Name: Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda o isolamento e cultura de queratinócitos orais primários do paladar de ratos C57BL/6J adultos. Este método mantém células em estado de stemness para estudos de biologia de células-tronco orais e doenças relacionadas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (para A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (to A.S.), AMED sob o número de subvenção JP21gm6110016 e 21bm0704067 (para A.S.), e bolsas de pesquisa da Takeda Science Foundation (para A.S.). Agradecemos ao Centro de Recursos e Desenvolvimento Animal da Universidade de Kumamoto e do Centro de Recursos Animais da Universidade de Tsukuba por seus excelentes cuidados com o rato. Agradecemos ao núcleo do IRCMS na Universidade de Kumamoto pelo apoio à imagem confocal.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Experimentos com Animais da Universidade de Kumamoto e da Universidade de Tsukuba.
1. Preparação de reagentes e mídia cultural
<ol><li>Prepare 40 mL de meio de cultura queratinócito contendo 60 μM de cálcio e 600 μL de solução antibiótico-antimicocética. Prepare 20 mL de trippsina de 0,025% e 400 μL de solução antibiótico-antimíctico.<ol>
<li>Descongele a solução de inibição de trippsina à temperatura ambiente e mantenha-a a 4 °C até usar na etapa 4.1. NOTA: O reagente de isolamento está preparado para o isolamento tecidual de cinco camundongos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar os meios culturais, pegue 500 mL de médio e adicione 5 mL de uma solução de suplemento de crescimento (ver Tabela de Materiais) (doravante referido como meio completo) e 20% de bovino boquese fetal despoado de cálcio (FBS)33 (doravante referido como chelexed-FBS).</li>
</ol>2. Dissecção do tecido paladar do rato adulto
<ol><li>Sacrifique um camundongo C57BL/6J adulto (masculino ou feminino) por deslocamento cervical em conformidade com as regulamentações da instalação relativas ao bem-estar animal.<ol>
<li>Remova o cabelo ao redor da boca com uma máquina de barbear. Usando uma tesoura, cortada da bochecha em direção à mandíbula, em ambos os lados. NOTA: O mouse precisa ser anestesiado antes do sacrifício. Uma mistura anestésica de medetomidina, midazolam e butorphanol é usada (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use fórceps para abrir a boca e absorver qualquer sangue usando um cotonete. Para desinfetar o paladar, limpe o interior da boca com um cotonete contendo 10% de povidone-iodo.</li>
	<li>Para colher o paladar do rato, primeiro, use uma lâmina de bisturi cirúrgica para fazer uma incisão marginal de espessura total ao longo do lado palato dos dentes maxilais. Em seguida, disseque cuidadosamente todo o paladar usando um raspatório. NOTA: Um raspatório é uma ferramenta usada para elevar uma aba mucoperiosteal (ver Tabela de Materiais) (Figura 1B).</li>
	<li>Transfira rapidamente o tecido palato para um tubo de 15 mL contendo 4 mL de solução média completa + antibiótico-antimíctico. Mantenha os tecidos no gelo até ficar pronto para a incubação. NOTA: Para coleta de vários camundongos, os tecidos do paladar podem ser mantidos no gelo por até 4h.</li>
</ol>3. Pré-tratamento do tecido palaciano
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar, transfira tecidos para um prato de 60 mm contendo 4 mL de solução média completa + antibiótico-antimicomítico.</li>
	<li>Usando força curta e contundente e uma lâmina de bisturi, remova suavemente qualquer sangue dos tecidos. Lave os tecidos 10 vezes em meio completo.</li>
	<li>Transfira tecidos para uma antena de 35 mm contendo 4 mL de 0,025% de trippsina + solução antibiótico-antimicocética, com a superfície epitelial voltada para baixo. NOTA: A superfície epitelial, que se curva para dentro, deve ser encharcada na solução de trippsina; a álmina propria deve enfrentar para cima. O tecido deve ser achatado o máximo possível para ser incubado inteiramente na solução de trippsina.</li>
	<li>Incubar tecidos em 0,025% de trippsina por ~16 h em temperatura ambiente na capa da cultura.</li>
</ol>4. Coleta e cultura de células primárias
<ol><li>Usando um par de fórceps contundentes, remova o tecido da solução de trippsina (no prato de 35 mm) e transfira para a solução inibidora de trypsina em um prato de 60 mm (4 mL por prato) com a superfície epitelial voltada para cima.</li>
	<li>Usando fórceps para segurar a borda do paladar, raspe suavemente a camada epitelial da ármina propria subjacente usando uma lâmina de bisturi. NOTA: O tecido conjuntivo não é digerido pela trippsina, por isso não descasca durante a raspagem.</li>
	<li>Para coletar a quantidade máxima de células epiteliais dos tecidos, transfira o tecido para outra folha de 60 mm com meio completo de 4 mL e repita a etapa de raspagem. NOTA: Certifique-se de evitar raspar o tecido com a ponta da lâmina; use a borda da lâmina em vez disso. A raspagem é realizada para 5-10 min por tecido.</li>
	<li>Coloque um coador de células estéril de 100 μm na parte superior de um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril, transfira 2 mL de solução de trippsina (a partir da etapa 4.1) para o coador para molhar sua superfície.</li>
