Name: Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a integrar microscopia de campo claro, fluorescência e tomografia de coerência óptica para estudar a função mecânica e dinâmica iônica de trabéculas cardíacas de ratos. Este método avança a pesquisa de doenças cardíacas.

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Este estudo foi financiado por Bolsas de Doutorado da Universidade de Auckland (concedidas a JD e MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 e 21/116) do Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia (concedido à J-CH à KT, respectivamente), uma bolsa de doutorado concedida pela National Heart Foundation (concedida à AA), bolsas Marsden Fast-Start (UOA1504 e UOA1703) da Royal Society of New Zealand (concedida à J-CH e KT, respectivamente), e uma Bolsa de Pesquisa James Cook da Royal Society of New Zealand (concedida à AT). O desenvolvimento original deste instrumento foi financiado por uma subvenção de Marsden (11-UOA-199) da Royal Society of New Zealand (concedida à AT e PN).

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Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, apresentamos uma configuração que permite a montagem de três sistemas ópticos que combinam imagens brightfield, fluorescência e OCT para coletar dados de uma trabecula cardíaca ex vivo ( Figura1 e Figura 2). Tal integração orquestrada é possível devido ao desenho da câmara de medição (Figura 3) para permitir o arranjo ortogonal do OCT para o eixo brightfield-fluorescence. O sistema de montagem muscular desempenha um papel igualmente importante no sucesso das quantificações simultâneas dos principais índices na caracterização da dinâmica de excitação muscular cardíaca. Sua novidade reside na habilitação de procedimentos de escaneamento muscular sem perturbação aparente ao desempenho mecânico do músculo (Figura 6). Com a configuração combinada de imagem e sistema de gancho motorizado para medição de força, este sistema pode avaliar a heterogeneidade regional no comprimento transitório, de deslocamento e sarcomere ca2+, juntamente com informações geométricas macroscópicas de um trabecula de contração ao longo do curso do tempo da contração (Figuras 7 e Figura 8).
Dada a onipresença dos sistemas de imagem de epifluorescência de campo brilhante dentro dos laboratórios de pesquisa cardíaca, a reprodução desses resultados pode ser alcançada com algumas pequenas considerações de hardware. Aqui, apresentamos o kit de ferramentas de processamento de imagem para combinar brilho-epifluorescência e OCT, o que é essencial na análise da heterogeneidade contraída subjacente. A integração do OCT requer um caminho óptico desobstruído, enquanto a imagem fechada requer uma linha de gatilho externa entre o estímulo e a câmera de imagem OCT e brightfield, e ganchos de montagem muscular capazes de mover a amostra por toda a câmara de medição. Os softwares e métodos de pós-processamento necessários estão disponíveis gratuitamente. Em particular, o software de segmentação utilizado, WEKA14,é de código aberto. A técnica de rastreamento sem marcadores dos pontos de material8, comprimento de sarcomere, imagem volumosa fechada10e códigos de geração de malha também são acessíveis e podem ser disponibilizados a pedido do autor correspondente.
Viabilidade muscular, carregamento ideal de Fura-2 e foco de imagem são os três pilares que formam os fundamentos de um experimento bem sucedido. Utilizando uma solução de dissecção contendo BDM para evitar contratura, transporte do músculo em uma seringa, oxigenação contínua da solução e preparação de novas soluções experimentais no dia de um experimento, todos contribuem para uma alta taxa de viabilidade muscular. Antes de carregar a trabecula com Fura-2AM, a autofluorescência deve ser coletada para cada condição que se tenha interesse em estudar, pois pode ter um efeito significativo sobre o transitório Ca2+ medido 15. A oxigenação da solução de carregamento Fura-2AM é complicada pela necessária inclusão do plurônico-F127 surfactante para ajudar o carregamento de tingimento. Para combater a consequente formação de bolhas em excesso causada por este surfactante, uma pequena gota de anti-espuma na solução de carregamento permite ao usuário aumentar a taxa de oxigenação, melhorando assim a chance de que o trabecula mantenha a viabilidade funcional durante todo o processo de carregamento. Finalmente, o foco de imagem deve ser uniforme ao longo do comprimento muscular para maximizar a relação sinal/ruído das informações de campo brilhante e fluorescência.
