Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando Sistema de Cultura microbiana de microdroplet (MMC)

Este método pode ajudar a resolver os problemas com os métodos convencionais de cultivo microbiano. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e confiável para cultivo microbiano automatizado e evolução adaptativa. Essa tecnologia automatiza as operações e reduz o consumo de mão-de-obra.

E, ao mesmo tempo, tem bom desempenho cultural com resultados confiáveis e operações simples. A tecnologia é utilizada principalmente nos campos de pesquisa de microbiologia, como medição da curva de crescimento, evolução adaptável do laboratório e uma análise multinúvora de um único fator. Inicie os preparativos do experimento conectando a agulha da seringa com um diâmetro interno de 0,41 milímetros e um diâmetro externo de 0,71 milímetros a um conector rápido A e uma garrafa de reagente.

Em seguida, autoclave todo o equipamento a 121 graus Celsius por 15 minutos. Para instalar o chip microfluido, abra a porta da câmara de operação e levante a sonda de fibra óptica. Depois de alinhar os orifícios do campo elétrico com as agulhas, coloque suavemente o chip no pedestal do chip, em seguida, insira as duas colunas de posicionamento nos orifícios de posicionamento e coloque a sonda de fibra óptica.

Em seguida, conecte o conector rápido A no chip à porta correspondente do sistema de cultura microbiana de microdroplet ou MMC de acordo com o número de posição descrito no manuscrito. Quando terminar, feche a porta da câmara de operação. Diluir a suspensa Escherichia coli MG1655 cultivada com o médio para um OD600 de 0,05 a 0,1 para obter 10 mililitros de solução inicial de bactérias.

Para inicializar o MMC, clique na guia Inicialização. Quando a interface de inicialização aparecer, defina a temperatura de cultivo como 37 graus Celsius e o valor do sinal fotoelétrico como 0,6. A inicialização levará cerca de 20 minutos.

Mais tarde, coloque uma garrafa de reagente esterilizada no banco limpo e aperte a tampa. Use uma seringa estéril de 10 mililitros para injetar de três a cinco mililitros de óleo MMC da agulha de seringa ao tubo lateral na garrafa de reagente. Em seguida, incline e gire a garrafa de reagente lentamente para fazer o óleo se infiltrar totalmente na parede interna.

Depois de injetar cinco mililitros de uma solução de bactérias iniciais no frasco, encha a garrafa de reagente injetando de cinco a sete mililitros do óleo MMC. Retire o conector rápido independente A da garrafa de reagente e insira o conector rápido A no conector rápido B da garrafa para completar a operação de injeção de amostra. Uma vez feito, abra a porta da câmara de operação para colocar a garrafa de reagente no banho de metal.

Retire o conector C2 do chip e o conector rápido A da garrafa de reagente. Conecte o conector do tubo lateral da garrafa de reagente ao conector C2 e ao conector superior do tubo ao conector O2. Então feche a porta da câmara de operação.

Para escolher a função de medição da curva de crescimento, clique na Curva de Crescimento na interface de configuração do parâmetro inserindo o número como 15. Em seguida, ligue o interruptor de detecção de OD e defina o comprimento de onda como 600 nanômetros. Clique na guia Iniciar para iniciar a geração de gotículas.

O processo levará 15 minutos para ser concluído. Quando uma janela pop-up aparecer na interface principal, solicitando uma mensagem, abra a porta da câmara de operação para retirar a garrafa de reagente e conectar os conectores C2 e O2. Depois de fechar a porta, clique no botão OK na janela pop-up para cultivar automaticamente as gotículas e detectar os valores de OD.

À medida que a curva de crescimento chega à fase estacionária, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD. Selecione o caminho de salvamento de dados e exporte o valor de OD registrado durante o período de cultivo no formato CVS Para traçar a curva de crescimento, use softwares de mapeamento como Excel e Origin 9.0. Injete volumes necessários da solução inicial de bactérias, meio fresco e óleo MMC nas garrafas de reagente esterilizada separada para a solução inicial de bactérias no meio fresco, como explicado anteriormente.

Para escolher a função de evolução adaptativa, clique em ALE no software. Na interface de configuração do parâmetro, ligue o interruptor de detecção de OD e, em seguida, defina todos os parâmetros descritos no manuscrito e clique na guia Iniciar para iniciar a geração de gotículas. O processo levará cerca de 25 minutos.

Durante cada período de subculto, observe se os valores máximos de OD das gotículas aumentaram significativamente. Se o aumento ocorrer e atender aos requisitos do experimento, clique no botão de exportação de dados para exportar os dados OD. Para extrair as gotículas de destino do MMC, clique na guia de triagem para selecionar a função de extração de gotículas.

Em seguida, escolha a opção Coletar e clique nos números de gotículas de destino. Quando terminar, clique em OK. Espere pela janela pop-up solicitando uma mensagem. Em seguida, coloque o conector rápido CF no tubo de microcentrifuuge para coleta e clique em OK. Depois de um a dois minutos, quando a interface de software aparecerá uma nova janela solicitando uma mensagem, insira o conector rápido CF de volta e clique em OK para fazer o MMC continuar a ser executado.

Quando a gota de destino seguinte atingir o site de reconhecimento de gotículas, colete-a conforme especificado anteriormente. Use uma pipeta de 2,5 microliteres para retirar e coloque a gotícula em uma placa sólida de 90 milímetros, seguida por espalhar a gota uniformemente com uma haste revestida triangular de vidro com um comprimento lateral de três centímetros, em seguida, cultivar a queda em uma incubadora de temperatura constante de 37 graus Celsius por 72 horas. Mais tarde, escolha de três a cinco colônias independentes de bactérias para cultivar cada colônia separadamente em um frasco de 50 mililitros com 10 mililitros de meio fresco em uma incubadora de agitação a 200 rotações por minuto e 37 graus Celsius por 48 a 72 horas.

Após a incubação, siga as normas padrão relacionadas para armazenar a solução de bactérias cultivadas no tubo de glicerol. A análise representativa mostra as curvas de crescimento de 50 gotículas em todo o processo de evolução adaptativa. Observou-se que a cepa Escherichia coli essencial de metanol ou MeSV2.2 apresentou crescimento lento inicial seguido de rápido crescimento.

A curva de crescimento da gotícula seis em todo o processo de evolução adaptativa foi traçada separadamente. O valor máximo de OD600 na primeira geração foi de 0,37, que aumentou para 0,58 no último período de subculto, indicando que a cepa na gotícula seis percebeu uma evolução adaptativa óbvia. Além disso, foram comparadas as curvas de crescimento da cepa de seis gotas e a cepa inicial.

A cepa de seis gotas apresentou uma taxa de crescimento máximo específica mais alta e concentração celular na fase estacionária do que a cepa inicial. O mais importante é garantir que a conexão do chip de instrumento e do frasco de reagente esteja correta, que são as gotículas para que as operações prossigam normalmente. Este método fornece aos pesquisadores uma nova ideia para o cultivo de microrganismos e também fornece plataforma eficiente e de baixo custo para a evolução adaptativa das cepas.