	<li>Com uma pipeta, misture a suspensão celular na antena de 60 mm (das etapas 4.2-4.3) algumas vezes e filtre as células através do coador de células de 100 μm preparado nas etapas 4.4-4.5.</li>
	<li>Conte o número de células usando um hemócito. Prepare 15 μL de solução azul trypan e adicione 15 μL de suspensão celular (etapa 4.6). Transfira 10 μL da mistura azul de tripano celular para um hemócito e conte o número de células. NOTA: Um pedaço do paladar do rato pode render até 1 milhão de células.</li>
	<li>Durante a contagem, centrifufique o tubo (a partir da etapa 4.6) a 100 x g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o supernatante com uma pipeta. Adicione 2 mL de meio completo + chelexed-FBS ao tubo. Resuspend a pelota celular triturando várias vezes usando uma pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Placa 2-5 x 105 células de um rato em um poço de uma placa de 24 poços pré-revestida com colágeno tipo I (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C por 2 dias sem alterar o meio.</li>
	<li>Dois dias após a semeadura, substitua metade do meio de cultura pelo meio completo + chelexed-FBS. Verifique a morfologia celular sob o microscópio. Células de alimentação com meio completo + chelexed-FBS a cada 2 dias. NOTA: Após a semeadura, serão observadas células de diferentes tamanhos. Aproximadamente 3-5 dias após a semeadura, queratinócitos com morfologia de paralelepípedos (Figura 2) podem ser observados. Levará de 1 a 2 semanas de cultura antes que a primeira passagem possa ser conduzida e uma próxima de 1-2 semanas seja necessária antes que as células estejam prontas para a segunda e terceira passagens. Depois disso, as células crescerão mais rápido e podem estar preparadas para a criopreservação. As células podem ser repladas em um poço (de uma placa de 24 poços) e uma placa de 6 poços na primeira e segunda passagem, respectivamente. A passagem subsequente dependerá do crescimento e densidade celular. Uma proporção de divisão celular de 1:2 ou 1:3 pode ser usada após a terceira passagem.</li>
</ol>5. Passagem de queratinócito
<ol><li>Colete 2 mL do supernasal do prato de cultura e dispense em um tubo cônico de 15 mL (no gelo). Lave as células com 1x PBS estérei duas vezes. NOTA: Quando as células atingem aproximadamente 70%-80% de confluência, elas estão prontas para a passagem.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 0,05% de trippsina-EDTA ao prato ao poço de um prato de 6 poços.</li>
	<li>Incubar por 5-15 min a 37 °C; verificar depois de 5 minutos para ver se as células se desprendem do prato.</li>
	<li>Neutralizar a reação usando 1 mL de solução de inibição de trippsina e 2 mL de cultura completa média + chelexed-FBS por pipetação suave. Em seguida, transfira a suspensão celular para o mesmo tubo cônico de 15 mL da etapa 5.1.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão da célula a 100 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante com uma pipeta e resuspense a pelota celular em 1 mL de meio de cultura completa.</li>
	<li>Conte as células usando um hemócito. Em seguida, placa 1 mL da suspensão da célula em uma nova placa de cultura de 24 ou 6 poços. NOTA: Algumas das células das passagens iniciais podem ser congeladas em uma mistura de 70% de cultura completa média + 20% de FBS chelexed +10% DMSO. 1-2 criovias de células podem ser coletadas de uma placa de cultura confluente.</li>
</ol>6. Criopreservação e recuperação de queratinócitos
<ol><li>Congelamento celular<ol>
<li>Cresça queratinócitos para 80%-90% de confluência. NOTA: Não permita que as células superfaturam, pois isso poderia reduzir seu status de proliferação e viabilidade.</li>
		<li>Trate os queratinócitos no prato com 0,05% de trippsina-EDTA, conforme descrito nas etapas 5.1-5.5.</li>
		<li>Conte os queratinócitos usando um hemócito. Prepare criovias com base em números de células calculados para permitir a transferência de 1 x 106 células/mL para cada frasco.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão da célula a 100 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernaspetivo e resuspenque a pelota celular em uma solução de 10 mL de 10% DMSO + 20% de chelexed-FBS + 70% de meio de cultura completa (9 mL de médio completo + chelexed-FBS e 1 mL de DMSO).</li>
		<li>Dispense as células em criovials a 1 mL de suspensão por frasco. Coloque os frascos em um recipiente criogênico durante a noite a -80 °C. Transfira os frascos para um tanque de nitrogênio líquido no dia seguinte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperação celular<ol>
<li>Remova um criovial do tanque de nitrogênio líquido e descongele parcialmente à temperatura ambiente. Em um tubo de 15 mL, misture 1 mL da suspensão celular com 3 mL de cultura completa de meio + chelexed-FBS.</li>
		<li>Centrifugar a mistura por 5 min a 100 x g e 4 °C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de cultura completa média + chelexed-FBS.</li>
