Use um pouco de grampo e uma sutura (tamanho 5/0) para fixar o coração à cânula.</li>
	<li>Perfundir o coração com 30 ml da solução de Tyrode com uma pressão constante de 10 ml/min para remover o sangue dos vasos.</li>
	<li>Retire a cânula da seringa e coloque o coração na placa de Petri cheia de solução de Tyrode. Tenha cuidado para não ter bolhas de ar na cânula; caso contrário, remova as bolhas de ar corretamente.</li>
	<li>Ligue a seringa de 20 ml cheia de PFA a 4% frio à cânula e perfunda o coração à mesma pressão constante.</li>
	<li>Incubar o coração em 10 mL de PFA a 4% a 4 °C durante a noite (O/N). Para evitar a degradação tecidual, execute as etapas 2.6-2.13 no menor tempo possível.</li>
</ol>3. Limpeza do coração
<ol><li>No dia seguinte, lave o coração em 0,01 M PBS 3 vezes a 4 °C por 15 min. NOTA: Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS + azida de sódio a 0,01% (NaN3) a 4 °C durante vários meses.</li>
	<li>Incubar o coração em 30 ml de solução de Hidrogel em agitação (15 rpm) a 4 °C durante 3 dias.</li>
	<li>Desgaseifique a amostra à temperatura ambiente usando um secador, uma bomba de vácuo e um sistema de tubos que conecta o secador à bomba e a uma tubulação de nitrogênio.<ol><li>Coloque a amostra no secador e abra o frasco para injetáveis, mantendo a tampa sobre ele.</li>
		<li>Feche o secador e remova o oxigênio do tubo abrindo a tubulação de nitrogênio.</li>
		<li>Ligue a bomba de vácuo para remover o oxigênio do secador por 10 minutos.</li>
		<li>Desligue a bomba e use o botão do secador para abrir a tubulação de nitrogênio. Quando a pressão for igual à pressão atmosférica, abra cuidadosamente o secador e feche rapidamente o frasco para injetáveis.</li>
	</ol></li>
	<li>Manter o coração na solução de hidrogel desgaseificada a 37 °C durante 3 h em repouso.</li>
	<li>Quando o hidrogel estiver devidamente polimerizado e parecer inteiramente gelatinoso, retire cuidadosamente o coração dele e coloque-o no suporte da amostra.</li>
	<li>Insira o suporte da amostra com o coração em uma das câmaras de limpeza e feche-o corretamente para evitar vazamentos da solução de limpeza.</li>
	<li>Ligue o banho-maria onde o recipiente de solução de limpeza é colocado e a bomba peristáltica para iniciar a recirculação da solução de limpeza.</li>
	<li>Altere a solução de limpeza no recipiente uma vez por semana para acelerar o procedimento de clarificação.</li>
</ol>4. Coloração da membrana celular
<ol><li>Quando o coração parecer completamente clarificado, retire-o do suporte da amostra e lave-o em 50 mL de PBS aquecido por 24 h. Lavar novamente em 50 mL de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) por 24 h.</li>
	<li>Incubar a amostra em 0,01 mg/mL de Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA) - Alexa Fluor 633 em 3 mL de PBS-T 1x em agitação (50 rpm) à temperatura ambiente por 7 dias.</li>
	<li>Após a incubação de 7 dias, lavar a amostra em 50 mL de PBS-T 1x em temperatura ambiente em agitação por 24 h.</li>
	<li>Incubar a amostra em PFA a 4% por 15 min e depois lavá-la 3 vezes em PBS por 5 min cada. NOTA: Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS + 0,01% de NaN3 a 4 °C por vários meses.</li>
	<li>Incubar o coração em concentrações crescentes de 2,2′-Tiodietanol (TDE) em 0,01 M PBS (20% e 47% TDE/PBS) por 8 h cada, até a concentração final de 68% de TDE em 0,01 M PBS para fornecer o índice de refração necessário (IR = 1,46). Este é o meio de correspondência do IR (RI-médio) para a aquisição de imagens16.</li>
</ol>5. Montagem e aquisição do coração
NOTA: Todos os componentes do sistema óptico estão listados em detalhes na Tabela de Materiais.
