Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection
27 de agosto de 2021
O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.
A alimentação artificial e a coleta de saliva fornecem um método direto para detectar efeitos na saliva de insetos. No entanto, isso não foi descrito em detalhes antes. Este protocolo é eficaz para a coleta de saliva de insetos saprofíticos.
Além disso, é uma técnica simples, pois usamos meio contendo apenas sacarose como uma dieta artificial. A saliva de insetos saprofíticos pode afetar contra o sistema imunológico do hospedeiro para beneficiar o comportamento alimentar e transmitir patógenos. Este medicamento que pode ser usado para o comportamento de insetos e a pesquisa do caminho do osso dos insetos.
Este é um método simples de executar. No entanto, isso sugere a montagem de um ambiente experimental limpo à medida que a saliva está sendo coletada para mais pesquisas. Comece preparando uma solução de 5% de sacarose para a dieta artificial e filtre a solução através de um filtro de 0,22 mícrons para remover contaminação bacteriana e impurezas.
Passe a fome aproximadamente 200 pequenas larvas de funil vegetal marrom por três a cinco horas antes de introduzi-las em uma câmara de alimentação. Em seguida, para preparar os cilindros de vidro como câmaras de alimentação, cubra uma extremidade aberta da câmara com uma membrana de parafina antes de introduzir os insetos experimentais, em seguida, transfira os insetos para o cilindro de vidro e cubra a outra extremidade da câmara com membrana de parafina esticada. Adicione 200 microliters de dieta artificial na membrana e cubra o líquido com outra camada de membrana de parafina esticada.
Por fim, cubra a câmara com papel alumínio, deixando a extremidade com o dispositivo de dieta artificial exposto à luz. Após 24 horas, colete a saliva SBPH resfriando o cilindro a quatro graus Celsius para imobilizar os insetos, depois descubra o filme externo e colete a dieta artificial em tubos estéreis de 1,5 mililitro usando uma pipeta estéril. Mantenha a saliva coletada a menos 80 graus Celsius até a análise.
Em seguida, enxágue a membrana interna com 50 microliters de dieta artificial fresca três vezes por pipetação suavemente, e colete a dieta de lavagem artificial em tubos estéreis de 1,5 mililitro. Após as três enxágues, adicione uma dieta artificial fresca na membrana interna e coloque uma membrana de parafina recém-esticada por cima. Por fim, filtre as amostras coletadas através de uma unidade de filtro de 0,22 mícrons para remover micróbios e outros contaminantes.
Transfira as amostras de saliva coletiva em um filtro centrífugo de 500 mímicas e 10 kilodalton. Centrifugar a amostra. Colete o supernatante e traga o volume final para 100 microliters.
Para medir a concentração da saliva coletada, ligue o espectrofotômetro visível UV e lave os pedestais três vezes com água duplamente destilada. Selecione as opções na tela na seguinte ordem, proteínas, proteína A280. Selecione o tipo e uma unidade de absorção igual a um miligrama por mililitro.
Em seguida, verifique a caixa para correção da linha de base, 340 nanômetros. Em seguida, carregue dois microliters de solução aquosa de 5% de sacarose em branco e toque em Branco na parte inferior da tela. Finalmente, após a definição dos padrões, carregue dois microliters da saliva coletada e registe a concentração proteica.
Ao se alimentar de 5% de sacarose, mais de 80% da SBPH sobreviveu nos primeiros quatro dias. No entanto, a partir do quinto dia, a mortalidade aumentou rapidamente para 40% e no sétimo dia, menos da metade da SBPH sobreviveu. Uma análise de página da SDS mostrou que as amostras concentradas de saliva da saliva SBPH infectada pelo RSV continham muito mais proteínas do que o controle negativo de 5% da sacarose.
Em uma análise de manchas ocidentais para detecção da proteína capsida RSV, um inseto não infectado e viruliferous. A proteína capsíide RSV foi detectada com sucesso na amostra viruliferosa, um anticorpo projetado contra o produto genético LssgMP detectou uma proteína de 78 quilodalton em amostras não infectadas e viruliferosas, demonstrando que o LssgMP é uma proteína de saliva. Uma análise qrt pcr dos níveis de transcrição de LssgMP em diferentes tecidos mostrou que os níveis de transcrição de Lssg na glândula salivar eram 20 vezes maiores do que em todo o corpo e intestino, confirmando a expressão específica de LssgMP na glândula salivar.
Passar fome pelos insetos experimentais antes de introduzi-los na câmara é necessário para garantir a eficiência da nossa coleção de saliva. Além disso, deve ser coletado e trocado um meio artificial a cada 24 horas para reduzir a contaminação microbiana na amostra coletada. Esta técnica fornece um método direto para estudar a função da saliva na transmissão de patógenos.