		<li>Coloque as suspensões das células em novos pratos de cultura revestidos de colágeno de 60 mm. Substitua o meio de cultura a cada 2-3 dias e passagem as células uma vez confluentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Coloração imunofluorescente
<ol><li>Cultura queratinócitos orais em deslizamentos quadrados (22 mm x 22 mm) em placas de 6 poços (5 x 105 células/bem) durante 2 dias.</li>
	<li>Fixar queratinócitos em uma solução de 4% paraformaldeído (PFA) e PBS por 20 minutos em temperatura ambiente antes de lavar três vezes com 1x PBS.</li>
	<li>Células permeabilize em uma solução de 0,1% Triton na PBS. Incubar células no reagente de bloqueio (2,5% de soro de cabra, 2,5% de soro de burro) por 1h à temperatura ambiente, seguida de incubação noturna com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) a 4 °C. NOTA: Anticorpos primários foram usados nas seguintes diluições: coelhinho anti-K14 (1:1000), rato α6-integrin (1:100), coelhinho anti-p63 (1:500), anti-K13 (1:100) e anti-PDGFRα (1:100).</li>
	<li>Lave amostras em uma solução de 0,1% Triton na PBS, seguida de incubação com anticorpos secundários por 1h à temperatura ambiente. NOTA: Os anticorpos secundários (Alexa 488 ou 555) foram usados em uma diluição de 1:300.</li>
	<li>Contratende todas as amostras com solução Hoechst por 10 minutos e monte células em lâminas de vidro. NOTA: A solução hoechst é usada para manchar os núcleos das células.</li>
	<li>Realize imagens de amostra usando um microscópio confocal. NOTA: O brilho e o contraste são ajustados para igual intensidade usando o software de edição de imagens.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Os queratinócitos primários isolados da epiderme da pele humana ou do camundongo têm sido utilizados por muitos anos em pesquisas e aplicações clínicas12,13,15,18,27,28,29. Em contrapartida, poucos protocolos foram estabelecidos para isolar e cultivar queratinócitos orais primários de camundongos adultos30,31,32. O presente estudo utilizou um meio de cultura completa comercial e chelexed-FBS para manter queratinócitos em um estado proliferativo ou semelhante a células-tronco. Este sistema de cultura pode ser empregado em ensaios moleculares e bioquímicos para entender melhor as características das células-tronco epiteliais orais e suas doenças relacionadas.
Várias etapas críticas estão incluídas neste protocolo. Em primeiro lugar, a concentração de trippsina e o tempo de incubação são essenciais na produção de células viáveis para culturas subsequentes. Utilizamos consistentemente soluções de trippsina de 0,025% e períodos de incubação de 16 h no capô da câmara à temperatura ambiente. Se não incubados por um período de tempo suficiente, os queratinócitos não se dissociariam adequadamente do tecido, resultando em um rendimento celular final mais baixo. Em segundo lugar, a tubulação suave da suspensão celular no segundo dia afeta notavelmente a viabilidade celular. A raspagem deve começar suavemente do lado epitelial e não exceder 10 minutos por amostra de tecido. Finalmente, a primeira suspensão celular isolada contém fibroblastos e outros tipos de células; essas células indesejadas geralmente começarão a desaparecer em culturas subsequentes.
Foram identificadas limitações potenciais durante o isolamento celular e a cultura. Em casos raros, os fibroblastos podem ser contaminados durante o processo de isolamento, e os fibroblastos podem inibir o crescimento de queratinócitos em passagens subsequentes (Figura 2H). É necessário selecionar um meio comercial que contenha um inibidor de crescimento de fibroblasto para eliminar tal contaminação na cultura. Como o paladar do rato e outras mucosas orais têm tamanhos relativamente pequenos, o rendimento celular inicial de um rato pode ser baixo. Portanto, todo o período de cultura deste protocolo - até o estágio de criopreservação - é mais longo do que o para queratinócitos de pele primária. Os queratinócitos orais isolados são melhor utilizados dentro de 10 passagens, pois períodos de cultura mais prolongados poderiam alterar as propriedades celulares e diminuir o número de células-tronco.
O método atual mostrou que os queratinócitos orais do camundongo exibiam uma morfologia de paralelepípedos e formavam colônias monocamadas em condições proliferativas. Eles também mostraram alta expressão dos marcadores basais α6-integrin, K14, e marcador de células-tronco p63. Em estudos futuros, além da coloração da imunofluorescência, serão utilizadas análises de sequenciamento de RNA, RT-PCR e manchas ocidentais para verificar a heterogeneidade celular e a pureza dos queratinócitos orais, o que aumentará ainda mais nossa compreensão da natureza dessas células.
Após passagens de 2-3, os queratinócitos orais foram estáveis o suficiente para serem usados em outros experimentos funcionais. É importante ressaltar que este protocolo de cultura pode ser combinado com linhas de camundongos transgênicos, incluindo genes knockout, Cre-loxP e sistemas indutores de tet, e também pode ser usado em ensaios celulares e moleculares. Assim, o presente protocolo fornece aos pesquisadores um método fundamental e eficiente que poderia ser usado para entender ainda mais a biologia das células-tronco queratinócitos orais.

