Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a integração de três sistemas de imagem em um único dispositivo, o que permite uma medição simultânea da função mecânica, dinâmica iônica e mudança geométrica da contração do tecido cardíaco. Especificamente, medimos a produção de força do tecido, transitórios de cálcio, deslocamentos locais e mudança de forma. A combinação dessas modalidades de imagem pode ajudar a responder a perguntas-chave em doenças cardíacas, com grandes implicações para o desenvolvimento de estratégias eficazes de tratamento.

A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite estudar a heterogeneidade da atividade muscular. O dispositivo usado neste protocolo contém três sistemas de imagem capazes de fotografar a mesma amostra, um microscópio de campo brilhante, microscópio de fluorescência e um tomografo de coerência óptica. Uma série de espelhosdicróicos são usados para separar a emissão de fluorescência e a imagem de transmissão de campo brilhante.

As características fundamentais deste dispositivo são dois ganchos de montagem acionados independentemente, uma câmara de medição com três eixos opticamente claros e uma linha de gatilho externa que sincroniza as câmeras brightfield e OCT com um estimulador. Neste vídeo, demonstramos como isolar, preparar e imaginar trabeculas cardíacas e apresentar alguns resultados representativos. Depois de extirfar um coração de um rato anestesiado, transfira-o para a câmara de dissecção.

Usando duas fórceps curvas, puxe a aorta sobre a cânula de perfusão. Mantenha a aorta no lugar com um forcep. Enquanto isso, abra a linha de tubos para permitir que a solução de dissecção flua através da cânula de perfusão.

Uma vez que a vasculatura coronária é limpa de sangue e o coração é completamente perfundido com solução de dissecção, proteja a aorta no lugar usando uma sutura. Posicione o coração girando a cânula para que a artéria coronária esquerda seja visível na superfície superior. Fixar o ápice do coração no fundo da câmara de dissecção.

Corte os dois atria. Corte ao longo do lado direito do septo para o ápice do coração. Fixar o ventrículo esquerdo aberto na base da câmara de dissecção.

Em seguida, cortando ao longo do lado esquerdo do septo, abra o ventrículo direito e fixe-o na base da câmara de dissecção, também. Identifique uma trabecula de execução livre no ventrículo direito. Usando a tesoura de mola e um forcep, corte o tecido da parede ao redor da trabecula.

Em seguida, corte o tecido da parede ao meio, ortogonal à direção da trabecula. Corte o tecido da parede até que sua dimensão seja apropriada para a configuração de montagem utilizada. Deixe a trabecula excizada na câmara de dissecção.

Lave água quente, água destilada e, em seguida, solução de superfusato através da câmara de medição. Ligue a fonte de luz do microscópio brightfield e pressione f1 para permitir a captura. Ajuste manualmente o gancho a jusante até que esteja centrado na imagem de campo brilhante.

Clique em zero eixo a jusante e, em seguida, desabilitar a jusante para habilitar o motor. Mova o controle deslizante de ponto a jusante até que o final do gancho se alinhe com a borda da região padrão de juros. Re-zero o eixo a jusante, em seguida, mova o controle deslizante de setpoint a jusante para 1.000.

Repita o processo com o gancho a montante, mas não mova o controle deslizante de setpoint a montante após re-zerar o eixo upstream. Clique em mover para a montagem. Inicie o sistema de iluminação da fluorescência rebocando o interruptor da lâmpada antes de ligar rapidamente os subsistemas do controlador, alternando o interruptor principal.

Mude o modo operacional para o em branco turbo pressionando o botão de modo no painel frontal, seguido por dois, depois um. Pressione o botão on-line para ativar o controle externo. Pausa o fluxo de superfusato através da câmara de medição.

Encha a câmara de montagem com solução de dissecção. Usando uma seringa de um mililitro, transporte a trabecula da câmara de dissecção para a câmara de montagem. Permita que a trabecula desça na câmara de montagem através da gravidade.

Abaixe o nível de fluido na câmara de montagem para que fique nivelado com a seção média dos ganchos. Ajuste a distância entre os ganchos para refletir o comprimento da trabecula movendo o controle deslizante de ponto a jusante. Usando um microscópio para ajudar na visualização, segure levemente um dos pedaços do tecido final com fórceps e monte-o no gancho upstream.

Monte o outro pedaço de tecido final no gancho a jusante. Uma vez montado com segurança, mova o trabecula de volta para a câmara de medição pressionando mover-se para câmara e retomar o fluxo de superfusato. Defina a frequência de estímulo para um, duração de estímulo para 10, e tensão de estímulo para 10.

Comece a estimulação pressionando o estímulo. Ligue o sistema de iluminação brightfield. Pressione f1 e selecione uma região de interesse que inclua uma área estriada da interface do usuário.

Clique no comprimento de sarcomere compute para calcular o comprimento médio de sarcomere na região destacada. Aumente o comprimento muscular até que o comprimento médio do sarcomere seja de aproximadamente 2,32 mícrons. Mova o músculo ajustando o controle do ponto de ajuste central na guia de controle central e de controle de separação para que a borda do gancho a jusante seja apenas visível dentro da imagem de campo brilhante.