Além disso, pode ajudar a estudar a interação do hospedeiro do patógeno inseto.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a coleta de saliva de insetos picadores-sugadores utilizando um meio artificial simples. O método permite investigar a função salivar dos insetos e seu papel no comportamento alimentar e na transmissão de vírus.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Fisiologia de insetos
- Biologia de vetores
- Transmissão de patógenos
Antecedentes
- Compreender o papel da saliva de insetos na alimentação e na imunidade
- Investigar os efeitos da saliva nas respostas do hospedeiro
- Os métodos anteriores apresentavam poucos detalhes para uma coleta eficaz de saliva
Métodos Utilizados
- Técnicas de alimentação artificial para coleta de saliva
- Larvas de cigarrinha marrom como organismos modelo
- Uso de solução de sacarose e técnicas estéreis
Resultados Principais
- A coleta de saliva demonstrou maior teor proteico em espécimes infectados pelo VSR
- Confirmada a expressão específica de LssgMP na glândula salivar
- A eficiência do método foi aprimorada pela privação alimentar dos insetos antes da coleta
Conclusões
- O protocolo coleta efetivamente a saliva de insetos para o estudo da transmissão de patógenos
- Os achados aprimoram a compreensão das interações entre insetos e hospedeiros na pesquisa biológica
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender os componentes da saliva de insetos é essencial para reduzir os riscos em estudos de transmissão de patógenos transmitidos por vetores na fase inicial de descoberta. Este método permite a coleta e análise direta da saliva de insetos picadores-sugadores, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pesquisas de antivirais e controle de vetores. Ele fornece um sistema reprodutível para avaliar efetores salivares que influenciam as interações entre hospedeiro e patógeno.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar proteínas salivares como alvos potenciais para interromper a transmissão de patógenos.
- Valor Operacional: Oferece uma abordagem padronizada para coletar saliva de insetos destinada à triagem funcional.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao confirmar a expressão específica nas glândulas salivares de efetores candidatos como LssgMP.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera amostras de saliva purificadas adequadas para ensaios bioquímicos e imunológicos subsequentes.
- Valor Operacional: Inclui etapas de filtração e concentração para garantir a pureza e reprodutibilidade da amostra.
- Valor Científico: Permite a detecção de componentes derivados de patógenos na saliva, como a proteína do capsídeo do VSR, para o desenvolvimento de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a descoberta translacional de biomarcadores ao associar proteínas salivares à competência vetorial.
- Valor Operacional: Permite amostragens longitudinais para monitorar alterações na composição da saliva durante a aquisição do patógeno.
- Valor Científico: Apoia a modelagem pré-clínica das interfaces inseto-hospedeiro-patógeno para reduzir riscos em estratégias de bloqueio da transmissão.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a validação pré-clínica, especialmente para projetos focados na interrupção da disseminação de patógenos mediada por vetores.
- Biologia Experimental: Apoia testes de hipóteses sobre funções efetoras da saliva na alimentação e na transmissão de patógenos.
- Triagem: Fornece amostras padronizadas e quantificáveis de saliva para campanhas de triagem de compostos ou anticorpos.
- Análises: Permite a quantificação proteica por espectrofotometria no ultravioleta e a detecção por imunoblotagem para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a expressão gênica específica das glândulas salivares com resultados funcionais em modelos de transmissão de patógenos.
- Reutilização em Escala: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da saliva em múltiplas espécies de vetores e patógenos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao validar biomarcadores salivares em contexto biológico relevante.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da preparação estéril da dieta, alimentação controlada e processamento padronizado de amostras.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falha em estágios avançados ao permitir a avaliação precoce de intervenções bloqueadoras da transmissão.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de alvos de controle vetorial com base na validação do mecanismo salivar.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em criação de insetos, técnica estéril e dissecação de glândulas salivares para validação.
- Depende do acesso a espectrofotometria UV-Vis, centrifugação e equipamentos para imunoblotagem.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos consistentes de jejum e cronogramas de troca de dieta.
- A adaptação a outras espécies de insetos pode exigir otimização da dieta artificial e da permeabilidade da membrana.
- Limitação prática: o rendimento de saliva pode variar conforme as taxas de sobrevivência dos insetos, exigindo processamento em lotes para obter volume suficiente de amostra.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:02
Preparation of Feeding Chamber and Artificial Diet
2:00
Collection of Small Brown Planthopper (SBPH) Saliva
2:56
Concentration of the Collected Saliva
3:58
Results: Artificial Feeding and Saliva Collection from Laodelphax striatellus
5:21
Conclusion