O epitélio oral serve como primeira barreira na proteção do corpo contra estresses ambientais, incluindo danos químicos ou físicos e infecções bacterianas e virais1,2. A mucosa oral compreende uma camada externa de epitélio escamoso estratificado que consiste em queratinócitos e tecido conjuntivo subjacente chamado lamina propria, que consiste principalmente de fibroblastos e da matriz extracelular. A mucosa oral do camundongo pode ser amplamente dividida em três subtipos: masticatório (paladar duro e gengiva), especializado (língua dorsal) e forro (mucosa bucal, língua ventral, paladar macio, lábios) mucosa2,3 (Figura 1A). O epitélio oral é queratinizado na mucosa mastigatória e especializada e não queratinizada na mucosa forro. Apesar de sua localização anatômica, o epitélio oral é semelhante à epiderme da pele, na medida em que consiste em células epiteliais bem embaladas com diferentes graus de diferenciação: camadas basais contendo células indiferenciadas; camadas espinhosas, granulares e cornificadas que formam epitélio queratinizado, ou camadas intermediárias e superficiais que formam epitélio não queratinizado4. Modelos de camundongos transgênicos facilitaram o estudo das características celulares e moleculares das células-tronco epiteliais orais no paladar, mucosa bucal, língua e gingiva5,6,7,8,9,10,11. No entanto, a maioria desses estudos usou principalmente experimentos de camundongos in vivo. Os sistemas de cultura celular não eram tipicamente empregados devido à falta de protocolos estabelecidos e eficientes.
Um sistema de cultura in vitro pode ser usado para a análise molecular e bioquímica de reguladores de células-tronco, ensaios baseados em células e triagem de drogas. Atualmente, foram desenvolvidos protocolos para a cultura de queratinócitos primários da epiderme da pele, nos quais os queratinócitos basais podem ser isolados e cultivados com sucesso para fins clínicos e de pesquisa12,13,14,15. Em 1980, Hennings et al. mostraram que uma baixa concentração de cálcio (< 0,09 mM Ca2+) no meio cultural facilitou a proliferação e manteve as células em um estado indiferenciado. Um maior nível de cálcio promoveu a diferenciação celular e reduziu a proliferação16. Posteriormente, metodologias de cultura para queratinócitos epidérmicos de murina neonatal e adulta foram estabelecidas e amplamente aplicadas a inúmeros modelos de camundongos com diferentes origens genéticas para estudos in vitro17,18,19. Embora a pele e a epitelial oral compartilhem características comuns, elas também apresentam diferenças intrínsecas, por exemplo, em seu estado de queratinização, taxa de rotatividade, expressão genética e capacidade de cicatrização de feridas3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Embora a cultura de queratinócitos orais humanos tenha sido realizada com sucesso27,28,29, publicações sobre a cultura de queratinócitos orais do camundongo30,31,32 são limitadas devido ao pequeno tamanho do tecido alvo e às características distintas das células em comparação com os queratinócitos epidérmicos da pele. Este protocolo descreve as técnicas de isolamento e cultura de longo prazo dos queratinócitos orais primários do rato.

