Name: Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda a induzir expressão gênica com luz azul em embriões de zebrafish usando o sistema optogenético TAEL/C120. Este método oferece controle espacial e temporal preciso para estudos de função gênica in vivo.

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Agradecemos a Stefan Materna e aos membros dos laboratórios Woo e Materna por sugestões úteis e comentários sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena por valiosas discussões e insights enquanto desenvolvem este protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH; R03 DK106358) e o Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia (CRN-20-636896) para s.W.

Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia Merced.
1. Travessia de zebrafish e coleta de embriões
<ol><li>Mantenha linhas separadas de zebrafish transgênicos contendo o ativador transcricional TAEL ou o gene repórter controlado pelo C120 para minimizar a ativação espúria.</li>
	<li>Cruze 6-8 zebrafish adultos de cada linha usando métodos padrão9 para produzir embriões transgênicos duplos que contêm os componentes TAEL e C120(Figura 1B). NOTA: Alternativamente, ambos os componentes podem ser expressos transitoriamente através de microinjeção de mRNA ou DNA plasmídeo usando métodos padrão10.</li>
	<li>Coletar embriões em placas de Petri contendo água de ovo (60 μg/mL Sal marinho do Oceano Instantâneo dissolvido em água destilada), com aproximadamente 30 embriões por condição a ser testado.</li>
	<li>Coloque os pratos em uma caixa à prova de luz ou cubra com papel alumínio para minimizar a ativação não intencional por luz ambiente (ver Tabela 1).</li>
</ol>2. Indução global de luz
<ol><li>Use um painel LED de luz azul (465 nm) para fornecer luz azul ativante a vários embriões ao mesmo tempo.</li>
	<li>Posicione o painel LED em relação às placas de Petri contendo embriões de modo que o poder real da luz recebido pelos embriões seja de aproximadamente 1,5 mW/cm2 medido por um medidor de energia e energia leve(Figura 2A).</li>
	<li>Pulso a luz em intervalos de 1 h em/1 h desligando usando um relé de temporizador se iluminar por mais de 3h para reduzir o risco de fotodamagem ao ativador transcricional TAEL5,8. NOTA: A duração exata da iluminação pode precisar ser otimizada para aplicações específicas. Neste protocolo, são fornecidos exemplos de duração de iluminação de 30 min, 1h, 3 h e 6h.</li>
	<li>Remova as tampas da placa de Petri para minimizar a dispersão de luz da condensação.</li>
	<li>Coloque placas de Petri contendo embriões de controle em uma caixa à prova de luz ou cubra com papel alumínio para controles escuros.</li>
</ol>3. Avaliação quantitativa da indução por qRT-PCR
<ol><li>Remova os embriões da iluminação após a duração desejada de ativação.</li>
	<li>Extrair RNA total de 30-50 embriões escuros ativados por luz e 30-50 usando um kit de isolamento de RNA seguindo as instruções do kit.<ol>
<li>Transfira embriões para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e remova o excesso de água dos ovos. Adicione tampão de lise e homogeneize os embriões com um pilão plástico.</li>
		<li>Transfira o lysate para uma coluna fornecida pelo kit e continue com as instruções do kit. Proceda imediatamente para a etapa 3.3 ou armazene o RNA purificado a -20 °C a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use 1 μg total de RNA para síntese de cDNA usando um kit de síntese cDNA seguindo as instruções do kit.<ol>
<li>Pegue um tubo PCR de parede fina de 0,2 mL, adicione 1 μg de RNA a 4 μL de 5x cDNA reaction master mix (contendo buffer otimizado, oligo-dT e primers aleatórios, e dNTPs), 1 μL de solução de transcriptase reversa de 20x e água sem nuclease para um volume total de 20 μL.</li>
		<li>Coloque o tubo em um termociclador programado da seguinte forma: 22 °C para 10 min, 42 °C para 30 min, 85 °C por 5 min e, em seguida, mantenha a 4 °C. Proceda imediatamente para a etapa 3.4 ou armazenar cDNA a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as reações qPCR contendo mistura mestre de enzimas verdes SYBR, cDNA diluída de 5 vezes (etapa 3.3) e 325 nM de cada primer para GFP. NOTA: Primers usados neste protocolo da seguinte forma. Avanço GFP: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; Reverso GFP: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATCAT-3').</li>
	<li>Realize reações qPCR em uma máquina PCR em tempo real. NOTA: Programa PCR: ativação inicial a 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C.</li>
	<li>Realize uma análise de curva de derretimento assim que o PCR estiver concluído para determinar a especificidade da reação. Realize três réplicas técnicas para cada amostra.</li>
	<li>Calcule a indução ativada pela luz como mudança de dobra em relação aos embriões mantidos no escuro usando o método 2-ΔΔCt 11. A significância estatística pode ser determinada com um pacote de software estatístico.</li>
</ol>4. Avaliação qualitativa da indução por microscopia de fluorescência
<ol><li>Remova os embriões da iluminação após a duração desejada da ativação.</li>
	<li>Imobilize embriões para imagem em 3% de metilcelulose contendo 0,01% de tricaine em lâminas de depressão de vidro.</li>
	<li>Adquira imagens de fluorescência e brightfield em um estereóquio fluorescente conectado a uma câmera digital usando as configurações padrão do filtro GFP. Use configurações idênticas de aquisição de imagens para todas as amostras.</li>
	<li>Mescle imagens de brightfield e fluorescência após a aquisição com software de processamento de imagens.</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
<li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL+2.0%3A+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li>
<li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
<li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Embryology%22%5BJournal%5D)">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses foi declarado.

Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.
<p class="jove_content"...

Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas1 ou ativação dos promotores de choque térmico2. Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido3,mas essa abordagem requer um promotor adequado ou elemento regulatório, que nem sempre estão disponíveis, e não é propício à indução do nível subsecimento.
Em contraste com tais abordagens convencionais, ativadores transcricionais optogenéticos ativados pela luz têm o potencial de um controle espacial e temporal mais fino da expressãogenética 4. O sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul foi desenvolvido e otimizado para uso em embriões de zebrafish5,6. Este sistema é baseado em um fator de transcrição endógeno ativado pela luz da bactéria E. litoralis7,8. O sistema TAEL/C120 consiste em um ativador transcricional chamado TAEL que contém um domínio de transativação Kal-TA4, um domínio LOV lov (sensor de tensão de luz-oxigênio) azul e um domínio de ligação de DNA helix-turn-helix (HTH)5. Quando iluminados, os domínios LOV sofrem uma alteração conformacional que permite que duas moléculas de TAEL dimerizem, vinculem-se a um promotor C120 responsivo do TAEL e iniciem a transcrição de um gene a jusante de interesse5,8. O sistema TAEL/C120 apresenta indução rápida e robusta com toxicidade mínima, podendo ser ativado por diversas modalidades diferentes de entrega de luz. Recentemente, foram feitas melhorias no sistema TAEL/C120, adicionando um sinal de localização nuclear ao TAEL (TAEL-N) e acoplando o elemento regulatório C120 a um promotor basal cFos (C120F) (Figura 1A). Essas modificações melhoraram os níveis de indução em mais de 15vezes 6.
Neste protocolo, um simples painel LED é usado para ativar o sistema TAEL/C120 e induzir a expressão onipresente de um gene repórter, GFP. A indução de expressão pode ser monitorada qualitativamente observando a intensidade da fluorescência ou quantitativamente medindo os níveis de transcrição usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo demonstrará o sistema TAEL/C120 como uma ferramenta versátil e fácil de usar que permite uma regulação robusta da expressão genética in vivo.

<table><tbody><tr><td>Ferramenta de ilustração científica baseada na web BioRender</td><td></td><td></td><td>Câmera</td></tr> <tr><td>digital CCD https://biorender.com/ Color</td><td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>Console compacto de medidor de energia e energia, LCD digital de 4</td>" Filtro de excitação <td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>, 545 nm</td><td>Olympus</td><td>ET545 / 25x</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini kit</td><td>GE Healthcare</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (azul e branco)</td><td>Amazon</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW Interruptor de temporizador digital programável</td><td>Amazon</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR verde mistura rápida</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>Photoshop Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism software de gráficos e estatísticas</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28137</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 Fonte de luz LED de fluorescência</td><td>Excelitas</td><td>010-00326R</td><td>Descontinuado. Ele foi substituído pelo X-Cite mini+</td></tr></tbody></table>

expressão gfp induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema optogenético tael/c120

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.

Para esta demonstração, uma linha de repórteres GFP responsiva C120 -responsiva (Tg(C120F:GFP)ucm107)foi cruzada com uma linha transgênica que expressa TAEL-N onipresentemente a partir da ubiquitina b (ubb) promotor(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) para produzir embriões transgênicos duplos contendo ambos os elementos. 24 h pós-fertilização, os embriões foram expostos à ativação da luz azul, pulsado a uma frequência de 1 h on/1 h off. A indução da expressão GFP foi quantifi...

Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

Este protocolo é significativo porque é um método optogenético, ou ativado pela luz, para induzir a expressão genética, em um organismo intacto. No nosso caso, um embrião de zebrafish. A vantagem dessa técnica, é que ela usa a luz, como um agente indutor, o que permite um controle muito preciso, espaçacial e temporal da indução.Este protocolo seria útil para qualquer situação em que a expressão genética indutível seria útil. Isso inclui coisas como rastreamento de linhagem, ensaios de ganho de função ou experimentos de resgate. Para começar, o painel LED em relação às placas de Petri contendo embriões para fornecer 1,5 miliwatts por centímetro quadrado de energia de luz para vários embriões ao mesmo tempo.Para reduzir o risco de dano fotográfico ao Ativador Transcricional da Cauda, poste a luz em intervalos de uma hora de desconto usando um relé de temporizador, se iluminar por mais de três horas. Remova as tampas da placa de Petri para minimizar a dispersão de luz da condensação. Coloque placas de Petri contendo embriões de controle e uma caixa à prova de luz para controles escuros.Remova os embriões da iluminação, após a duração desejada de ativação. Para extração total de RNA, use um kit de extração de RNA. Transfira os embriões para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e remova o excesso de água dos ovos.Após a adição de tampão de lise, homogeneize os embriões com o pilão plástico. Transfira o lysate para uma coluna fornecida pelo kit e siga as instruções do fabricante para purificar o RNA. Armazene o RNA purificado, a menos 20 a menos 80 graus Celsius, até que use ou síntese imediatamente de cDNA de um micrograma, RNA total usando o kit de síntese cDNA, seguindo as instruções do fabricante.Adicione um micrograma de RNA em uma parede fina 0,2 mililitro, tubo PCR, contendo quatro microliters, de cinco vezes mistura mestre de reação cDNA, seguido pela adição de um microliter, de 20 vezes solução de enzima transcriptase reversa. Em seguida, compõem um volume final de 20 microliters, com água sem nuclease. Coloque o tubo em um ciclo termo programado para síntese de CDNA.Armazene o cDNA sintetizado a menos 20 graus celsius até usar ou usar imediatamente para avaliação quantitativa. Configure as reações quantitativas do PCR contendo mistura mestre de enzimas de verde cibernético. Cinco vezes diluídos primers cDNA e GFP em 325 nanomolar concentração em triplicados e conduzir a reação em uma máquina PCR programada em tempo real.Após a conclusão da reação, analise a curva de derretimento para determinar a especificidade da reação. Calcule a indução ativada pela luz como mudança de dobra em relação aos embriões de controle usando o método duplo de Tomografia Delta. E usar software estatístico para determinar o significado.Após a remoção dos embriões da iluminação, imobilize embriões para imagem em 3%de metilcelulose contendo 0,01% Tricaine em lâminas de depressão de vidro. Adquira imagens de fluorescência e brightfield em um microscópio estéreo fluorescente conectado a uma câmera digital usando as configurações padrão do filtro GFP. Mescle imagens de brightfield e fluorescência após a aquisição com software de processamento de imagens.A quantificação da expressão GFP indicou indução de expressão logo após 30 minutos após a exposição à luz azul. Os níveis de expressão GFP continuaram a aumentar até seis horas, após a ativação de forma constante. A indução de GFP também foi avaliada qualitativamente examinando a intensidade da fluorescência ao mesmo tempo em que os pontos pós-ativação.A fluorescência GFP acima dos níveis de fundo foi observada pela primeira vez em três horas após a ativação e tornou-se visivelmente mais brilhante em seis horas após a ativação. Em contraste, os embriões de controle para todos os pontos de tempo, mantidos no escuro, não apresentaram, qualquer fluorescência GFP apreciável. A luz ativante deve estar na faixa azul do espectro de luz visível.Tanto a luz do quarto quanto a luz solar contém alguma luz azul. Portanto, tome cuidado para proteger seus controles negativos de quaisquer fontes de luz ambiente. O sistema TAEL C120 é geneticamente codificado e modular e pode conduzir a expressão de qualquer gene de interesse.Assim, combinado com outras técnicas, pode ser usado para responder a uma série de perguntas biológicas.

light-induced-gfp-expression-zebrafish-embryos-using-optogenetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

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Optogenética do peixe-zebra: ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados para estudar respostas comportamentais larvais

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Transgênese de peixe-zebra mediada por transposon Tol2: um procedimento para gerar peixe-zebra transgênico após a coinjeção do sistema Tol2 em embriões de peixe-zebra fertilizados

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Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

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In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

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Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

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A manipulação optogenética de vias de sinalização pode ser uma estratégia poderosa para investigar como a sinalização é decodificada no desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso de ativadores de sinalização nodal e proteína morfogênica óssea (BMP) baseados em luz-oxigênio-voltagem no embrião inicial do peixe-zebra.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.

Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra

Aprenda a induzir expressão gênica com luz azul em embriões de zebrafish usando o sistema optogenético TAEL/C120. Este método oferece controle espacial e temporal preciso para estudos de função gênica in vivo.

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

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