<ol><li>Encha suavemente cerca de 80% da cubeta externa (quartzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) com o meio RI. NOTA: Aqui, é possível usar diferentes soluções não voláteis que garantem um IR de 1,46.</li>
	<li>Encha suavemente a cubeta interna (quartzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) com o mesmo meio IR.</li>
	<li>Mergulhe a amostra dentro da cubeta interna. As incubações de amostras descritas acima permitem que a amostra permaneça estável dentro do meio IR sem ser mantida.</li>
	<li>Mova suavemente a amostra para o fundo da cubeta usando pinças finas e organize o coração com seu eixo longitudinal paralelo ao eixo principal da cubeta para minimizar o caminho da luz de excitação através do tecido durante a varredura.</li>
	<li>Fixe suavemente o plugue sob medida acima da cubeta interna com dois parafusos.</li>
	<li>Monte a amostra no estágio de microscópio usando os ímãs.</li>
	<li>Traduza o estágio vertical da amostra manualmente para imergir a cubeta interna na externa.</li>
	<li>Ligue a fonte de luz de excitação (comprimento de onda de 638 nm), definindo uma baixa potência (na ordem de 3 mW).</li>
	<li>Mova a amostra usando o tradutor motorizado para iluminar um plano interno do tecido.</li>
	<li>Ligue o software de imagem (HCImageLive) e defina o gatilho da câmera no modo externo (folha de luz) para acionar o gatilho de aquisição da câmera pelo software personalizado que controla toda a configuração.</li>
	<li>Habilite o Salvamento automático no painel Configurações de digitalização e defina a pasta de saída onde as imagens precisam ser salvas.</li>
	<li>Ajuste manualmente a posição da amostra no plano XY com os tradutores lineares para mover a amostra para o centro do FoV do sensor da câmera.</li>
	<li>Mova a amostra ao longo do eixo Z usando o tradutor motorizado linear para identificar as bordas do coração para reconstrução tomográfica.</li>
	<li>Aumente a potência do laser para ~20 mW, pronto para a sessão de imagem.</li>
	<li>Inicie a aquisição tomográfica, clique no botão Iniciar no Painel de Sequência do software de imagem e, ao mesmo tempo, mova a amostra ao longo do eixo Z na velocidade constante de 6 μm/s usando o tradutor motorizado.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

Nada a divulgar.

Neste trabalho, uma abordagem bem-sucedida para limpar, manchar e visualizar todo o coração de um rato em alta resolução foi introduzida. Primeiramente, um protocolo de transformação tecidual (CLARITY) foi otimizado e realizado, levemente modificado para sua aplicação no tecido cardíaco. De fato, para obter uma reconstrução eficiente em 3D de todo um coração, é essencial evitar o fenômeno da dispersão da luz. A metodologia CLARITY permite-nos obter um coração intacto altamente transparente, mas requer longos tempos de in...

O remodelamento estrutural associado a doenças cardíacas pode afetar a condução elétrica e introduzir disfunções eletromecânicas do órgão 1,2. As abordagens atuais utilizadas para predizer alterações funcionais comumente empregam RM e DT-MRI para obter uma reconstrução geral da deposição de fibrose, árvore vascular e distribuição de fibras do coração, e são usadas para modelar caminhos de propagação do potencial de ação preferencial (APP) através do órgão 3,4. Essas estratégias podem fornecer uma bela visão geral da organização do coração. No entanto, sua resolução espacial é insuficiente para investigar o impacto do remodelamento estrutural na função cardíaca em nível celular.
Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude, onde células individuais podem desempenhar papéis individuais na propagação do potencial de ação, é um desafio. A principal limitação é a ineficiência dos métodos de imagem padrão para realizar imagens de alta resolução (resolução micrométrica) em tecidos maciços (tamanho de centímetros). De fato, a imagem de tecidos biológicos em 3D em alta resolução é muito complicada devido à opacidade do tecido. A abordagem mais comum para realizar reconstruções 3D em órgãos inteiros é preparar seções finas. No entanto, o seccionamento, a montagem e a imagem precisos exigem esforço e tempo significativos. Uma abordagem alternativa que não exija o corte da amostra é gerar um tecido transparente. Nos últimos anos, diversas metodologias de clarificação de tecidos têm sido propostas 5,6,7,8. O desafio de produzir tecidos maciços, transparentes e marcados fluorescentemente foi recentemente alcançado através do desenvolvimento de verdadeiras abordagens de transformação de tecidos (CLARITY9, SHIELD10). Em particular, o método CLARITY baseia-se na transformação de um tecido intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite conferir alta transparência pela remoção seletiva de bicamadas lipídicas de membrana. Notavelmente, esse método tem sido bem sucedido também no preparo cardíaco 11,12,13,14. No entanto, uma vez que o coração é demasiado frágil para ser adequado para uma clareira activa, deve ser limpo utilizando a abordagem passiva, que requer muito tempo para conferir total transparência.
Em combinação com técnicas avançadas de imagem, como a microscopia de folha de luz, o CLARITY tem o potencial de visualizar tecidos cardíacos maciços em 3D em resolução micrométrica. Na microscopia de folha de luz, a iluminação da amostra é realizada com uma fina folha de luz confinada no plano focal do objetivo de detecção. A emissão de fluorescência é coletada ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação15. A arquitetura de detecção é semelhante à microscopia de campo amplo, tornando a aquisição muito mais rápida do que os microscópios de varredura a laser. Mover a amostra através da folha de luz permite obter uma tomografia completa de grandes espécimes, amostras de até centímetros. No entanto, devido às propriedades intrínsecas do feixe gaussiano, é possível obter uma folha de luz muito fina (da ordem de alguns mícrons) apenas para uma extensão espacial limitada, limitando drasticamente o campo de visão (FoV). Recentemente, um novo esquema de excitação foi introduzido para superar essa limitação e aplicado para imagens cerebrais, permitindo reconstruções 3D com resolução isotrópica16.
Neste artigo, uma abordagem de compensação passiva é apresentada, permitindo uma redução significativa do tempo de compensação necessário para o protocolo CLARITY. O referencial metodológico aqui descrito permite reconstruir todo um coração de camundongo com resolução micrométrica em uma única tomografia com tempo de aquisição na ordem de minutos.

<table><tbody><tr><td>2-2' Iniciador de Tiraodietanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 Iniciador</td><td>Wako Chemicals</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Câmera Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>Orca flash 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Software da câmera</td><td>Hamamatsu</td><td>HC Lente</td> de colimação de imagem <td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Braço de detecção</td><td>Óptica integrada</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Lente de excitação</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave; cubeta de quartzo nal</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Espelhos dobráveis</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Espelho galvanométrico</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo interna</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de laser</td><td>Óptica Integrada</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-longo</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Base magnética</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Traslator Motorizado</td><td>Physisk Instrumento</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Solução Tampão de Fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>Lente de relé</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Lente de tubo</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lente ajustável</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Água banho</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Doenças cardíacas genéticas e não genéticas podem causar processos graves de remodelação no coração. O remodelamento estrutural, como a deposição de colágeno (fibrose) e o desalinhamento celular, pode afetar a condução elétrica, introduzir disfunções eletromecânicas e, eventualmente, levar à arritmia. Os modelos preditivos atuais dessas alterações funcionais são baseados em informações estruturais não integradas e de baixa resolução. Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude é um desafio devido à ineficácia dos métodos de imagem padrão na realização de imagens de alta resolução em tecidos maciços. Neste trabalho, descrevemos um referencial metodológico que permite a imagem de corações inteiros de camundongos com resolução micrométrica. A consecução deste objetivo exigiu um esforço tecnológico onde os avanços na transformação de tecidos e métodos de imagem foram combinados. Primeiro, descrevemos um protocolo CLARITY otimizado capaz de transformar um coração intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite alta transparência e coloração profunda. Em seguida, um microscópio de folha de luz de fluorescência capaz de adquirir rapidamente imagens de um campo de visão mesoscópico (escala mm) com a resolução em escala mícron é descrito. Seguindo o projeto mesoSPIM, o microscópio concebido permite a reconstrução de todo o coração do rato com resolução micrométrica em uma única varredura tomográfica. Acreditamos que esse referencial metodológico permitirá esclarecer o envolvimento do desarranjo citoarquitetônico nas disfunções elétricas e abrir caminho para um modelo abrangente que considere tanto os dados funcionais quanto estruturais, possibilitando assim uma investigação unificada das causas estruturais que levam a alterações elétricas e mecânicas após o remodelamento tecidual.