<table><tbody><tr><td>0,025% Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina/EDTA, vermelho fenol</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0,4w/v% Solução de Trypan Blue</td><td>Wako</td><td>207-17081</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta sorológica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Filtro de células de nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico estéril de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Pipeta de aspiração</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placa de cultura de células</td><td>Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico estéril de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultura de células</td><td>Corning</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>96 Placa de cultura de poços (fundo U)</td> <td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico 100x</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biocoat Colágeno I cellware 60mm prato</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Forceps</td><td>AS ONE</td><td>1-8187-03</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td></td><td>Vetorphale</td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>Algodão de armazenamento criogênico</td></tr><tr><td></td><td>AS ONE</td><td>63-1452-97</td><td></td></tr><tr><td>Folhas de cobertura 22 x 22 &mu; m quadrado</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td></td><td></td>C022221</tr><tr><td>Frasco Criogénico 1.2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000-0012</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina Definido (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho para burros (H+L), Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato para burros (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife Suplemento de crescimento definido (EDGS)</td><td>Gibco</td><td>S0120</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife, com 60 &micro; M cálcio</td><td>Gibco</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Fetal Soro bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pinças finas</td><td>BRC Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-PDGF Receptor &alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de meia curvatura</td><td>BRC Bio Research Center</td><td>PRI13-3376</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te</td><td>8100204</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris</td><td>Muromachi Kikai</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>Domitor</td>Midazolam Astellas <td></td></tr><tr><td></td><td>Pharma</td><td></td><td>Dormicum</td></tr><tr><td>No.15 Bisturi Descartável</td><td>Pena</td><td>219AABZX00136000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Iodo-povidona</td><td>Y's Square</td><td>872612</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-citoqueratina 13 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-K14</td><td>BioLegend</td><td>905301</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-p63</td><td>anticorpo Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Raspatorium #14</td><td>COMO UM</td><td>8-4599-01</td><td></td></tr><tr><td>Rato &alpha; 6-integrina</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>581-81705</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços revestida com colágeno tipo I</td><td>Corning</td><td>354408</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 60 mm revestida com colágeno</td> tipo I <td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços revestida com colágeno tipo I</td><td>Corning</td><td>355400</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de queratinócitos orais primários do paladar do rato adulto

