Name: Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprenda a mapear domínios replicativos em cromatina com microscopia eletrônica usando marcação EdU e partículas de Nanogold. Este protocolo preserva a estrutura celular e permite imagens de alta resolução.

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Este trabalho foi apoiado em parte pela RSF (subvenção nº 17-15-01290) e RFBR (subvenção nº 19-015-00273). Os autores agradecem ao programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou Lomonosov (PNR 5.13) e ao Centro de Excelência Nikon em imagens correlativas do Instituto Belozersky de Biologia Físico-Química pelo acesso à instrumentação por imagem.

O protocolo é otimizado para células aderentes e foi testado nas linhas celulares HeLa, HT1080 e CHO.
1. Rotulagem e fixação de células
<ol><li>Células de placa em tampas limpas com ácido em uma placa de Petri de 3 cm. Cultivar as células na mídia recomendadas para a linha celular sendo usada para 70% de confluência.</li>
	<li>Adicione EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) de 10 mM de estoque para 10 μM de concentração final e coloque as células na incubadora por 10 minutos ou mais (dependendo do objetivo do experimento). Para pulsos mais curtos (até 2 minutos), prepare uma placa de Petri com mídia de cultura fresca pré-aquecida complementada com 10 μM EdU, e transfira tampas nele, em vez de adicionar EdU às células diretamente. NOTA: Todas as etapas subsequentes são realizadas à temperatura ambiente, se não for indicada de outra forma.</li>
	<li>Fixar as células rotuladas com glutaraldeído de 2,5%, recém-feito pela diluição de 25% do estoque em tampão de cacodilato de 100 mM, por 1h. NOTA: As etapas subsequentes de detecção do EdU são sensíveis ao tempo de fixação. Tempos de fixação mais longos podem afetar negativamente a rotulagem edu, causando menor relação sinal-ruído.</li>
	<li>Remova o glutaraldeído lavando as amostras com PBS complementado com 5 mM MgCl2 (PBS* posteriormente). Lave três vezes com uma incubação de 10 minutos para cada lavagem.</li>
	<li>Membranas plasmáticas permeabilize com 1% Triton X-100 em PBS* (PBS*T depois disso). Lave duas vezes com uma incubação de 5 minutos para cada lavagem.</li>
	<li>Lave extensivamente a amostra com PBS*. Realize cinco alterações e incubar por 5 minutos em cada alteração.</li>
	<li>Sacie os grupos de aldeído sem resíduos com 40 mM de glycina no PBS*, duas vezes por 10 minutos cada.</li>
	<li>Bloqueie as amostras em 1% de BSA em PBS* por 30 minutos.</li>
</ol>2. Reação de cliques
NOTA: Este procedimento é modificado a partir de um protocolo19 publicado anteriormente.
<ol><li>Imediatamente antes do uso, prepare a mistura de reação de clique para detecção de EdU: em um tubo de microcentrifutura, misturar 430 μL de 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL de 100 mM CuSO4, 1,2 μL de biotin-azide (10 mM em DMSO) e 50 μL de 0,5 M ascor acidbic. Para o controle de qualidade da rotulagem replicativa e procedimento de clique ao nível de microscopia fluorescente, o biotin-azide pode ser substituído por AlexaFluor 488-azide. NOTA: A ordem de adição de componentes na reação acima é importante.</li>
	<li>Realize a reação em uma câmara úmida para minimizar as mudanças de evaporação e concentração no coquetel de reação. Prepare a câmara úmida colocando uma folha molhada de papel filtro na parte inferior da placa de Petri e cobrindo-a com um filme de parafina. Coloque as tampas na superfície do filme com as células voltadas para cima e a camada 50-100 μL do coquetel de reação no deslizamento de cobertura. A reação leva 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pare a reação lavando a amostra em 0,1% Triton X-100 em PBS* (PBS*T), cinco vezes por 5 min cada.</li>
	<li>Bloqueie em 1% de BSA em PBS*T por 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução streptavidin-Nanogold com PBS*T contendo 1% de BSA. Incubar a amostra com streptavidina, conjugada com partículas nanogold de 1,4 nm (Nanoprobes) em 1% BSA + PBS*T durante a noite a +4 °C na câmara úmida recém-preparada.</li>