Há duas limitações a serem consideradas com os métodos aqui apresentados. A primeira é a resolução espacial do microscópio de fluorescência. Embora as resoluções espaciais do OCT e da imagem de brightfield sejam altas, a resolução do microscópio de fluorescência é limitada à integral da fluorescência do volume capturado dentro de uma janela de imagem de 540 μm por 540 μm. Há escopo para aumentar a resolução espacial do microscópio de fluorescência usando uma câmera de dispositivo acoplada a carga de alto ganho, em vez de um PMT, para capturar o sinal de fluorescência em detrimento do sinal para a razão de ruído16. Em segundo lugar está o diâmetro da trabecula que pode ser estudado em termos de comprimento sarcomere mensurável e profundidade geométrica. A abordagem de FFT com janelas para a computação de comprimento sarcomere explora o benefício da melhor resolução espacial, mas está associada à redução da robustez(Figura 8D). Nos casos em que as trabeculas turvas ou de grande diâmetro devem ser estudadas, a resolutividade do FFT será muito reduzida devido ao contraste reduzido associado à banda sarcomerica em amostras de tecido maiores. Da mesma forma, dentro do OCT, os reflexos traseiros de uma profundidade de imagem superior a 300 μm serão muito fracos para serem resolvidos durante a fase de segmentação. Assim, nossa técnica está limitada a trabeculas de diâmetro inferior a 300 μm. No entanto, não é recomendável estudar amostras de grande diâmetro, pois pode haver problemas com oxigenação difusa do núcleo muscular durante altas taxas de estimulação17.
Nosso método permite a avaliação da função mecânica iônica em associação com a geometria muscular em músculos saudáveis e doentes, fornecendo uma abordagem poderosa para entender a fisiologia muscular cardíaca, a fisiopatologia e a farmacologia. O pipeline de processamento de imagens descrito aqui extrai dados que serão fundamentais para obter uma compreensão mais profunda da heterogeneidade contraída. Um caminho para perceber completamente o potencial de um conjunto de dados tão rico está na construção de modelos matemáticos que integram e interpretam esses dados, e para fazer previsões que podem ser testadas experimentalmente usando nosso dispositivo.

A superfusão de preparações isoladas de tecido muscular cardíaco é um protocolo padrão e amplamente utilizado para o estudo da ativação cardíaca iônica e da mecânica1. Em particular, o isolamento das estruturas trabeculas, semelhantes a varas das paredes ventriculares, permitiu a avaliação de fenômenos incluindo a ativação dependente de comprimento da contração2,resposta de estiramento dependente da contração3,4, e viscoelasticidade diastólica5 do tecido cardíaco. Ter Keurs, o iniciador desta técnica de superfusing trabeculae isolada, inicialmente usou uma combinação de imagens de fluorescência para medidas ca2+ e difração a laser para determinar comprimentos de sarcomere2,5. Desde esses primeiros estudos, tornou-se cada vez mais comum extrair informações de comprimento de sarcomere com uma maior resolução espacial usando técnicas baseadas em transformação 2D fast Fourier (FFT)6 em imagens de microscopia de campo brilhante. Os dois sistemas de imagem permitem uma avaliação parcial da relação subjacente entre a liberação de Ca2+ e a produção de força dependente de comprimento de sarcomere.
O músculo cardíaco é estriado, com a faixa visível associada a uma série subjacente de unidades contratuais consistindo de filamentos espessos e grossos. A interação desses filamentos constituintes que compõem sarcomeres está por trás da geração de força, que começa da seguinte forma: um sinal elétrico despolarizador, ou potencial de ação, faz com que canais L-tipo Ca2+ dependentes de tensão na membrana celular se abram; o fluxo celular resultante do Ca2+ induz a liberação de Ca2+ do reticulum sarcoplasmático (SR), uma loja intracelular Ca2+, em um processo conhecido como Ca2+-induzido ca2+ versão7; esse aumento repentino na concentração intracelular de Ca2+ de nanomolar para micromolar permite que a produção de força ocorra; As bombas Ca2+ extrudam continuamente o Ca2+ do citosol de volta para o compartimento de RS e extracelular; quando a concentração intracelular ca2+ retorna à faixa de nanomolar, a produção de força cessa e o músculo relaxa. Durante a produção de força, os filamentos grossos e finos do constituinte deslizam um sobre o outro. O comprimento do sarcomere dita a extensão relativa da sobreposição e, portanto, o potencial de produção de força do músculo macroscopicamente.
Neste artigo, estendemos essas técnicas de imagem fluorescência-brightfield para incluir a tomografia óptica de coerência (OCT). O OCT utiliza o princípio físico da interferência e é capaz de obter a deformação geométrica do tecido para entender a heterogeneidade contraíxica muscular8. Nosso dispositivo (Figura 1) usa um sistema oct de domínio espectral (SD-OCT). Em SD-OCT, um divisor de feixe divide a luz de um diodo superluminescente de curto comprimento de banda larga em braços de referência e medição. O braço de referência contém um espelho fixo, e o braço de medição contém um galvanômetro 2D para guiar a luz. A luz requescattered da amostra é coletada e interfere com a luz refletida no braço de referência para formar um padrão de interferência. As informações de profundidade são codificadas na frequência da franja espectral. Para extrair as informações, o sinal é passado através de um espectrômetro e um FFT inverso é aplicado ao resultado. O sinal 1D correspondente representa as estruturas em diferentes profundidades, correspondendo a alterações no índice de refração9 (A-scan). Ao direcionar o laser em um único eixo, pode-se construir uma seção transversal da amostra de interesse (B-scan) e, da mesma forma, repetindo o processo em um padrão passo-sábio no eixo restante, uma imagem tridimensional pode ser gerada (C-scan). Por extensão, pode-se coletar uma série de varreduras B em uma única fatia para um assunto repetitivo de tempo variando com base em um gatilho externo e repetir para gerar uma varredura tridimensional, representando uma imagem planar de variação de tempo10.