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

Durante anos, a maioria dos estudos envolvendo queratinócitos têm sido realizados usando queratinócitos epidérmicos de pele humana e camundongo. Recentemente, os queratinócitos orais têm chamado a atenção por causa de sua função e características únicas. Eles mantêm a homeostase do epitélio oral e servem como recursos para aplicações em terapias regenerativas. No entanto, estudos in vitro que usam queratinócitos primários orais de camundongos adultos têm sido limitados devido à falta de um protocolo cultural eficiente e bem estabelecido. Aqui, os queratinócitos primários orais foram isolados dos tecidos palato de camundongos adultos e cultivados em um meio comercial de baixo cálcio suplementado com um soro chelexed. Nessas condições, os queratinócitos foram mantidos em estado proliferativo ou semelhante a células-tronco, e sua diferenciação foi inibida mesmo após o aumento das passagens. A análise de expressão de marcadores mostrou que os queratinócitos orais cultivados expressavam os marcadores celulares basais p63, K14 e α6-integrin e eram negativos para o marcador de diferenciação K13 e o marcador fibroblasto PDGFRα. Este método produziu células viáveis e culturaveis adequadas para aplicações a jusante no estudo das funções de células-tronco epiteliais orais in vitro.

Visão geral do processo de dissecção e isolamento de queratinócitos orais do paladar do rato adulto Os queratinócitos orais dissociados foram coletados do paladar do rato adulto e cultivados em uma chelexed-FBS personalizada de 20%. O paladar do rato consiste no paladar duro e no paladar macio (Figura 1C). O procedimento para o isolamento de queratinócitos orais do rato é resumido na Figura 1D. O tecido palato é dissecado e transferido para uma mídia que contém uma solução antimíctica antibiótico antes de ser incubado em solução de trippsina de 0,025% a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, o tecido palato é tratado com solução inibidora de trippsina e meio de cultura completa em volumes iguais. Posteriormente, os tecidos são raspados usando uma lâmina de bisturi cirúrgica para coletar queratinócitos orais. A suspensão da célula é filtrada através de um coador de células de 100 μm e centrifuada. As células são então semeadas em placas revestidas de colágeno I com 24 poços contendo 2 mL de cultura completa de meio + chelexed-FBS.
Resultados representativos do isolamento bem sucedido de queratinócitos orais de camundongos Os queratinócitos orais primários cresceram como monocamadas e apresentaram uma morfologia de paralelepípedos (Figura 2). Pequenas colônias de queratinócitos foram visíveis em 3-5 dias (Figura 2A,B); estes cresceram e formaram colônias apertadas em 1 semana de incubação (Figura 2C). Colônias de queratinócitos apresentaram as características morfológicas típicas dos queratinócitos basais, indicando suas condições saudáveis. Os queratinócitos orais humanos permaneceram indiferenciados por diversas passagens no meio de cultura completa contendo 0,06 mM Ca2+16,28. A primeira passagem foi realizada aproximadamente 2 semanas a partir do revestimento inicial (Figura 2D). Em passagens posteriores, os queratinócitos apresentaram crescimento estável com um período mais curto de cultura (Figura 2E-G). Os queratinócitos pararam de crescer se ocorressem contaminações significativas por fibroblastos durante o processo de isolamento (Figura 2H).
Queratinócitos orais isolados expressam marcadores basais celulares Para confirmar o estado dos queratinócitos orais primários, a imunostaining foi realizada utilizando os marcadores de células basais Queratina 14 (K14) e α6-integrin34. K14 e α6-integrin foram expressos em queratinócitos após a colheita (Figura 3A,B). As células também foram manchadas com marcador de células-tronco p63 para confirmar sua haste. As células de passagem antecipada (passagem 4) e passagem tardia (passagem 7) apresentaram expressão uniforme de p63 (Figura 3C,D). Em contraste, os queratinócitos tratados com alto cálcio (indução de 1,2 mM por 2 dias) apresentaram diminuição da expressão p63 (Figura 3E), indicando que o tratamento de cálcio elevado suprime genes relacionados com células-tronco em queratinócitos primários como relatado anteriormente16. O marcador de diferenciação Queratina 13 (K13) mostrou expressão rara ou não em passagens precoces e tardias e expressão significativa sob tratamento de cálcio elevado (Figura 3F-H). Para testar a possibilidade de contaminação do fibroblasto na cultura queratinócito, a coloração utilizando o marcador fibroblasto PDGFRα foi realizada com o mesmo conjunto de queratinócitos comparados com o fibroblasto embrionário do rato (MEFs). Não houve expressão de PDGFRα na cultura queratinócito, em comparação com a alta expressão observada nas células MEF (Figura 3I-3L). Esses resultados indicaram que este protocolo poderia isolar com sucesso os queratinócitos basais e manter essas células no estado indiferenciado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do procedimento de dissecção e isolamento de queratinócitos orais do rato. (A) Representação esquemática da cavidade oral do camundongo. (B) Instrumentos utilizados para dissecar o paladar e isolar os queratinócitos orais do rato. (C) Imagem brightfield do paladar do rato. Barra de escala: 100 μm. (D) Resumo do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos do isolamento bem sucedido de queratinócitos orais do rato. (A-G) Imagens de curso de tempo de queratinócitos orais primários cultivados em 3 dias (A), 5 dias (B), 1 semana (C) e 2 semanas (D) de cultura após isolamento. Morforgicos de queratinócitos orais do rato após as primeiras (E), segunda (F) e terceira (G) são mostradas. (H) Exemplo de contaminação do fibroblasto na cultura da queratinócito oral do camundongo. Barra de escala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig03.jpg"> Figura 3: Queratinócitos orais isolados expressam marcadores basais celulares. (A-B) Imagens representativas da coloração imunofluorescente de K14 (A; vermelho) e α6-integrin (B; verde) na passagem 4. (C-E) Imagens representativas de coloração imunofluorescente de p63 (verde) na passagem 4 (C), passagem 7 (D) e tratamento de cálcio elevado (E). (F-H) Imagens imunossundo de K13 (verde) na passagem 4 (F), passagem 7 (G) e tratamento de cálcio elevado (H). (I-L) Imagens imunosterantes de PDGFRα (vermelho) na passagem 4 (I), passagem 7 (J), tratamento de cálcio elevado (K) e MEFs (L). Os núcleos estão manchados com Hoechst (azul). Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura dos queratinócitos orais derivados do paladar do rato adulto. Um método de avaliação utilizando imunostaining também é relatado.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Recentemente, os queratinócitos orais têm chamado a atenção por causa de sua propriedade única. Fornecemos um protocolo para cultivo de queratinócitos orais de camundongos em um estado semelhante a células-tronco adequado para aplicações a jusante. A cultura do queratinócito oral do rato e característica diferente da queratinócito da pele.Neste protocolo, isolamos com sucesso o queratinócito oral do camundongo primário e desenvolvemos uma técnica de cultura de longo prazo. Este sistema de cultura pode ser empregado em ensaios moleculares e bioquímicos para entender melhor a característica da célula-tronco manjericão oral e suas doenças relacionadas. Depois de sacrificar um rato C57BLK6J adulto, remova o cabelo ao redor da boca com uma máquina de barbear e usando uma tesoura, corte das bochechas em direção à mandíbula em ambos os lados.Em seguida, use fórceps para abrir a boca e absorver qualquer sangue usando um cotonete de algodão, em seguida, desinfetar a paleta limpando o interior da boca com um cotonete contendo iodo 10% povidone. Para colher a paleta do rato, primeiro usando uma lâmina de bisturi cirúrgica, faça uma incisão marginal de espessura total ao longo do lado da paleta dos dentes maxilais. Em seguida, usando um raspatório, disseque cuidadosamente toda a paleta.Transfira rapidamente o tecido da paleta para um tubo de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio completo suplementado com antibióticos e antimíclicos. Mantenha os tecidos no gelo até ficar pronto para a incubação. Em uma capa de fluxo laminar, transfira os tecidos para um prato de 60 milímetros contendo quatro mililitros de meio completo com antibióticos e antimícticos.Em seguida, usando asseps curtos e uma lâmina de bisturi, remova suavemente qualquer sangue dos tecidos e lave os tecidos 10 vezes com o meio completo. Após a última lavagem, transfira os tecidos para um prato de 35 milímetros contendo quatro mililitros de 0,025% de trippsina complementada com antibióticos e antimípticos. Coloque os tecidos com a superfície epitelial voltada para baixo e incuba-os por 16 horas à temperatura ambiente na capa da cultura.Após a digestão da trippsina durante a noite, use um par de fórceps contundentes para remover o tecido da solução de trippsina e transfira-o para um prato de 60 milímetros contendo uma solução inibidora de trippsina com a superfície epitelial voltada para cima. Em seguida, segurando a borda da paleta com fórceps, use a lâmina do bisturi para raspar suavemente a camada epitelial da ármina propria subjacente. Para coletar a quantidade máxima de células epiteliais dos tecidos, transfira o tecido para outra antena de 60 milímetros com quatro mililitros de médio completo e repita raspar como demonstrado anteriormente.Em seguida, coloque um coador de células de 100 mícrons estéreis em cima de um tubo cônico de 50 mililitros. E usando uma pipeta estéril, transfira dois mililitros de solução de trippsina para o coador para molhar sua superfície. Em seguida, usando uma pipeta, misture a suspensão celular na antena de 60 milímetros algumas vezes e filtre as células através do coador de células de 100 mícrons.Para contar o número de células, adicione 15 microlitadores da suspensão celular a 50 microliters de solução azul trypan, em seguida, transfira 10 microliters da célula trypan blue mix para um hemócitometro e conte o número de células. Em seguida, centrifugar a suspensão celular, remover o supernasce e adicionar dois mililitros de meio completo contendo Chelex FBS ao tubo. Resuspend a pelota celular titulando várias vezes usando uma pipeta de cinco mililitros.Em seguida, a placa duas a cinco vezes 10 para as quintas células de um rato em um poço de placa de 24 poços pré-revestido com colágeno tipo um e incubar as células a 37 graus Celsius por dois dias sem alterar o meio. Os queratinócitos orais primários cresceram como monocamadas e apresentaram uma morfologia de paralelepípedos. Pequenas colônias de queratinócitos foram visíveis após três e cinco dias.Após uma semana de incubação, essas colônias cresceram e formaram colônias apertadas. A primeira passagem foi realizada a duas semanas do revestimento inicial e, em passagens posteriores, os queratinócitos apresentaram crescimento estável com um período de cultura mais curto. Os queratinócitos pararam de crescer se ocorresse uma contaminação significativa do fibroblasto durante o processo de isolamento.Após a colheita, os queratinócitos expressaram queratina 14 e alfa6-integrin. Células de passagem precoce e tardia mostraram expressão uniforme de P63 confirmando sua haste. No entanto, os queratinócitos tratados com alto cálcio apresentaram diminuição da expressão P63 indicando que o tratamento de alto cálcio suprime genes relacionados com células-tronco.O marcador de diferenciação queratina 13 mostrou expressão rara ou não em passagens precoces e tardias, mas expressão significativa no tratamento de alto cálcio. O marcador de fibroblasto PDGFR alfa não foi expresso na cultura queratinócito indicando que este protocolo poderia isolar com sucesso os queratinócitos basais e manter essas células no estado indiferenciado. A captura deve começar a partir do lado peridural e 10 minutos por amostra de tecido.Também geralmente, a pipetação de células é importante para uma melhor viabilidade celular. Após duas ou três passagens, a queratinócito oral torna-se estável para outros experimentos funcionais. É importante ressaltar que este protocolo pode ser combinado com a vida do rato transgênico para ensaios celulares e moleculares in vitro.Estudos recentes relataram a dinâmica e heterogeneidade da célula-tronco de basilar oral. Esse método facilitará o estudo da biologia das células-tronco orais e levará a uma melhor compreensão das doenças bucais.