	<li>Pare a reação e lave a amostra em PBS*T, cinco vezes por 10 min cada.</li>
	<li>Estabilize o complexo de biotina streptavidin por pós-fixação em 1% de glutaraldeído em PBS* por 30 min.</li>
	<li>Remova o glutaraldeído por lavagem intensa com água deionizada e lave a amostra em PBS*, cinco vezes por 20 min cada.</li>
	<li>Sacie grupos de aldeído gratuitos com 1 mg/mL nabh4 em água, duas vezes por 10 min cada. Durante a incubação, são formadas bolhas de H2 que podem levantar as tampas. Empurre-os cuidadosamente para baixo com a pinça.</li>
	<li>Lave com água deionizada cinco vezes por 5 min cada. NOTA: Para o controle de qualidade na etapa de rotulagem, é aconselhável realizar rotulagem de controle com streptavidina fluorescentemente rotulado (Figura 2). Isso forneceria uma estimativa de intensidade de rotulagem e nível de fundo antes de mudar para passos subsequentes tediosos e propensos a artefatos.</li>
</ol>3. Amplificação ag
NOTA: Este procedimento é modificado a partir de Gilerovitch et al., 1995 (ver 20,21).
<ol><li>Resuspend 50 g de pó de acácia em 100 mL de água desionizada. Dissolva por 3 dias, degas e filtre através de quatro camadas de pano de queijo. Armazene as alíquotas congeladas em 5 mL em tubos de 50 mL. Descongele imediatamente antes do uso.</li>
	<li>Adicione 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) a 5 mL de alíquota descongelada de solução em pó de acácia para fazer 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) em solução em pó de acácia. Misture balançando lentamente o tubo por 30 minutos. Enrole o tubo com papel alumínio para proteger da luz.</li>
	<li>Simultaneamente com a etapa 3.2., lave as tampas com tampão de lavagem (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM de sacarose), três vezes por 10 min cada.</li>
	<li>Prepare a nova solução de N-propyl gallate (NPG). Em um tubo de 15 mL, dissolva 10 mg de NPG em 250 μL de 96% de etanol, e ajuste para 5 mL com água deionizada.</li>
	<li>Coloque 36 mg de lactato prateado em um tubo de 15 mL embrulhado em folha.</li>
	<li>Depois do passo 3.2. é concluído, adicione 1,5 mL de solução NPG à mistura de pó de acácia e rocha por mais 3 minutos. NOTA: Todas as etapas subsequentes são realizadas em uma sala escura. Use luz segura não actínica (amarela ou vermelha).</li>
	<li>Equilibre a amostra com tampão de lavagem e vá para a sala escura. Simultaneamente, adicione 5 mL de água deionizada ao lactato prateado e dissolva-se por um tremor vigoroso por 1-2 min.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de solução de lactato prateado à mistura de pó de acácia, a rocha lentamente por 1 min. Evite a formação de bolhas, pois o oxigênio na mistura diminuirá a reação.</li>
	<li>Escorra a solução do prato com tampas e despeje 3 mL de mistura de lactato-acácia de prata nas células. Balance o prato várias vezes e incubar por 2-5 min. O tempo de incubação depende do lote de pó de acácia e da temperatura. Isso deve ser definido experimentalmente. NOTA: Um tempo de incubação mais longo pode resultar em encadernação de prata inespecífica.</li>
	<li>Para parar a reação, escorra a mistura de reação e lave o prato extensivamente com três a cinco mudanças de água desionizada, seguido por mais três mudanças por 5 minutos cada.</li>
	<li>Verifique a mancha sob o microscópio de campo brilhante. Uma boa coloração deve ser clara para marrom escuro com um fundo amarelado muito fraco. NOTA: Se a coloração não estiver se desenvolvendo, é possível repetir imediatamente com a mistura já feita (a mistura está ativa por cerca de 15 minutos se mantida no escuro). No entanto, a coloração neste caso pode se desenvolver muito rápido.</li>
</ol>4. Tonificação de ouro
NOTA: Para proteger as nanopartículas de prata da dissolução pela oxidação de OsO4 nos procedimentos subsequentes, é utilizada uma impregnação com ouro nesta etapa (Sawada, Esaki, 1994)22.
