Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120
August 19th, 2021
Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.
Este protocolo é significativo porque é um método optogenético, ou ativado pela luz, para induzir a expressão genética, em um organismo intacto. No nosso caso, um embrião de zebrafish. A vantagem dessa técnica, é que ela usa a luz, como um agente indutor, o que permite um controle muito preciso, espaçacial e temporal da indução.
Este protocolo seria útil para qualquer situação em que a expressão genética indutível seria útil. Isso inclui coisas como rastreamento de linhagem, ensaios de ganho de função ou experimentos de resgate. Para começar, o painel LED em relação às placas de Petri contendo embriões para fornecer 1,5 miliwatts por centímetro quadrado de energia de luz para vários embriões ao mesmo tempo.
Para reduzir o risco de dano fotográfico ao Ativador Transcricional da Cauda, poste a luz em intervalos de uma hora de desconto usando um relé de temporizador, se iluminar por mais de três horas. Remova as tampas da placa de Petri para minimizar a dispersão de luz da condensação. Coloque placas de Petri contendo embriões de controle e uma caixa à prova de luz para controles escuros.
Remova os embriões da iluminação, após a duração desejada de ativação. Para extração total de RNA, use um kit de extração de RNA. Transfira os embriões para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e remova o excesso de água dos ovos.
Após a adição de tampão de lise, homogeneize os embriões com o pilão plástico. Transfira o lysate para uma coluna fornecida pelo kit e siga as instruções do fabricante para purificar o RNA. Armazene o RNA purificado, a menos 20 a menos 80 graus Celsius, até que use ou síntese imediatamente de cDNA de um micrograma, RNA total usando o kit de síntese cDNA, seguindo as instruções do fabricante.
Adicione um micrograma de RNA em uma parede fina 0,2 mililitro, tubo PCR, contendo quatro microliters, de cinco vezes mistura mestre de reação cDNA, seguido pela adição de um microliter, de 20 vezes solução de enzima transcriptase reversa. Em seguida, compõem um volume final de 20 microliters, com água sem nuclease. Coloque o tubo em um ciclo termo programado para síntese de CDNA.
Armazene o cDNA sintetizado a menos 20 graus celsius até usar ou usar imediatamente para avaliação quantitativa. Configure as reações quantitativas do PCR contendo mistura mestre de enzimas de verde cibernético. Cinco vezes diluídos primers cDNA e GFP em 325 nanomolar concentração em triplicados e conduzir a reação em uma máquina PCR programada em tempo real.
Após a conclusão da reação, analise a curva de derretimento para determinar a especificidade da reação. Calcule a indução ativada pela luz como mudança de dobra em relação aos embriões de controle usando o método duplo de Tomografia Delta. E usar software estatístico para determinar o significado.
Após a remoção dos embriões da iluminação, imobilize embriões para imagem em 3%de metilcelulose contendo 0,01% Tricaine em lâminas de depressão de vidro. Adquira imagens de fluorescência e brightfield em um microscópio estéreo fluorescente conectado a uma câmera digital usando as configurações padrão do filtro GFP. Mescle imagens de brightfield e fluorescência após a aquisição com software de processamento de imagens.
A quantificação da expressão GFP indicou indução de expressão logo após 30 minutos após a exposição à luz azul. Os níveis de expressão GFP continuaram a aumentar até seis horas, após a ativação de forma constante. A indução de GFP também foi avaliada qualitativamente examinando a intensidade da fluorescência ao mesmo tempo em que os pontos pós-ativação.
A fluorescência GFP acima dos níveis de fundo foi observada pela primeira vez em três horas após a ativação e tornou-se visivelmente mais brilhante em seis horas após a ativação. Em contraste, os embriões de controle para todos os pontos de tempo, mantidos no escuro, não apresentaram, qualquer fluorescência GFP apreciável. A luz ativante deve estar na faixa azul do espectro de luz visível.
Tanto a luz do quarto quanto a luz solar contém alguma luz azul. Portanto, tome cuidado para proteger seus controles negativos de quaisquer fontes de luz ambiente. O sistema TAEL C120 é geneticamente codificado e modular e pode conduzir a expressão de qualquer gene de interesse.
