Dor induzida por lesões de queimadura e comportamento semelhante à depressão em camundongos
September 29th, 2021
Uma lesão escalda transitória (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) de uma pata traseira diminui o limiar (g) para a estimulação de filamento von Frey do lado ipsilateral e altera o padrão de marcha. Além disso, a lesão por queimadura induz o comportamento depressivo no teste de natação forçada.
Este protocolo é adequado para pesquisas sobre os diversos aspectos e os resultados da dor de queimadura e seu tratamento, e espera-se que traga informações importantes para este campo de pesquisa. Este protocolo estabelece um modelo animal queimado induzido pela água quente e propõe um método para medir dor relacionada, distúrbios de marcha e respostas comportamentais semelhantes à depressão. Demonstrando o procedimento estará Jaehyuk Kim, um estudante de mestrado no laboratório do Dr. Kim.
Para começar, abriga os ratos machos ICR pesando de 20 a 25 gramas em uma sala controlada por luz e temperatura. Permita que os ratos tenham acesso gratuito a comida e água e aclimatar por pelo menos uma semana antes do início do experimento. Após uma semana, atribua os ratos aleatoriamente ao grupo experimental ou controle e use números de animais como códigos para a realização de experimentos cegos.
Antes de realizar a indução de queimadura, use um vestido cirúrgico, luvas e máscara. Em seguida, depois de anestesiar profundamente o rato, desinfete ao redor da pata traseira direita com 70% de etanol e aplique uma pomada oftalmômica nos olhos para evitar a secagem da córnea, em seguida, faça uma marca no tornozelo de cada rato e mergulhe a pata traseira direita em água quente a 65 graus Celsius por três segundos. Após a lesão da queimadura, coloque o rato em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa até que ele se recupere da anestesia.
Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e deixe-os aclimatar por pelo menos 30 minutos antes do teste. Enquanto os ratos se aclimatam, coloque um vestido cirúrgico, luvas e máscara. Em seguida, coloque os ratos em uma caixa quadrada em um piso de malha de metal e deixe-os aclimatar por mais 30 minutos.
Em seguida, para avaliar o limiar mecânico da pata traseira usando o método de estímulo ascendente, pique suavemente a pata com uma série de filamentos Von Frey em intervalos de cinco a oito segundos para estimular o plantar traseiro. Realize cinco ensaios para avaliar limiares mecânicos para cada pata traseira ipsilateral. Para análise de marcha, aclimatar os camundongos no sistema de análise de marcha diariamente por 10 a 15 minutos, começando cinco dias antes da lesão da queimadura.
No dia do teste, depois de usar vestido cirúrgico, luvas e máscara, leve os ratos para a sala de teste comportamental e deixe-os aclimatar por 30 minutos antes do teste, em seguida, iniciar o programa de análise de marcha e clicar no novo menu de experimento para designar a pasta para salvar os dados. Após a designação, defina o tempo máximo de execução para cinco segundos e as variações máximas de velocidade permitidas para 50% Em seguida, na guia de configuração do programa, selecione uma câmera registrada e defina o comprimento da passarela para 30 centímetros. Em seguida, na guia adquirida do menu do programa, selecione a aquisição aberta e com base nas mensagens de status, clique no botão de fundo snap para adquirir uma imagem de fundo de uma passarela vazia.
Em seguida, clique no botão de aquisição iniciar e coloque o mouse na entrada da passarela transversível esquerda/direita. A gravação começará automaticamente após a livre circulação do mouse. Após uma gravação bem-sucedida, selecione classificar corridas a partir da guia adquirida do menu do programa e selecione a execução a ser analisada e clique no botão de classificação automática.
Após a classificação automática ser concluída, remova o nariz, o reconhecimento genital e o equívoco das patas para os dados de lixo em cada execução e, em seguida, analise os dados. Após um período de aclimatação de 30 minutos na sala de teste comportamental, coloque o mouse em um cilindro plexiglas claro contendo 15 centímetros de água por 15 minutos. No dia seguinte, coloque o rato no cilindro novamente sob as mesmas condições e meça o tempo de imobilidade, que é quando o rato pára de subir ou nadar e apenas flutua com a cabeça acima da superfície da água.