<ol><li>Enxágüe tampas com água desionizada.</li>
	<li>A fim de proteger as nanopartículas de prata da dissolução pela oxidação de OsO4 , incubar as amostras em ácido tetracloroaurico de 0,05% por 2 min no escuro.</li>
	<li>Lave bem com água deionizada por 10 minutos. NOTA: Nesta fase, o contraste adicional é adicionado ao DNA contendo material. A cor da amostra deve mudar de marrom para preto.</li>
</ol>5. ChromEM
NOTA: Este protocolo foi modificado a partir de Ou et al., 201716.
<ol><li>Incubar as tampas e saturar as amostras em 10 μM DRAQ5 em PBS por 10 min no escuro.</li>
	<li>Prepare 0,2% de solução de tetrahidrocloide diaminobenzidina (DAB) em 50 mM Tris ou PBS: dissolver o DAB em 90% do volume final mexendo vigorosamente no escuro, depois ajuste o pH para 7,0-7,4 com NaOH. Ajuste o volume para 100% e filtre através de um filtro de 0,22 μM, armazene embrulhado em papel alumínio.</li>
	<li>Adicione a solução DAB às células (2 mL por placa de Petri de 3 cm) e incubar por 1 min.</li>
	<li>Mova a tampa para o fundo de vidro da placa de Petri e coloque-a no estágio de um microscópio invertido. Irradie a amostra (vários campos de visão) em um microscópio invertido com fonte de luz metal-halide e conjunto de filtro Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 no plano focal) através do Plano Apo λ 40ц (NA = 0,95) lente por 10 minutos. NOTA: Uma indicação de fotoconversão da DAB bem sucedida é a formação completa de fotobleaching DRAQ5 e dab escuro em núcleos irradiados. No entanto, este último nem sempre é aparente sobre o intenso sinal EdU-prata-ouro (especialmente quando pulsos EdU estendidos são utilizados).</li>
	<li>Lave com água deionizada três vezes por 5 min cada.</li>
</ol>6. Desidratação e resina epóxi incorporando
<ol><li>Em um tubo de microcentrifuge, prepare a solução de tetraóxido de ódio parcialmente reduzida misturando 2% de solução aquosa de K4Fe(CN)6 com uma quantidade igual de 2% de solução aquosa de OsO4, para obter 1% de concentração final de ambos os componentes. Incubar tampas em OsO4 reduzidos por 1h e lavar em água deionizada três vezes por 5 min cada. NOTA: Nesta fase, o composto de ósmio reduzido reage com deposições DAB e aumenta o contraste do DNA. ATENÇÃO: O ósmio é tóxico, trabalha sob um capô de fumaça e lida com resíduos de acordo com as normas locais de segurança.</li>
	<li>Desidratar as amostras em uma série de soluções de etanol classificados em percentuais crescentes: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.</li>
	<li>Para infiltração e incorporação use a fórmula de resina com a razão volumosa do componente da seguinte forma: monômero de resina epóxi:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Esta fórmula é miscible com etanol.<ol>
<li>Incubar o deslizamento de cobertura no mix etanol-resina (3 partes 100% EtOH:1 parte resina epóxi) por 30 min.</li>
		<li>Incubar a tampa no mix etanol-resina (1 parte 100% EtOH:1 parte resina epóxi) por 2 h.</li>
		<li>Incubar o deslizamento de cobertura no mix etanol-resina (1 parte 100% EtOH:3 partes epóxi resina) durante a noite.</li>
		<li>Substitua a mistura etanol-resina por resina pura recém-preparada. Incubar em mistura de resina pura por 8 h. Abra o prato para deixar os restos de etanol evaporarem.</li>
		<li>Transfira as tampas em um novo prato com resina pura e incubar por 2h a 37-42 °C.</li>
		<li>Encha um molde de silicone com resina recém preparada. Coloque as tampas com as células voltadas para baixo no molde de silício apropriado preenchido com resina epóxi. Cure a resina por 24h a 37 °C, depois a 60 °C por pelo menos 2 dias. ATENÇÃO: Os componentes da mistura de resina epóxi são potenciais cancerígenos. Use luvas e trabalhe sob o capô da fumaça.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a laje de resina do molde, limpe a superfície da mancha com o bisturi ou lâmina de barbear. Para remover a mancha de cobertura, solte a mancha de cobertura em nitrogênio líquido e, em seguida, transfira a laje para a água fervente. Repita se necessário.</li>
	<li>Localize a área irradiada sob um estereómico e corte-a da laje com uma serra de corte ou qualquer outro instrumento adequado. Pré-aqueça a laje a 70 °C em uma placa quente, se necessário.</li>