Ao integrar os três sistemas de imagem, consideramos os dois princípios seguintes. Primeiro, os sensores de imagem não devem detectar luz de uma modalidade alternativa de imagem, e segundo, o design físico deve conter espaço livre para pelo menos três planos de imagem simultâneas. Para atender ao primeiro requisito, o microscópio brightfield usa um LED de comprimento de onda de 660 nm para iluminar a amostra em uma configuração invertida. O microscópio de fluorescência está em uma configuração de epifluorescência onde a mesma lente objetiva é usada tanto para excitação quanto para coleta da luz emitida. A luz de excitação tem um comprimento de onda entre 340 nm e 380 nm, e um tubo fotomultiplier (PMT) mede a luz emitida em um comprimento de onda de 510 nm. Um par de espelhos dicroicos permitem que esses dois caminhos ópticos compartilhem a mesma pegada física sem interferir na medição oposta(Figura 2). Finalmente, o OCT usa luz de banda larga (100 nm de largura espectral) com um comprimento de onda central de 840 nm, distinto das outras duas modalidades. Devido à natureza de baixa coerência da luz usada para OCT, qualquer luz dispersa das fontes de fluorescência de campo brilhante não contribuirá para o padrão de interferência que codifica informações de profundidade. Para o segundo requisito, o projeto de habitação para o tubo capilar possui vias ópticas acessíveis para os planos anterior, inferior e superior da amostra. Durante os experimentos, dois ganchos de platina seguram uma trabecula dentro de um tubo capilar perfumado com solução krebs-henseleit oxigenada (KH). O chefe galvanômetro do OCT é orientado ortogonalmente para a via de imagem brightfield-fluorescence para aproveitar o terceiro plano óptico ortogonal(Figura 3).
Este artigo descreve as considerações de design para a construção de um dispositivo capaz de imagem simultânea de cálcio, comprimento de sarcomere e geometria muscular. Para demonstrar essas capacidades de medição, descrevemos o processo de isolamento de uma trabecula ventricular, a preparação das soluções tampão necessárias, juntamente com as etapas críticas envolvidas no manuseio e carregamento de fluorescência de um ex vivo trabecula. Finalmente, este artigo descreve os processos necessários para traduzir o conjunto de dados em visualizações mais úteis.

<table><tbody><tr><td>2,3-Butanodiona monóxido</td><td>Acros Organics</td><td>150375000</td><td></td></tr><tr><td>20&vezes; lente de microscópio</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20&vezes;</td><td>NA 0,75</td></tr><tr><td>Galvanômetro 2D</td><td>Thorlabs</td><td>GVSM002/M</td><td></td></tr><tr><td>50-50 divisor de feixe</td><td>Thorlabs</td><td>FC850-40-50-APC</td><td></td></tr><tr><td>90-10</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R2A2</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de entrada analógica</td><td>National Instruments</td><td>NI-9205</td><td>Grava o sinal PMT a 200 kHz</td></tr><tr><td>Fonte de luz de imagem de campo claro</td><td>CoolLED</td><td>PE-2</td><td>660&nbsp; nm LAM</td></tr><tr><td>Fonte de luz de banda larga</td><td>Superlum</td><td>Broadlighter-840</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Placa Cameralink</td><td>National Instruments</td><td>NI-1429</td><td>Brightfield imageimaging frame grabber</td></tr><tr><td>Carbogen 5</td><td>BOC</td><td>Código de gás: 181</td><td></td></tr><tr><td>Lente condensadora</td><td>Nikon</td><td>LWD 0.52</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI-6259</td><td>Aciona o movimento do galvanômetro</td></tr><tr><td>Espelho dicróico 1</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico 2</td><td>Semrock</td><td>FF552-Di02</td><td></td></tr><tr><td>Grade de difração</td><td>Wasatch Fotônica</td><td>1200 linhas/mm @840 nm</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Q 3 Sistema UV</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRQSVR3WW</td><td>Máquina de água destilada</td></tr><tr><td>Banho seco</td><td>Corning</td><td>6875-SB</td><td>LSE banho seco digital</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Software de processamento de imagem de código aberto</td></tr><tr><td>Fura-2AM sal pentapotássico</td><td>Thermofisher</td><td>F14186</td><td></td></tr><tr><td>Hardware Placa FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-7813R</td><td>Também controla o acionamento da captura de campo claro</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Pfizer</td><td>61024</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Pilar</td><td></td>de <td>iluminação Nikon TI-DH</td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>MedSource</td><td>VAPDRUGISO250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de varredura de linha</td><td>Basler</td><td>spL2048-70km</td><td>Câmera