Em seguida, para medir a função motora normal, coloque o animal em uma plataforma cilíndrica de rolamento suspensa 16 centímetros acima da parte inferior do aparelho. Antes de induzir lesões de queimadura, permita que os ratos treinem uma vez por dia na rotarod por pelo menos cinco dias. Após a administração de drogas, realize um teste rotarod a cada 20 minutos por duas horas com um tempo de corte de dois minutos.
Meça a duração do tempo que o mouse corre em uma haste giratória na velocidade constante de 15 rotações por minuto sem cair. O limiar de retirada da pata de camundongos induzidos por queimaduras diminuiu após o primeiro dia e foi mantido por sete dias em comparação com o grupo controle. A administração de acetaminofeno reduziu significativamente a diminuição induzida por queimaduras no limiar de retirada da pata.
Além disso, a área sob a análise da curva mostrou que a administração de acetaminofeno diminuiu significativamente a aodínia mecânica induzida por lesões por queimaduras. A área de impressão da pata traseira também reduziu significativamente após a indução da queimadura e persistiu por sete dias. A administração de acetaminofeno melhorou significativamente a área de impressão da pata traseira em comparação com o tratamento do veículo.
Além disso, a lesão por queimadura reduziu a postura única da pata traseira ipsilateral após o primeiro dia e essa redução foi mantida por sete dias. A posição de pata traseira foi melhorada pela administração do acetaminofeno. No teste de natação forçada, os tempos de imobilidade dos camundongos induzidos por queimaduras foram aumentados sete dias após a lesão em comparação com os do grupo controle.
A administração de acetaminofeno reduziu significativamente o aumento induzido por queimaduras no tempo de imobilidade. No teste rotarod, os tempos de execução dos camundongos induzidos por queimaduras foram semelhantes aos do grupo controle sete dias após a indução da queimadura. Em contraste, os tempos de funcionamento dos camundongos tratados com alfaxolone foram significativamente reduzidos em cerca de 60 minutos, indicando que este método de lesão por queimadura não causa prejuízo motor.
A extensão da queimadura aplicada a cada animal deve ser mantida constante para obter resultados precisos. Os vários métodos de análise experimental comportamental propostos neste estudo também podem ser aplicados a outros modelos animais relacionados à dor, perturbação da marcha e comportamento semelhante à depressão. Os métodos de análise propostos podem quantificar vários sintomas após a indução de lesão por queimadura, o que será útil para o desenvolvimento de métodos de pesquisa e tratamento relacionados à queimadura no futuro.
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Visão Geral
Este estudo investiga os efeitos de uma lesão por queimadura induzida por água quente na resposta à dor, distúrbio de marcha e comportamentos semelhantes à depressão em camundongos ICR. Um método é estabelecido para avaliar esses resultados após uma lesão por queimadura transitória. As principais descobertas destacam a redução no limiar mecânico e deterioração nos padrões de marcha, bem como a indução de comportamento semelhante à depressão após a lesão.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Pesquisa sobre Dor
Fundo
- As queimaduras podem alterar tanto os estados de saúde física quanto mental.
- Avaliações da dor e mudanças comportamentais são cruciais para entender os impactos das lesões por queimadura.
- Os modelos existentes fornecem uma análise insuficiente dos resultados comportamentais específicos para lesões por queimadura.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um modelo de lesão por queimadura para investigar a dor e as mudanças comportamentais associadas.
- Avaliar a eficácia de tratamentos, como o paracetamol, na mitigação dos sintomas induzidos por queimaduras.
- Analisar alterações nos limiares mecânicos, marcha e comportamento depressivo após a lesão.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza um modelo animal de camundongos ICR submetidos a uma lesão por queimadura.