Colete as informações de fluorescência para 10 contrações. Aumente o valor do ponto central em 200 e colete outros 10 twitches de informações de fluorescência. Repita este processo até que a imagem brightfield contenha o gancho upstream.

Colete o valor da janela final de informações de fluorescência. Retorne o trabecula para uma posição central, definindo o valor do ponto central para zero. Reduza a frequência de estímulo para 0,2 Hertz e mude do superfusato K-H para a solução de carregamento Fura-2.

Meça o sinal de fluorescência a cada 10 minutos. Visualize o sinal na guia de sinal PMT. Depois que o sinal de 360 nanômetros aumentou em um fator de 10, retorne a frequência de estímulo para um Hertz e mude de volta para a solução de superfusato K-H.

Verifique a medição da razão a cada 10 minutos até que o sinal se estabilize, momento em que, a coleta de dados pode começar. Retorne o músculo para a posição onde a borda do gancho a jusante está apenas presente dentro da imagem de campo brilhante. Capturar informações de fluorescência clicando em ativar a fonte de fluorescência.

Comece a transmitir dados de hardware. Na interface do usuário de imagem brightfield, defina o modo de captura para o gatilho externo, aumente a taxa de quadros para 100 Hertz e defina o número de imagens para capturar para 100. Pressione o controle-shift-S, seguido pela F1, para registrar os dados de imagem de brightfield para esta janela.

Aumente o valor do setpoint central em 200 e repita o processo de captura de brightfield. Continue com o protocolo de digitalização até que os dados de imagem foram coletados para a janela final. Retorne o trabecula para uma posição central, definindo o valor do ponto central para zero.

Ligue a fonte de iluminação OCT girando a tecla mestre, pressionando o botão de alimentação, seguido pelo botão SLDs. Cubra a cabeça do galvanômetro e clique em obter fundo para medir o padrão de interferência de fundo e subtrai-lo da medição. Defina o modo de captura de imagem para visualização ao vivo.

Centralize o trabecula nos eixos X e Y ajustando os valores de deslocamento X e Y. Com o trabecula centrado, escaneie ao longo do eixo y ajustando a posição Y para encontrar as posições correspondentes aos ganchos rio acima e rio abaixo. Anote essas posições para baixo.

Definir o intervalo Y para a diferença absoluta entre esses valores divididos por 10. Defina o modo de captura de imagem como estímulo acionado, alcance X a 100 e clique no botão definir parâmetros ativos. Clique em dados de fluxo e, em seguida, adquira.

Para capturar as informações regionais de cálcio e campo brilhante durante toda a extensão da trabecula apresentada aqui, foram necessárias sete posições musculares. Esse número da força média de cada uma das posições sobrepostas sugere que a força do contração não foi perturbada por esse movimento, revelando que não houve dependência de posição do ato de produção de força. Estes scans coletados usando tomografia de coerência óptica a uma taxa de 100 Hertz foram segmentados usando o plugin ImageJ, Weka.

Cada seção transversal aparece distorcida devido à diferença entre as resoluções laterais e de profundidade. Isso foi corrigido pelo dimensionamento de cada eixo independentemente com sua respectiva resolução. Depois de escalar o C-scan bruto da trabecula, o músculo é aproximadamente cilíndrico.

O reflexo da parede da câmara de medição às vezes pode se sobrepor com os dados musculares, mas o software de segmentação pode ser treinado para explicar isso. Uma vez segmentada, a área transversal ao longo do comprimento do músculo pode ser calculada ao longo da contração. Note que este trabecula em particular tem um pequeno ramo.

O movimento do ramo é evidente aproximadamente no meio do trabecula. Finalmente, as imagens segmentadas podem ser convertidas em malhas para auxiliar na construção de modelos geométricos. Dados de imagem capturados em cada uma das sete posições a uma taxa de 100 quadros por segundo foram costurados para criar uma única imagem completa do trabecula.

A razão da fluorescência omitida associada à luz de excitação de 340 e 380 nanômetros se correlaciona com o cálcio intracelular após o trabecula ter sido carregado com Fura-2. A média de 10 transitórios intracelulares de cálcio de cada janela estão alinhados com a região em que foram imagens. Enquanto o pico dos transitórios para este trabecula parece razoavelmente consistente, o cálcio diastólico reduziu ao longo de seu comprimento.

Da mesma forma, os resultados do rastreamento de deslocamento e dos cálculos de comprimento de sarcomere também indicam a presença de variabilidade regional. A técnica de rastreamento sem marcador usada é capaz de calcular o deslocamento de cada pixel. A adequação das estimativas de comprimento de sarcomere foram testadas com base na largura e amplitude do ajuste gaussiano ao sinal FFT.

Essas condições não foram atendidas na região muscular entre zero e 500 mícrons, de modo que nenhuma informação de comprimento de sarcomere poderia ser computada lá. Dado os deslocamentos associados, é provável que os sarcomeres nesta região alongados durante a fase contraitária do contração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar as trabeculas cardíacas e prepará-las para imagens multimodais de forma confiável.

Este processo estabelece um caminho para a coleta de um conjunto de dados necessário para a construção de modelos de elementos finitos fisiologicamente informados de contração do tecido cardíaco.