A configuração de limpeza passiva desenvolvida permite obter um coração de rato adulto limpo (com uma dimensão da ordem 10 mm x 6 mm x 6 mm) em cerca de 3 meses. Todos os componentes da configuração são montados como mostrado na Figura 1. O gradiente de temperatura insignificante entre cada câmara de compensação (da ordem de 3 ° C) permite manter a temperatura em uma faixa adequada em todas as câmaras.
<img alt="Figure 1" class="xf...

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Esta metodologia combina a melhoria do protocolo de limpeza com a capacidade ocular de seccionamento óptico da tecnologia Mesos PIM, permitindo-nos realizar reconstruções meso scópicas em resolução micrométrica. Ele fornece a possibilidade de visualizar tecidos cardíacos maciços ou toda a solução de corações de camundongos inteiros em uma única varredura sem perder a organização tridimensional original do tecido. Após o coração ter sido canulado por aorta proximal lavada em solução de tiro e fixada em aldeído 4% Paraform em PBS molar 0,01, está pronto para iniciar o protocolo de limpeza.Lave o coração três vezes em 0,01 molar PBS a quatro graus Celsius por 15 minutos. Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS e 0,01% de azida de sódio a quatro graus Celsius por vários meses. Incubar o coração em 20 mililitros de solução de hidrogel em condição de agitação a 15 RPM durante três dias a quatro graus Celsius.Desengaseifique a amostra à temperatura ambiente usando um secador, uma bomba de vácuo e um sistema de tubos que conecta o secador à banda da bomba e à tubulação de nitrogênio. Coloque a amostra no secador e abra o frasco para injetáveis mantendo a tampa sobre ele. Feche o secador e remova o oxigênio do tubo abrindo a tubulação de nitrogênio.Ligue a bomba de vácuo para remover o oxigênio do secador por 10 minutos. Desligue a bomba e abra o botão do secador para a tubulação de nitrogênio. Em seguida, abra a torneira de nitrogênio.Uma vez que a pressão seja igual à pressão atmosférica, abra cuidadosamente o secador e feche rapidamente o frasco para injetáveis. Mantenha o coração na solução de hidrogel desgaseificado a 37 graus Celsius por cerca de três horas em repouso. Quando o hidrogel estiver devidamente polimerizado e parecer inteiramente gelatinoso, retire cuidadosamente o coração dele e coloque-o numa solução de limpeza no frasco para injetáveis com solução de limpeza.Troque a solução de depuração no frasco para injetáveis uma vez de três em três dias para acelerar o procedimento de clarificação. Uma vez que o coração pareça completamente clarificado, retire-o do frasco para injetáveis e lave-o em 50 mililitros de PBS aquecido durante 24 horas em condições de agitação. Lave novamente em 50 mililitros de um X PBS T por 24 horas em condições de agitação.Incubar a amostra em 0,01 miligramas por mililitros de gérmen de trigo aglutinina Alexa piso 633 em três mililitros de um X PBS T em condição de agitação a 50 RPM à temperatura ambiente durante sete dias. Após a incubação de sete dias, lavar a amostra em 50 mililitros de um X PBS T à temperatura ambiente em agitação por 24 horas. Incubar a amostra em PFA a 4% durante 15 minutos e, em seguida, lavá-la três vezes em PBS 0,01 molar durante cinco minutos cada.Incubar o coração sucessivamente em 20 e 47%TDE em 0,01 molar PBS por oito horas cada. E, finalmente, a 68%TDE em 0,01 molar PBS para fornecer o índice de refração necessário