	<li>Fixe o recorte em um suporte de amostra ultramicrotome para aparamento final do bloco. Usando a navalha, prepare a amostra em forma de pirâmide. Monte o suporte com pirâmide no ultramicroome e instale a faca.<ol>
<li>Corte o bloco para que as células irradiadas com etiqueta EdU estejam incluídas. Prepare uma seção semifina (250 nm de espessura) adequada para tomografia eletrônica. NOTA: A espessura da seção pode ser ajustada para atender aos requisitos experimentais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desprender a seção da borda da faca e colocá-los nas grades de um único slot. Para a tomografia eletrônica, seções de 250 nm são colhidas em grades de um único slot de 1 mm e após a secagem dessas seções podem ser revestidas de carbono de ambos os lados. Não é necessário contraste adicional. NOTA: Como as seções já contêm partículas Au-Ag de alto contraste, não há necessidade de adicionar partículas de ouro fiduciário à superfície da seção.</li>
	<li>Examine as redes em um microscópio eletrônico de transmissão em baixa ampliação (cerca de 600x) para localizar as células com padrões de replicação apropriados. NOTA: Este protocolo gera densidade de rotulagem alta o suficiente para fácil detecção de focos de replicação mesmo em baixa ampliação. É aconselhável primeiro criar um mapa da seção para posterior navegação e coleta de projeções angulares para tomografia. Mude para uma ampliação mais alta e pegue imagens de alta resolução.</li>
</ol>7. Tomografia eletrônica
<ol><li>Insira a grade no microscópio eletrônico de transmissão com um suporte de alta inclinação. Carregue a amostra no microscópio eletrônico e localize a região de interesse.</li>
	<li>Alinhe o microscópio no modo EFTEM no modo de iluminação quase paralelo. Sintonize o filtro de energia com 20 eV de seleção de energia colocado no pico de perda zero.</li>
	<li>Pré-irradie a área de aquisição da tomografia a uma taxa de dose de 40 e/Å2/s por pelo menos 1,5-2 min, o que corresponde à dose total de pelo menos 3000 e/Å2.</li>
	<li>Ajuste a altura eucêntrica com a tarefa automática no SerialEM. Verifique a tarefa de foco automático para garantir que ele esteja funcionando corretamente em ângulo de inclinação zero e -0,8 mkm de valor de desfoco de destino.</li>
	<li>Incline o suporte da amostra para -60° com a tarefa Walk-Up.</li>
	<li>Configure a aquisição da tomografia de -60 a +60° com etapa 2.0°. A exposição deve ser definida dependendo do ângulo de inclinação para manter a intensidade média na câmera. Limitar a mudança de imagem no caso de causar uma mudança de energia e, assim, cortar o desalinhamento. Os dados da tomografia devem ser salvos como arquivo .mrc.</li>
	<li>Importe o arquivo .mrc em software IMOD para reconstrução da tomografia. Remova os valores de pixels outlier devido aos raios-X.</li>
	<li>Alinhe a série de inclinação. Realize a correlação cruzada inicial, em seguida, marque manualmente 10-12 partículas de ouro como fiduciais. Rastreie o modelo fiduciário e inspecione se cada fiduciário é rastreado corretamente através da série de inclinação. Crie tomogramas de amostra (fatias) e marque manualmente as bordas finas da seção para evitar a possível inclinação da densidade reconstruída dentro do volume. O erro residual médio para alinhamento de multa foi inferior a 1,2 pix.</li>
	<li>Reconstrua o tomograma com um algoritmo de projeção de costas filtrado e, em seguida, corte a saída para encaixar a região de interesse no volume final.</li>
</ol>

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<li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li>
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<li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed%2C+Epon-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

O método descrito aqui tem várias vantagens em relação aos protocolos publicados anteriormente. Primeiro, o uso de Click-química para rotular DNA replicado elimina a necessidade de pré-requisito de desnaturação de DNA para detecção de BrdU com anticorpos, preservando assim melhor a ultraestrutura de cromatina. 