Assim, combinado com outras técnicas, pode ser usado para responder a uma série de perguntas biológicas.
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Visão geral
Este protocolo demonstra o uso da optogenética para alcançar a expressão gênica induzida por luz em embriões de peixe-zebra. O sistema TAEL/C120 sensível à luz azul permite um controle preciso da expressão gênica em um organismo intacto.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Optogenética
- Expressão gênica
- Modelos de peixe-zebra
Fundamentos
- Optogenética é um método ativado por luz para induzir a expressão gênica.
- Esta técnica fornece controle espacial e temporal da indução.
- É particularmente útil para rastreamento de linhagem e ensaios de ganho de função.
- Embriões de peixe-zebra servem como um modelo para estudar a expressão gênica in vivo.
Objetivo do estudo
- Demonstrar um método para expressão gênica induzida por luz.
- Fornecer um protocolo para pesquisadores interessados em aplicações optogenéticas.
- Facilitar experimentos que requerem controle preciso sobre a expressão gênica.
Métodos utilizados
- Posicionamento de um painel LED em relação a placas de Petri contendo embriões.
- Entrega de 1,5 miliwatt por centímetro quadrado de luz.
- Indução de expressão gênica em múltiplos embriões simultaneamente.
- Utilização do sistema optogenético TAEL/C120 para controle gênico.
Principais resultados
- Indução bem-sucedida de expressão gênica em embriões de peixe-zebra.
- Controle espacial e temporal demonstrado sobre a ativação gênica.
- Fornecimento de um protocolo confiável para futuros estudos optogenéticos.
- Destaque das vantagens de usar a luz como agente indutor.
Conclusões
- Optogenética oferece uma ferramenta poderosa para estudar a função gênica.
- O sistema TAEL/C120 é eficaz para induzir expressão gênica in vivo.
- Este método pode ser aplicado a vários cenários de pesquisa biológica.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of gene expression enables precise spatiotemporal interrogation of biological targets in vivo, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The TAEL/C120 system provides a genetically encoded, light-switchable platform for validating therapeutic hypotheses with quantitative readouts. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing reversible, dose-dependent modulation of gene expression in zebrafish embryos.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible, reversible gene activation in an intact vertebrate model.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking light-induced expression to phenotypic readouts via GFP reporter and qRT-PCR quantification.
- Predictive Value: Facilitates gain-of-function and rescue experiments to assess target sufficiency and pathway relevance in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, light-dependent GFP expression measurable by fluorescence microscopy and qRT-PCR for compound or condition screening.
- Reproducibility: Enables standardized induction protocols with defined light intensity (1.5 mW/cm²) and temporal control to minimize variability across replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well formats using LED panels to treat multiple embryos simultaneously under controlled illumination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports zebrafish-based preclinical models where temporal control of gene expression mimics inducible therapeutic interventions.
- Biomarker Alignment: GFP and qRT-PCR outputs serve as translatable pharmacodynamic readouts for pathway engagement and target modulation.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of targets by testing necessity and sufficiency through inducible gain-of-function and rescue designs prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling iterative validation of molecular targets in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Tests target sufficiency and pathway activation through timed, light-induced expression in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs (fold-change GFP) for comparing genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs double delta CT qRT-PCR and fluorescence intensity for statistical comparison between induced and dark controls.
- Translational Research: Connects inducible expression to phenotypic outcomes in zebrafish, supporting continuity to preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Modular TAEL/C120 system can drive any gene of interest, enabling reuse across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing precise temporal control over gene expression in a complex organism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized light delivery and internal dark controls to account for environmental variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid, reversible target modulation to assess phenotypic consequences.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a physiologically relevant, inducible system before resource-intensive advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and optogenetic hardware setup.
- Depends on LED illumination systems capable of delivering precise blue light intensity and timing control.
- Necessitates standardized protocols for light exposure duration and dark control maintenance to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when scaling to different embryonic stages or genetic backgrounds.
- Limited by light penetration in opaque tissues, though mitigated in zebrafish embryos due to optical clarity.