- Uma lesão por queimadura com água quente padronizada a 65 °C por 3 segundos é conduzida.
- As avaliações principais incluem estimulação com filamento von Frey, análise de marcha e testes de natação forçada.
- Os camundongos são aclimatizados e vários testes comportamentais são conduzidos antes e após a indução da queimadura ao longo de vários dias.
Principais Resultados
- A lesão por queimadura causou uma diminuição significativa nos limiares de retirada da pata sustentada por sete dias.
- A administração de paracetamol mitigou significativamente a diminuição da alodinia mecânica e melhorou os parâmetros de marcha.
- As avaliações comportamentais, como o aumento do tempo de imobilidade no teste de natação forçada, indicam comportamento semelhante à depressão após a lesão.
- O método não demonstrou comprometimento motor significativo apesar das mudanças comportamentais observadas.
Conclusões
- Este estudo estabelece efetivamente um modelo para avaliar lesões por queimadura e respostas à dor associadas em camundongos.
- Destaca o potencial de usar ensaios comportamentais para avaliar tratamentos para dor e resultados relacionados à depressão.
- Os resultados oferecem insights para entender os mecanismos neurobiológicos subjacentes à dor e depressão após lesões físicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This burn injury model enables mechanistic de-risking of analgesic and antidepressant candidates by quantifying pain, gait, and affective phenotypes in a disease-relevant system. It supports target validation through behavioral readouts that reflect clinical sequelae of burn trauma, informing early go/no-go decisions. The model enhances predictive confidence in preclinical screening by linking physical injury to comorbid depression-like behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking peripheral injury to central affective states via measurable pain and depression-like endpoints.
- Operational Value: Provides standardized behavioral assays (von Frey, forced swim, gait analysis) for consistent target engagement assessment across compounds.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate both nociceptive and mood-related pathways post-injury.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, longitudinal data on mechanical allodynia and immobility time for dose-response and efficacy profiling.
- Operational Value: Establishes reproducible protocols for gait and pain testing that enable high-throughput screening readiness.
- Assay Standardization: Uses blinded, acclimatized testing conditions to minimize variability and support cross-study comparability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Models comorbid pain and depression observed in burn patients, enabling study of dual-indication therapeutics.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement by demonstrating sustained behavioral changes over seven days post-injury.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of target modulation on both somatic and affective dimensions of injury response.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy validation, particularly for CNS-potent analgesics with mood-modulating properties.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targets involved in neuroimmune signaling and central sensitization following tissue injury.
- Screening: Enables assay readiness through standardized von Frey and gait analysis outputs that quantify hypersensitivity and motor function.
- Analytics: Provides longitudinal readouts (paw withdrawal threshold, immobility time, print area) for comparing treatment effects across timepoints.
- Translational Research: Aligns with clinical pain-depression comorbidity, supporting biomarker-linked advancement decisions.
- Enterprise Reuse: The behavioral testing framework can be reused across pain, neuropathy, and depression models, increasing platform utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic insight into burn-induced central changes, reducing ambiguity in target phenotype relationships.
- Operational Value: Standardized behavioral testing improves reproducibility and reduces variability in efficacy assessments.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by capturing dual-domain efficacy, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds with demonstrated effects on both pain and depression-like endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent behavioral testing, anesthesia, and burn injury techniques.
- Dependent on calibrated thermal control systems and video-based gait analysis instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of acclimatization, blinding, and testing timelines.
- Must account for species-specific responses when translating findings across model systems.
- Practical limitation: Burn extent must be tightly controlled to ensure data accuracy, as noted in source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Induction of Scalding Burn Injury on the Hind Paw
1:43
Measurement of Mechanical Allodynia and Automated Gait Analysis
3:49
Measurement of Depression-Like Behavior and Normal Motor Function
4:45
Results: Mechanical Allodynia, Gait Analysis, and Depression-Like Behavior in Burn Injury-Induced Mice
6:23
Conclusion