Em segundo lugar, a utilização da biotina como um ligante secundário que é gerado após a fixação do glutaraldeído e a sacieciação adequada de grupos de aldeído desvinculados minimiza a ...

A replicação do DNA é um processo biológico básico necessário para cópia e transmissão fiel das informações genéticas durante a divisão celular. Em eucariotes mais altos, a replicação de DNA é submetida a uma regulação espátula-temporal apertada, que se manifesta na ativação sequencial das origens de replicação1. Origens de replicação vizinhas disparando sincronizadamente formam aglomerados de replicons2. Ao nível da microscopia óptica, locais de replicação contínua de DNA são detectados como focos de replicação de vários números e tamanhos. Os focos de replicação exibem padrões específicos de distribuição espacial dentro do núcleo celular, dependendo do tempo de replicação do DNArotulado 3,4, que, por sua vez, está fortemente correlacionado com sua atividade genética. Graças à sequência bem definida de replicação de DNA, estritamente ordenada no espaço e no tempo, a rotulagem replicativa é um método poderoso de rotulagem precisa de DNA não apenas para o estudo do processo de replicação em si, mas também para discriminar uma sub fração de DNA específica com atividade de transcrição definida e nível de compactação. A visualização da cromatina replicante é geralmente realizada através da detecção de componentes proteicos principais de máquinas de replicação de DNA (seja por imunostaining ou por expressão de marcas de proteína fluorescente 5,6) ou pela incorporação de precursores de síntese de DNA modificados 7,8,9,10 . Destes, apenas métodos baseados na incorporação de nucleotídeos modificados em DNA recém-replicado permitem a captura de alterações conformais na cromatina durante a replicação, e traçam o comportamento dos domínios replicativos após sua replicação ser concluída.
Em eucariotes mais altos, a embalagem de DNA em cromatina adiciona outro nível de complexidade à regulação de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, reparação, etc.). A dobra de cromatina afeta a acessibilidade do DNA a fatores transregulatórios e alterações conformais de DNA (duplo desenrolar de hélice) necessárias para a síntese do modelo. Portanto, é geralmente aceito que processos sintéticos dependentes de DNA no núcleo celular requerem uma transição estrutural da cromatina de seu estado condensado e repressivo para uma conformação mais acessível e aberta. Citologicamente, esses dois estados de cromatina são definidos como heterocromatina e eucromatina. No entanto, ainda não há consenso sobre o modo de dobramento de DNA no núcleo. As hipóteses variam de um modelo11 de "derretimento de polímeros", onde a fibra nucleosômica se comporta como um polímero aleatório para o qual a densidade de embalagem é controlada por mecanismos de separação de fase, até modelos hierárquicos dobráveis postulando formação sequencial de estruturas de fibras de cromatina de espessura crescente12,13. Modelos hierárquicos dobráveis recentemente ganharam apoio de abordagens moleculares com base na análise de contatos in situ DNA-DNA (captura de conformação cromossomo, 3C), demonstrando a existência da hierarquia dos domínios estruturais da cromatina14. É importante notar que as unidades de replicação se correlacionam muito bem com esses domínios de cromatina15. A maior crítica desses modelos baseia-se na potencial agregação artificial de cromatina causada por procedimentos de preparação de amostras, como permeabilização de membranas celulares e remoção de componentes não cromatinas, a fim de melhorar o contraste da cromatina para estudos ultraestruturais, melhorando a acessibilidade da cromatina para várias sondas (por exemplo, anticorpos). Os recentes avanços técnicos na coloração seletiva de DNA para microscopia eletrônica por foto-oxidação mediada por fluoroforino mediado pelo DNA de diaminobenzidina (ChromEMT6) permitiram a eliminação deste obstáculo. No entanto, as mesmas considerações são verdadeiras para a visualização da microscopia eletrônica da replicação do DNA17,18. Aqui descrevemos uma técnica que permite o mapeamento ultraestrutural de alta resolução simultânea do DNA recém-sintetizado e cromatina total em células intactas cruzadas de aldeído. A técnica combina a detecção de DNA rotulado pela EdU por click-química com sondas biotiniladas e streptavidin-Nanogold, e ChromEMT.