isolation-culture-primary-oral-keratinocytes-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o isolamento de queratinócitos - as células mais proeminentes da camada epidérmica da pele humana, empregando uma combinação de digestão enzimática e métodos de ruptura mecânica. Este método ajuda no crescimento preferencial de queratinócitos em relação a outros tipos de células da pele usando um meio de crescimento seletivo.

Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de células epiteliais de uma língua murina. Essas células podem ser cultivadas posteriormente para dar origem a colônias de células.

Isolamento e cultura de células epiteliais da língua murina: um procedimento para isolar e cultivar células epiteliais da língua a partir de modelo de camundongo

Este vídeo demonstra um procedimento cirúrgico para dissecar o tecido do palato a partir de um modelo murino.

Dissecção do tecido do palato do modelo murino adulto: um procedimento cirúrgico para colher palato duro e palato mole da cavidade oral de camundongos adultos

Neste vídeo, descrevemos o isolamento do epitélio das papilas circunvaladas (CVP) de uma língua murina.

Isolamento do epitélio das papilas circunvaladas (CVP) do modelo de camundongo: um procedimento enzimático para separar o epitélio da CVP da língua do camundongo

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Apresentamos um protocolo de isolamento e cultura de células mesenquimais palatinas embrionárias primárias para imagens de lapso de tempo de crescimento bidimensional (2D) e ensaios de reparação de feridas. Também fornecemos a metodologia para análise dos dados de imagem de lapso de tempo para determinar a formação de fluxo celular e a motilidade direcional.

Isolamento e imagem de lapso de tempo das células mesenquima palatinas embrionárias do camundongo primário para analisar atributos de movimento coletivo

Aqui apresentamos um método modificado para o isolamento e cultura das células epiteliais gengival humanas adicionando o inibidor de Rocha, Y-27632, ao método tradicional. Este método é mais fácil, menos demorado, melhora as propriedades das células-tronco e produz um número maior de células epiteliais de alto potencial, tanto para o laboratório quanto para aplicações clínicas.

Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, purificação e cultivo de células marginais primárias da stria vascular do camundongo, e para estabelecer modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular para estudar distúrbios da parede lateral coclear.

Isolamento e Cultura de Células Marginais Primárias da Stria Vascularis de Camundongos Neonatais

Aprenda o isolamento e cultura de queratinócitos orais primários do paladar de ratos C57BL/6J adultos. Este método mantém células em estado de stemness para estudos de biologia de células-tronco orais e doenças relacionadas.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

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