espectrômetro</td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td>RCT básico</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Código de processamento de dados</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cartão FPGA OCT</td><td>National Instruments</td><td>NI-1483R</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de oxigênio</td><td>BOC</td><td>Código de gás: 100D</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422-20</td><td></td></tr><tr><td>Powerload</td><td>Thermofisher</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Diodo superluminescente</td><td>Broadlighter</td><td>D-840</td><td></td></tr><tr><td>Transimpedance</td><td>amplificador Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) amino-metano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Wistar rato</td><td>Vernon Jansen Unidade</td><td></td><td>8 - 10 semanas</td></tr><tr><td>Lâmpada de arco de xenônio</td><td>Sutter Instrument</td><td>DG-4</td><td>Lambda DG-4</td></tr></tbody></table>

brightfield simultâneo, fluorescência e imagem tomográfica de coerência Óptica de contrair trabeculae cardíaca ex vivo

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

No músculo cardíaco, transitórios intracelulares Ca2+ ativam miofilamentos contratuais, causando contração, encurtamento macroscópico e deformação geométrica. Nossa compreensão das relações internas entre esses eventos tem sido limitada porque não podemos nem "ver" dentro do músculo nem acompanhar precisamente a natureza esposte-temporal da dinâmica excitação-contração. Para resolver esses problemas, construímos um dispositivo que combina um conjunto de modalidades de imagem. Especificamente, ele integra um microscópio de campo brilhante para medir mudanças locais de comprimento de sarcomere e tensão tecidual, um microscópio de fluorescência para visualizar o transitório Ca2+ e um tomógrafo óptico de coerência para capturar as mudanças geométricas do tecido ao longo do tempo de um ciclo cardíaco. Apresentamos aqui a infraestrutura de imagem e a estrutura de coleta de dados associada. Os dados são coletados de estruturas de tecidos isoladas semelhantes a varas conhecidas como trabeculae carneae. Em nosso instrumento, um par de ganchos de platina controlados por posição seguram cada extremidade de uma amostra muscular ex vivo enquanto é continuamente superfusada com solução salina rica em nutrientes. Os ganchos estão sob controle independente, permitindo o controle em tempo real do comprimento e força muscular. A tradução longa permite a digitalização fragmentada da amostra, superando limitações associadas ao tamanho relativo da janela de imagem do microscópio (540 μm por 540 μm) e o comprimento de uma trabecula típica (>2000 μm). Eletrodos de platina em cada extremidade da câmara muscular estimulam a trabecula a uma taxa definida pelo usuário. Exploramos o sinal de estimulação como um gatilho para sincronizar os dados de cada janela de imagem para reconstruir toda a amostra contraindo em condições de estado estável. A aplicação de técnicas de processamento de imagens nesses dados de imagem de campo brilhante fornece mapas de deslocamento de tecido e comprimento sarcomere. Tal coleta de dados, quando incorporada em um pipeline de modelagem de experimentos, fornecerá uma compreensão mais profunda da homogeneidade contratil muscular e heterogeneidade na fisiologia e fisiopatologia.

Para capturar as informações regionais ca2+ e brightfield para toda a extensão da trabecula apresentada aqui, foram necessárias sete posições musculares. A Figura 6 sugere que a força de contração não foi perturbada por esse movimento, revelando que não havia dependência de posição da produção da força ativa.
As tomografias B coletadas utilizando tomografia de coerência óptica a uma taxa de 100 Hz foram segmentadas utilizando o plugin ImageJ WEKA14 (Figura 7A). Cada seção transversal aparece distorcida devido à diferença entre as resoluções lateral (10 μm) e profundidade (1,73 μm (no miocárdio)). Essa distorção foi corrigida pelo dimensionamento do eixo de profundidade da imagem pela relação resolução lateral de profundidade de resolução. Figura 7B,C demonstram que após o dimensionamento da c-scan bruta da trabecula é aproximadamente cilíndrico em geometria. O reflexo da parede da câmara de medição pode às vezes se sobrepor aos dados musculares(Figura 7A,B),mas o software de segmentação pode ser treinado para explicar isso (Figura 7D,E). Uma vez segmentada, a área transversal ao longo do comprimento do músculo pode ser calculada ao longo da contração (Figura 7F). Observe que este trabecula em particular tem um pequeno apêndice ramificando-se a partir dele. O movimento do ramo é evidente ~0,75 mm ao longo da trabecula. Por fim, as imagens segmentadas podem ser convertidas em malhas para auxiliar na construção de modelos geométricos(Figura 7G).