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfônico 2-(4-morfolino)etano (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-azida</td><td>Termo Fisher</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>biotina-azida</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td></td><td></td> Monômero de resina epóxi SPI-CHEM 90529-77-4 Glutaraldeído <td></td></tr><tr><td>(25%, grau EM)</td> <td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goma arábica</td><td>ACROS Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Galato de N-propila</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de prata</td><td>ALDRICH</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-AlexaFluor 488 conjugado</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado estreptavidina-nanoouro</td><td>Nanoprobes</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>ácido tetracloroáurico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano (Tris)</td> <td>CHEM-IMPEX INT'L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper grades de slot único</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 conjunto de filtros de fluorescência (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Faca de diamante Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>Alternativas: Ted Pella</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Suporte de amostra de alta inclinação</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão operando a 200 kV no modo EFTEM, com goniômetro de alta inclinação</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>Alternativas: FEI, Hitachi</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Ted Pella</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica</td><td>UltraCut-E</td><td>Alternativas: RMC</td></tr><tr><td>SoftwareAquisição de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>imagem</td><td>Open Source</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>Processamento de imagem</td> Open <td>Source</td><td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

domínios replicativos de imagem em cromatina ultraestruturalmente preservada por tomografia eletrônica

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Os princípios de dobramento do DNA no núcleo celular e suas transformações dinâmicas que ocorrem durante o cumprimento de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, segregação, etc.) permanecem mal compreendidos, em parte devido à falta de abordagens experimentais para visualização de alta resolução de locis de cromatina específica em núcleos estruturalmente preservados. Aqui apresentamos um protocolo para a visualização de domínios replicativos na cultura de células monocamadas in situ, combinando rotulagem EdU de DNA recém-sintetizado com posterior detecção de rótulo com amplificação ag de partículas nanogold e coloração chromEM de cromatina. Este protocolo permite a rotulagem pré-incorporação de alto contraste e alta eficiência, compatível com a fixação tradicional de glutaraldeído que fornece a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Outra vantagem da rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de pré-selecionar células de interesse para secção. Isso é especialmente importante para a análise de populações de células heterogêneas, bem como compatibilidade com abordagens de tomografia eletrônica para análise 3D de alta resolução da organização cromatina em locais de replicação, e a análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina e da segregação cromátide irmã na interfase.

Os focos de replicação nos núcleos de células mamíferas apresentam padrões distintos de distribuição dentro do núcleo, dependendo da progressão da fase S. Esses padrões se correlacionam com a atividade transcricional do loci sendo replicado. Uma vez que o método aqui apresentado utiliza um procedimento de fixação bastante forte, é bastante simples o uso de rotulagem de pulso replicativo para detecção específica de cromatina loci em vários estados transcricionais, mesmo em condições que oferecem melhor preservação estrutu...

Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.

Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Apresentamos um protocolo para a visualização microscópica eletrônica dos domínios replicativos na célula pela rotulagem EdU do DNA recém-sintetizado e detecção de rótulos com aprimoramento de prata de partículas nanogold e coloração chromEM da cromatina. Este protocolo dá a rotulagem pré-incorporação de alto contraste com fixação tradicional de glutaraldeído que dá a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Este protocolo é otimizado para a célula de adesão que cresce nas tampas na placa de Petri.Adicione EdU a 10 micro mols de concentração final e coloque as células na incubadora para o tempo de rotulagem desejado. Fixar as células rotuladas com 2,5% de gluaradehidrato em uma solução de cacodilato de sódio de 100 milimoles por uma hora. O tempo de fixação mais longo pode afetar negativamente a rotulagem EdU.Remova o glutaraldeído enxaguando as amostras com PBS suplementada com cinco milimóculos de cloreto de magnésio, ainda mais considerada como estrela pbs. Lave três vezes por 10 minutos. Membranas plasmáticas permeabilize com 1% de solução de Trione X-100 na estrela PBS, fazem duas alterações por cinco minutos cada.Esta solução é ainda referida como PBS star T.Lavagem extensivamente a amostra com estrela PBS. Cinco mudanças por cinco minutos cada. Sacie os grupos de aldeídos residuais com 20 milmoles de glicina na estrela PBS, duas vezes por 10 minutos.Coloque a amostra na estrela PBS com 1%BSA por meia hora. Durante o bloqueio na BSA, prepare o coquetel de reação para detecção da EdU. A ordem de adição de componentes é importante.A conjugação de biotina-azida da EdU é realizada na câmara úmida para minimizar as mudanças de evaporação e concentração no coquetel de reação. Prepare a câmara úmida. Coloque a mancha de cobertura no para-filme com uma célula voltada para cima e camada 50 a 100 microliters do coquetel de reação no deslizamento de tampas.A reação leva 30 minutos à temperatura ambiente. Pare a reação lavando a amostra na estrela PBS T, cinco vezes por cinco minutos cada. Bloqueie novamente com 1%BSA na estrela PBS T por mais meia hora.Prepare a solução streptavidin-Nanogold na estrela PBS T com 1%BSA. Incubar a amostra com streptavidin durante a noite a mais quatro graus em uma câmara úmida recém-preparada. O procedimento é o mesmo da conjugação de biotina-azida da EdU.Pare a reação e lave a amostra, cinco vezes por 10 minutos cada um com o complexo de estreptavidina de biotina da estrela PBS T.Stabilize por fixação adicional será 1%glutaraldeído PBS estrela por meia hora. Remova o glutaraldeído por lavagem intensa com água deionizada. Saciar grupos de aldeído residual com um miligrama por mililitro de sódio boroidido.Lave bem de novo. O próximo passo é aumentar o tamanho das partículas nanogold por meio de deposição de prata no curso dourado. Prepare as pré-misturas para minimizar a atividade do quarto escuro.Equilibre as amostras com tampão de lavagem e vá para uma sala escura. Na sala escura misture os componentes para preparar a solução de lavagem e aplicá-la nas amostras. A solução de pó de acácia é altamente visículos.Assim, durante a mistura dos componentes, balance o tubo lentamente para evitar a formação de bolhas e espuma. A reação leva de dois a cinco minutos. Recomendamos realizar um teste para determinar o tempo ideal de reação.O tempo de incubação mais longo pode resultar em um depoimento de prata inespecífico. Para parar a reação, enxágue rapidamente a amostra com três a cinco alterações da água deionizada. Seguido por mais três mudanças por cinco minutos cada.Para proteger as nanopartículas de prata da dissolução pelo tetroxida de ósmio, incubar as amostras em ácido tetracloroaurico de 0,05% durante dois minutos no escuro. Lave bem com água deionizada. Nesta fase, é adicionado contraste adicional ao DNA contendo material.Saturar a amostra com a mancha de DNA DRAQ5. Adicione a solução de diamionobenzidina à amostra e incubar por um minuto. Mova a tampa para a placa de petri de fundo de vidro, e coloque-a no palco do microscópio invertido.Irradiar vários campos de visão com 640 nanômetros de luz vermelha. O painel esquerdo mostra o branqueamento completo da foto do DRAQ5. No painel direito, o mesmo campo de visão é visualizado na luz transmitida mostrando precipitação DAB.Lave amostras com água deionizada. A próxima etapa deve ser realizada sob o capô da fumaça. Preparado parcialmente reduzido solução de tetroxida de ósmio.Tenha