de 1,46. Encha suavemente cerca de 80% do quvet de quartzo externo com o meio de índice de refração.Encha o quvet de quartzo interno com o mesmo meio de índice de refração. Mergulhe a amostra dentro do quvet interno. Mova suavemente a amostra para o fundo do quvet usando pinças finas e organize o coração com seu eixo longitudinal paralelo ao eixo principal do quvet para minimizar o caminho da luz de excitação através do tecido durante a digitalização.Fixe cuidadosamente o plugue sob medida acima do quvet interno com dois parafusos. Monte a amostra no estágio do microscópio usando ímãs. Traduza o estágio de amostra vertical manualmente para imergir o quvet interno no externo.Ligue a fonte de luz de excitação com um comprimento de onda de 638 nanômetros e defina-a em baixa potência na ordem de três miliwatts. Mova a amostra usando o tradutor motorizado para iluminar uma placa interna do tecido. Ligue o software da câmera ao vivo de imagem HC e defina o gatilho da câmera no modo de folha de luz do gatilho de borda externa para acionar o gatilho de aquisição da câmera pelo software personalizado que controla toda a configuração.Habilite o salvamento automático no software da câmera e defina a pasta de saída onde as imagens precisam ser salvas. Ajuste manualmente a posição da amostra no plano X Y com os tradutores lineares para mover a amostra para o centro do campo de visão do sensor da câmera. Mova a amostra ao longo do eixo Z usando o tradutor motorizado linear para identificar as bordas do coração para reconstrução tomográfica.Aumente a potência do laser para aproximadamente 20 miliwatts antes de começar a sessão de imagem. Inicie a aquisição tomográfica clicando no botão Iniciar no painel de captura do software de imagem e, ao mesmo tempo, comece a mover a amostra ao longo do eixo Z na velocidade constante de seis micrômetros por segundo usando o tradutor motorizado. A combinação da metodologia de clareza com TDE como meio de índice de refração não altera significativamente o volume final da amostra nem leva a uma deformação isotrópica do espécime.A óptica de excitação produziu uma folha de luz com um desperdício mínimo de cerca de seis micrômetros que divergiram até 175 micrômetros na borda do campo de visão. A sincronização do obturador de rolamento da câmera com a varredura axial dos resíduos da folha de luz garantiu a coleta do sinal de emissão apenas na porção da amostra excitada com o desperdício da folha de luz, resultando em uma média F W H M de cerca de 6,7 micrômetros ao longo de todo o campo de visão. A função de espalhamento do ponto Z do microscópio também foi estimada por uma reconstrução tomográfica da nanoesfera fluorescente e um F W H M de 6,4 micrômetros foi estimado pelo ajuste.A potencialidade do sistema para resolver membranas celulares únicas em três dimensões com uma relação sinal/ruído suficiente em todo o órgão também foi confirmada. O procedimento de desgaseificação é a etapa mais crítica do protocolo. Se não for realizado corretamente, o tecido pode encontrar danos indicando durante a incubação em uma solução de limpeza.O protocolo apresentado pode ser combinado com um protocolo de coloração múltipla para alcançar uma reconstrução de todo o órgão integrando diferentes estruturas biológicas e pode ser aplicado ao estudo de modelos patológicos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

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