Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina _{1A (5-HT1AR}), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Estudar proteínas de membrana integral em seu ambiente nativo tem sido um desafio devido à complexidade da membrana plasmática. Vesículas lipídicas unilamellar gigantes, ou GUVs, são uma das plataformas mais proeminentes para estudar propriedades biomédicas e podem ser projetadas para imitar várias condições fisiológicas. Este protocolo descreve um método para fabricar GUVs incorporados de proteínas com base na incorporação espontânea, posteriormente ao inchaço do hidrogel. Os métodos tradicionais para fabricar GUVs não são generalizáveis para a incorporação integral da proteína da membrana. Esses métodos são muitas vezes de baixo rendimento, metodologicamente complexos e ad hoc, não aplicáveis a classes amplas de proteínas. Por outro lado, este protocolo representa um método flexível, robusto e simples para incorporar proteínas de membrana integral funcional em GUVs.Realizamos isso preparando um andaime de hidrogel, contendo a proteína, e depositando uma fina camada de lipídio em cima dele. No exemplo aqui apresentado, incorporamos o receptor acoplado à proteína G, ou GPCR, nos GUVs.Após a reidratação de todo o sistema, os GUVs bud fora da superfície do hidrogel com a membrana contendo GPCRs devidamente orientados.Permitir que todos os reagentes cheguem à temperatura ambiente. Durante este tempo, limpe os deslizamentos de cobertura colocando-os em metanol e sonicando por 30 minutos em 40