cuidado. Esta substância é altamente volátil e tóxica. Aplique a solução preparada na amostra.Nesta fase, os compostos de ósmio reduzidos reagem com depoimentos de diamionobenzidina e aumentam o contraste do DNA. Descarte a solução de contenção de ósmio de acordo com a regulamentação local e lave amostras três vezes por cinco minutos cada. A amostra é ainda mais desidratada em uma série de concentrações crescentes de etanol seguida pela infiltração das células com misturas de resina de etanol.Substitua a mistura de resina alcoólica por resina pura recém-preparada. Encha o molde de incorporação de tamanho adequado com uma resina recém-preparada. Coloque a mancha de cobertura com uma célula voltada para baixo sobre a cavidade preenchida com resina.Cure a resina por 24 horas a 37 graus. Em seguida, a 60 graus por pelo menos dois dias. Remova a resina de uma superfície inferior de uma tampa.Deixe a laje em um nitrogênio líquido e depois transfira para água fervente. O vidro deve se soltar. Repita se necessário.Os campos de visão irradiados devem ser claramente visíveis devido à deposição diamionobenzidina e à coloração da DAB. Retire a área de interesse da laje usando a serra de corte ou qualquer outro instrumento adequado. Coloque o recorte no suporte simples ultramicroome.Configure o ultramicrotome para aparamento final do bloco. Usando a lâmina de barbear, prepare o pillet em forma de pirâmide. O tamanho de uma área plana no topo da pirâmide deve ser de cerca de 400 por 200 mícrons.Monte a pirâmide preparada no braço ultramicroome e instale a faca. Prepare as seções. A espessura da seção pode ser ajustada para atender aos requisitos experimentais.Nosso objetivo é a tomografia EM. Então preparamos seções com uma espessura de 250 nanômetros também referidas como seções semifinas. Retire as seções da borda da faca e monte-as em uma grade de ranhura.Usamos uma grade de ranhura, eles estavam em torno de um milímetro para estar ao redor, uma abertura lateral milimétrica. O pequeno tamanho de abertura proporciona melhor estabilidade das seções. Deixe as amostras secarem na rede.Neste momento, as seções estão prontas para observação. Coloque a grade no suporte da amostra do microscópio eletrônico. Coloque a amostra no microscópio eletrônico.Adquira séries de inclinação. Os focos de replicação nos núcleos de células mamíferas apresentam padrões distintos de distribuição dependendo da progressão da fase S. A rotulagem edu bem sucedida confirmada pela reação de clique com azida fluorescentemente rotulada demonstra padrão típico de replicação na população de células heterogêneas após a fixação de glutaraldeído no topo.A rotulagem de streptavidina pode ser influenciada por glutaraldeído. Então primeiro verifique a fluorescência streptavidin manchando sob a mesma condição que streptavidin nanogold na parte inferior. O bom resultado do procedimento de melhorias de prata é uma coloração marrom escura de alguns núcleos e uma mancha de citoplasto amarelo muito desmaio, mostrada na parte inferior.A vantagem de uma rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de selecionar células para a secção. É possível nesta fase porque os padrões de rotulagem se tornam visíveis sob um microscópio de campo brilhante. A rotulagem apropriada resulta nos locais de replicação bem demarcados.Arrowhead mostrar o DAB manchado fibras de cromatina. A rotulagem de fundo à direita é limitada a algumas nanopartículas por mícndo quadrado. Seções semifinas estão prontas para tomografia e não requerem adição de nanopartículas de ouro.A abordagem descrita utilizada para os estudos da organização da cromatina em locais com replicação habilitada. Para análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina, incluindo imagens de alta resolução da segregação da cromatina. Também foi usado para rotulagem replicada de grandes domínios cromossômicos e estudos de dobra de cromatina de ordem superior e heterocromatina.Essa técnica de imagem também é importante como ponto de referência para os dados gerados por outras abordagens não microscópicas. O método também pode ser acomodado em estudos microscópicos correlacionados, incluindo técnicas de super resolução. Isso abre novos horizontes em estudos da estrutura de ordem superior da cromatina e sua dinâmica nos vários estados fisiológicos da célula.

imaging-replicative-domains-ultrastructurally-preserved-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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