Dados de imagem capturados em cada uma das diferentes posições de trabecula a uma taxa de 100 fps foram costurados juntos para criar uma única imagem completa do trabecula (Figura 8A). A resolução dessas imagens é de 0,535 μm/pixel. O uso de funções de ponderação linear nas regiões sobrepostas das janelas vizinhas auxilia na visualização e minimiza o impacto da vinheta presente nas imagens de campo brilhante. Para medir o sinal fluorescente, uma janela de 540 μm por 540 μm da trabecula é ciclicamente iluminada com 340 nm, 365 nm e luz de comprimento de onda de 380 nm a uma taxa de 600 Hz. A razão da fluorescência emitida associada à luz de excitação de 340 nm e 380 nm correlaciona-se com o cálcio intracelular após o trabecula ter sido carregado com Fura-2. Como esta medição é uma razão, a taxa de medição efetiva é de 200 Hz. Os transitórios intracelulares Ca2+ de cada janela estão alinhados com a região em que foram visualizados (Figura 8B). Enquanto o pico dos transitórios parece razoavelmente consistente, a diastólica [Ca2+] é menor dentro da região entre 900 μm e 1800 μm ao longo da trabecula. Da mesma forma, os resultados dos cálculos de rastreamento de deslocamento(Figura 8C) e de sarcomere(Figura 8D) também indicam a presença de variabilidade regional. A técnica de rastreamento sem marcador usada é capaz de processar o deslocamento de cada pixel, dado contraste suficiente. Ao mapear a distribuição de comprimentos de sarcomere no poste, uma área de correlação cruzada de 128 pixels por 128 pixels (~67 μm por 67 μm) foi usada para calcular o comprimento regional de sarcomere. Esta área encapsula aproximadamente 29 sarcomeres quando perto a amostra está perto do comprimento ideal de sarcomere. O tamanho do passo (tanto nas direções x quanto em y)entre o centroide de cada janela de correlação cruzada foi definido em 50 pixels (~26 μm) para o processamento desses dados. A adequação das estimativas de comprimento de sarcomere foi testada com base na largura e amplitude do ajuste gaussiano ao sinal FFT. Estas condições não foram atendidas na região muscular entre 0 μm e 500 μm para que nenhuma informação de comprimento de sarcomere pudesse ser computada lá. Dado os deslocamentos associados, é provável que os sarcomeres nesta região alongados durante a fase contraída. De acordo com essa especulação, os comprimentos médios de sarcomere no lado direito do trabecula encurtam durante esse período. Ao combinar as informações fornecidas por cada um dos painéis, parece que a região com a maior área transversal não produz a força mais significativa. Pressuposto de que a variação regional dos transitórios Ca2+ tem um gradiente aproximadamente suave, a Figura 8B indica que a maior amplitude ca2+ transitória ocorre entre 1300 μm e 1600 μm ao longo da trabecula. O mapa de deslocamento indica que a região que sofre menos movimento se alinha bem com o pico Ca2+ transitório. No entanto, essa região possui as menores áreas transversais da amostra. Com esses dados em mente, pode-se inferir que essa região gerou mais estresse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> Figura 1: Imagem anotada do cardiomímetro. Cada um dos principais componentes ópticos é delineado. O inset contém um close-up, retrovisor, do objetivo do microscópio in situ, abaixo da câmara de medição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> Figura 2: Caminho óptico para microscopia de campo brilhante e fluorescência simultânea. A fonte de iluminação para o microscópio de fluorescência é uma lâmpada de arco Xenon, a saída da qual ciclicamente alterna entre 340 nm, 365 nm e 380 nm de luz. O caminho de saída da lâmpada de arco contém um espelhodicróico com um comprimento de onda de 409 nm que reflete a luz UV em um espelho que direciona a luz para um objetivo de microscópio de fluorescência. A lente concentra a luz de excitação na amostra e coleta a luz emitida, que tem um comprimento de onda mais longo de 510 nm. Esta luz emitida passa pelo primeiro espelho dicroico, mas não o segundo, pois tem um comprimento de onda de 552 nm. Uma lente de campo então concentra a luz refletida no sensor do PMT. Enquanto isso, a fonte de iluminação (LED de 660 nm) para o microscópio de campo brilhante está localizada acima da amostra. A luz transmitida é focada na amostra por uma lente condensadora, e o objetivo de fluorescência de 20 × captura a imagem de transmissão resultante. O comprimento de onda usado para iluminação de campo brilhante excede o comprimento de onda de corte de cada espelhodicróico, por isso passa por ambos antes que a imagem seja focada no sensor de uma câmera CMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> Figura 3: Desenho do titular da câmara demedição. (A) Visão isométrica do titular da câmara de medição com caminhos ópticos sobrepostos. A iluminação de Campo Brilhante ocorre a partir da superfície superior(eixo z); a iluminação da fluorescência ocorre a partir da superfície inferior (eixoz),e o sinal oct do braço de medição é ortogonal para o outro eixo de iluminação(y-eixo). Durante o experimento, dois ganchos de platina seguram uma trabecula dentro de um tubo capilar de vidro que funciona como a câmara de medição. Os motores de bobina de voz controlam cada gancho e suas posições são medidas usando interferometria laser. A posição atual é comparada com um set point definido pelo usuário e, usando um controlador PID codificado dentro de um FPGA, o erro é minimizado. (B) Câmara de medição in situ com a iluminação de campo brilhante ligada. A visão traseira é mostrada no inset da Figura 1 . (C) Esquema do fluxo de superfusato através do titular da câmara de medição. O superfusato entra na parte traseira do bloco e flui na direção indicada por setas. Os eletrodos a montante e a jusante estabelecem a estimulação de campo para provocar a contração de uma trabecula montada na câmara de medição. O sombreamento azul indica as regiões onde o superfusato flui durante um experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> Figura 4: Painel frontal do software de aquisição e controle de imagens de imagem. (A) Interface do usuário de imagem Brightfield. (B) Interface de usuário de imagem OCT. (C) Interface de usuário de controle de hardware. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> Figura 5: Dissecção de trabecula e protocolo de montagem. (A) Coração de rato perfusado langendorff na câmara de dissecção. (B) O mesmo coração com a atria removida. Linhas tracejadas indicam a trajetória de excisão para abrir os ventrículos. (C) Um coração aberto para expor o interior de ambos os ventrículos. A caixa tracejada indica a região onde as trabeculas são tipicamente encontradas. (D) Região da parede de ventilação direita excisada (a mesma indicada pela caixa tracejada em C). Linhas tracejadas destacam três trabeculas. (E) Uma trabecula selecionada entre os três em D. (F) O trabecula do painel E com o tecido da parede removido. (G) A trabecula isolada no final de uma seringa de 1 mL. (H) A trabecula na câmara de montagem. (I) A trabecula montada entre dois ganchos de platina. (J) A trabecula, montada entre ganchos, dentro da câmara de medição(Figura 3B). A mancha verde é um artefato do primeiro filtrodicróico. (K) Ângulo secundário da trabecula montada dentro da câmara de medição. A distância entre o trabecula e a lente objetiva do microscópio é de aproximadamente 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> Figura 6: Dependência de posição da medição da força. A força produzida pelo músculo a partir de cada uma das posições de imagem (n = 7) sobreposta. A produção média de força ativa foi de 0,527 mN ± 0,003 mN, tempo de contração de 50 % 77,1 ms ± 0,3 ms, e tempo para 50 % de relaxamento 328,1 ms ± 0,9 ms (todos os dados são apresentados como média ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> Figura 7: Análise de imagem de OCT. (A) Exemplo de segmentação WEKA. A seção transversal segmentada do músculo é destacada em vermelho, e o fundo é destacado em verde. (B) Visão superior dos dados brutos de tomografia C de uma trabecula. A linha angular brilhante em direção ao topo da imagem é o reflexo da parede da câmara de medição. (C) Visão lateral dos dados brutos de tomografia C de uma trabecula. (D) Visão superior dos dados de OCT segmentados. (E) Visão lateral dos dados de OCT segmentados. (F) A área transversal ao longo do comprimento do trabecula(eixo x)através do tempo(y-eixo). A área transversal média ao longo do comprimento muscular foi de 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (média ± S.E.) Umamalha da trabecula. A malha foi aproximadamente alinhada com o enredo de área transversal do painel F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> Figura 8: Análise de imagem de brightfield e fluorescência. (A) Imagem costurada (sete janelas de imagem) da trabecula. (B) Transitórios Ca2+ ao longo do comprimento da trabecula. (C) Deslocamento médio xde cada janela de imagem. Um deslocamento positivo representa um movimento para a direita e negativo para a esquerda. (D) Comprimentos médios de sarcomere de cada janela de imagem que tinham o contraste de imagem necessário. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Tabela de Soluções <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Este protocolo apresenta uma coleção de dados geométricos sarcomere, cálcio e macroscópico de uma trabecula cardíaca ex vivo. Essas medidas simultâneas são possíveis pela integração de três modalidades de imagem.

Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a integração de três sistemas de imagem em um único dispositivo, o que permite uma medição simultânea da função mecânica, dinâmica iônica e mudança geométrica da contração do tecido cardíaco. Especificamente, medimos a produção de força do tecido, transitórios de cálcio, deslocamentos locais e mudança de forma. A combinação dessas modalidades de imagem pode ajudar a responder a perguntas-chave em doenças cardíacas, com grandes implicações para o desenvolvimento de estratégias eficazes de tratamento.A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite estudar a heterogeneidade da atividade muscular. O dispositivo usado neste protocolo contém três sistemas de imagem capazes de fotografar a mesma amostra, um microscópio de campo brilhante, microscópio de fluorescência e um tomografo de coerência óptica. Uma série de espelhosdicróicos são usados para separar a emissão de fluorescência e a imagem de transmissão de campo brilhante.As características fundamentais deste dispositivo são dois ganchos de montagem acionados independentemente, uma câmara de medição com três eixos opticamente claros e uma linha de gatilho externa que sincroniza as câmeras brightfield e OCT com um estimulador. Neste vídeo, demonstramos como isolar, preparar e imaginar trabeculas cardíacas e apresentar alguns resultados representativos. Depois de extirfar um coração de um rato anestesiado, transfira-o para a câmara de dissecção.Usando duas fórceps curvas, puxe a aorta sobre a cânula de perfusão. Mantenha a aorta no lugar com um forcep. Enquanto isso, abra a linha de tubos para permitir que a solução de dissecção flua através da cânula de perfusão.Uma vez que a vasculatura coronária é limpa de sangue e o coração é completamente perfundido com solução de dissecção, proteja a aorta no lugar usando uma sutura. Posicione o coração girando a cânula para que a artéria coronária esquerda seja visível na superfície superior. Fixar o ápice do coração no fundo da câmara de dissecção.Corte os dois atria. Corte ao longo do lado direito do septo para o ápice do coração. Fixar o ventrículo esquerdo aberto na base da câmara de dissecção.Em seguida, cortando ao longo do lado esquerdo do septo, abra o ventrículo direito e fixe-o na base da câmara de dissecção, também. Identifique uma trabecula de execução livre no ventrículo direito. Usando a tesoura de mola e um forcep, corte o tecido da parede ao redor da trabecula.Em seguida, corte o tecido da parede ao meio, ortogonal à direção da trabecula. Corte o tecido da parede até que sua dimensão seja apropriada para a configuração de montagem utilizada. Deixe a trabecula excizada na câmara de dissecção.Lave água quente, água destilada e, em seguida, solução de superfusato através da câmara de medição. Ligue a fonte de luz do microscópio brightfield e pressione f1 para permitir a captura. Ajuste manualmente o gancho a jusante até que esteja centrado na imagem de campo brilhante.Clique em zero eixo a jusante e, em seguida, desabilitar a jusante para habilitar o motor. Mova o controle deslizante de ponto a jusante até que o final do gancho se alinhe com a borda da região padrão de juros. Re-zero o eixo a jusante, em seguida, mova o controle deslizante de setpoint a jusante para 1.000.Repita o processo com o gancho a montante, mas não mova o controle deslizante de setpoint a montante após re-zerar o eixo upstream. Clique em mover para a montagem. Inicie o sistema de iluminação da fluorescência rebocando o interruptor da lâmpada antes de ligar rapidamente os subsistemas do controlador, alternando o interruptor principal.Mude o modo operacional para o em branco turbo pressionando o botão de modo no painel frontal, seguido por dois, depois um. Pressione o botão on-line para ativar o controle externo. Pausa o fluxo de superfusato através da câmara de medição.Encha a câmara de montagem com solução de dissecção. Usando uma seringa de um mililitro, transporte a trabecula da câmara de dissecção para a câmara de montagem. Permita que a trabecula desça na câmara de montagem através da gravidade.Abaixe o nível de fluido na câmara de montagem para que fique nivelado com a seção média dos ganchos. Ajuste a distância entre os ganchos para refletir o comprimento da trabecula movendo o controle deslizante de ponto a jusante. Usando um microscópio para ajudar na visualização, segure levemente um dos pedaços do tecido final com fórceps e monte-o no gancho upstream.Monte o outro pedaço de tecido final no gancho a jusante. Uma vez montado com segurança, mova o trabecula de volta para a câmara de medição pressionando mover-se para câmara e retomar o fluxo de superfusato. Defina a frequência de estímulo para um, duração de estímulo para 10, e tensão de estímulo para 10.Comece a estimulação pressionando o estímulo. Ligue o sistema de iluminação brightfield. Pressione f1 e selecione uma região de interesse que inclua uma área estriada da interface do usuário.Clique no comprimento de sarcomere compute para calcular o comprimento médio de sarcomere na região destacada. Aumente o comprimento muscular até que o comprimento médio do sarcomere seja de aproximadamente 2,32 mícrons. Mova o músculo ajustando o controle do ponto de ajuste central na guia de controle central e de controle de separação para que a borda do gancho a jusante seja apenas visível dentro da imagem de campo brilhante.Colete as informações de fluorescência para 10 contrações. Aumente o valor do ponto central em 200 e colete outros 10 twitches de informações de fluorescência. Repita este processo até que a imagem brightfield contenha o gancho upstream.Colete o valor da janela final de informações de fluorescência. Retorne o trabecula para uma posição central, definindo o valor do ponto central para zero. Reduza a frequência de estímulo para 0,2 Hertz e mude do superfusato K-H para a solução de carregamento Fura-2.Meça o sinal de fluorescência a cada 10 minutos. Visualize o sinal na guia de sinal PMT. Depois que o sinal de 360 nanômetros aumentou em um fator de 10, retorne a frequência de estímulo para um Hertz e mude de volta para a solução de superfusato K-H.Verifique a medição da razão a cada 10 minutos até que o sinal se estabilize, momento em que, a coleta de dados pode começar. Retorne o músculo para a posição onde a borda do gancho a jusante está apenas presente dentro da imagem de campo brilhante. Capturar informações de fluorescência clicando em ativar a fonte de fluorescência.Comece a transmitir dados de hardware. Na interface do usuário de imagem brightfield, defina o modo de captura para o gatilho externo, aumente a taxa de quadros para 100 Hertz e defina o número de imagens para capturar para 100. Pressione o controle-shift-S, seguido pela F1, para registrar os dados de imagem de brightfield para esta janela.Aumente o valor do setpoint central em 200 e repita o processo de captura de brightfield. Continue com o protocolo de digitalização até que os dados de imagem foram coletados para a janela final. Retorne o trabecula para uma posição central, definindo o valor do ponto central para zero.Ligue a fonte de iluminação OCT girando a tecla mestre, pressionando o botão de alimentação, seguido pelo botão SLDs. Cubra a cabeça do galvanômetro e clique em obter fundo para medir o padrão de interferência de fundo e subtrai-lo da medição. Defina o modo de captura de imagem para visualização ao vivo.Centralize o trabecula nos eixos X e Y ajustando os valores de deslocamento X e Y. Com o trabecula centrado, escaneie ao longo do eixo y ajustando a posição Y para encontrar as posições correspondentes aos ganchos rio acima e rio abaixo. Anote essas posições para baixo.Definir o intervalo Y para a diferença absoluta entre esses valores divididos por 10. Defina o modo de captura de imagem como estímulo acionado, alcance X a 100 e clique no botão definir parâmetros ativos. Clique em dados de fluxo e, em seguida, adquira.Para capturar as informações regionais de cálcio e campo brilhante durante toda a extensão da trabecula apresentada aqui, foram necessárias sete posições musculares. Esse número da força média de cada uma das posições sobrepostas sugere que a força do contração não foi perturbada por esse movimento, revelando que não houve dependência de posição do ato de produção de força. Estes scans coletados usando tomografia de coerência óptica a uma taxa de 100 Hertz foram segmentados usando o plugin ImageJ, Weka.Cada seção transversal aparece distorcida devido à diferença entre as resoluções laterais e de profundidade. Isso foi corrigido pelo dimensionamento de cada eixo independentemente com sua respectiva resolução. Depois de escalar o C-scan bruto da trabecula, o músculo é aproximadamente cilíndrico.O reflexo da parede da câmara de medição às vezes pode se sobrepor com os dados musculares, mas o software de segmentação pode ser treinado para explicar isso. Uma vez segmentada, a área transversal ao longo do comprimento do músculo pode ser calculada ao longo da contração. Note que este trabecula em particular tem um pequeno ramo.O movimento do ramo é evidente aproximadamente no meio do trabecula. Finalmente, as imagens segmentadas podem ser convertidas em malhas para auxiliar na construção de modelos geométricos. Dados de imagem capturados em cada uma das sete posições a uma taxa de 100 quadros por segundo foram costurados para criar uma única imagem completa do trabecula.A razão da fluorescência omitida associada à luz de excitação de 340 e 380 nanômetros se correlaciona com o cálcio intracelular após o trabecula ter sido carregado com Fura-2. A média de 10 transitórios intracelulares de cálcio de cada janela estão alinhados com a região em que foram imagens. Enquanto o pico dos transitórios para este trabecula parece razoavelmente consistente, o cálcio diastólico reduziu ao longo de seu comprimento.Da mesma forma, os resultados do rastreamento de deslocamento e dos cálculos de comprimento de sarcomere também indicam a presença de variabilidade regional. A técnica de rastreamento sem marcador usada é capaz de calcular o deslocamento de cada pixel. A adequação das estimativas de comprimento de sarcomere foram testadas com base na largura e amplitude do ajuste gaussiano ao sinal FFT.Essas condições não foram atendidas na região muscular entre zero e 500 mícrons, de modo que nenhuma informação de comprimento de sarcomere poderia ser computada lá. Dado os deslocamentos associados, é provável que os sarcomeres nesta região alongados durante a fase contraitária do contração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar as trabeculas cardíacas e prepará-las para imagens multimodais de forma confiável.Este processo estabelece um caminho para a coleta de um conjunto de dados necessário para a construção de modelos de elementos finitos fisiologicamente informados de contração do tecido cardíaco.

simultaneous-brightfield-fluorescence-optical-coherence-tomographic

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Bioengineering

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