Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

O Automated Data Acquisition Software é extremamente necessário para coletar enorme quantidade de dados criogênicos para caracterização estrutural de macromoleculess biológico. O pacote de software automatizado de aquisição de dados foi utilizado aqui para caracterizar a estrutura de vários macromoleculess biológicos, que estão diretamente associados à biologia do patógeno. Por exemplo, micobacterium, HIV e SASCO 2.

Para começar, inicie o Software de Aquisição automatizada de dados Latitude-S clicando no DigitalMicrograph a partir do menu inicial. Em seguida, selecione o Gerenciador de técnicas e, em seguida, o ícone Latitude-S para coleta automatizada de dados de partículas únicas. Para criar uma sessão com base nas configurações da sessão anterior, verifique a caixa de seleção de sessão anterior na paleta e, em seguida, selecione o novo botão ou para continuar uma sessão existente, pressione o botão continuar.

Para iniciar uma sessão totalmente nova, clique na nova guia na paleta. Escolha a pasta que contém a sessão a ser continuada e selecione a pasta para salvar os dados. Em seguida, clique no ícone de configuração e na caixa de exploração de estado gerenciado que aparece, adicione estado, defina a condição TEM, condição da câmera e opção de imagem ou estoque.

E, em seguida, nomeie o estado ou abra o resumo da configuração do estado para abrir as configurações de salvamento. Em seguida, configure o estado atlas clicando na paleta de estado Atlas e defina os parâmetros para ampliação, condições de iluminação e tempo de exposição da câmera, e clique ao lado para mover-se para o próximo estado. Em seguida, configure o estado da grade clicando na paleta de estado da grade, defina os parâmetros para óptica de imagem de microscópio, condições de iluminação e tempo de exposição da câmera e clique em seguir.

Configure o estado do orifício clicando na paleta de furos e defina a óptica de imagem, as condições de iluminação, o binning e os parâmetros de tempo de exposição da câmera. Depois de clicar em seguir, configure o próximo estado de foco clicando na paleta de foco e defina as configurações do microscópio para óptica de imagem, condições de iluminação, binning e tempo de exposição da câmera. Em seguida, concentre-se na área de carbono amorfo perto do buraco e clique ao lado para mover-se para o próximo estado.

Configure o estado de dados clicando na paleta de dados e defina os parâmetros para configurações de microscópio e clique em seguir. Clique na paleta de configuração de foco especificando a faixa de valores de desfoque e o tamanho da etapa na guia dada e pressione o próximo botão para passar para a próxima etapa. Concentre-se nos recursos necessários na grade e clique no botão de captura.

Em seguida, posicione a marca da cruz vermelha na mesma característica em cada imagem de estados diferentes. Comece pelos estados Focus, Data e Hole, pois o campo de visão é maior do que os estados Atlas e Grade. Em seguida, zoom nos estados Atlas e Grid para posicionar a marca da cruz vermelha no mesmo recurso.

Para calcular as posições e deslocamentos entre cada um dos cinco estados diferentes e refletir as posições e deslocamentos para a janela de saída, clique no botão de cálculo. Clique na paleta de captura e escolha o tamanho do Atlas para cobrir toda a grade ou parte da grade com base no requisito. Para capturar o Atlas, navegue no Atlas e selecione o quadrado da grade com base na espessura do gelo.

Uma vez selecionados os quadrados de grade desejados, clique no botão de programação e observe as telhas no quadrado da grade preenchida à medida que cada quadrado de grade for capturado. Uma vez clicado o botão de programação, selecione um orifício representativo no quadrado da grade adicionando a posição do orifício. Uma vez adquirida a imagem do furo, defina os dados e as posições de foco e salve o layout como um modelo.

Clique em encontrar automaticamente, digite o tamanho do furo e clique no botão encontrar no programa para encontrar automaticamente os orifícios com base no diâmetro. Configure a intensidade para remover os orifícios do quadrado da rede e contaminação do gelo. E depois de adicionar as ferramentas selecionadas e amarelas de marca através de auto-find, clique no botão de programação em tarefas de latitude.

De acordo com a triagem manual inicial de micrografos corrigidos por movimento usando o software cisTEM, a maioria dos dados foi encontrada dentro do intervalo de sinal desejado. Além disso, as imagens coletadas nas faixas de desfocus também foram verificadas manualmente pelo cisTEM. As partículas de espigão foram escolhidas manualmente para calcular as médias da classe 2D para visualização estrutural, o que fortemente sugeriu, mas a caracterização estrutural de alta resolução foi possível usando o respectivo conjunto de dados.

A classificação 3D indicou que a Spike Protein tem 1RBD em confirmação aberta e todos os outros RBD em confirmação de fechamento. As confirmações abertas do 1RBD até a Proteína Spike foram reconstruídas usando simetria C1. O mapa spike protein é representado nas vistas laterais de cima e de baixo.

E o mapa EM é equipado com estrutura atômica para melhor visualização das cadeias laterais. As confirmações de fechamento rbd foram refinadas com simetria C3 e o modelo refinado spike 3D e mapa EM, equipado com estrutura atômica como mostrado. E a confirmação intermediária da Proteína Spike identificada como sub domínio S2 indicou as cadeias laterais de resíduos individuais de aminoácidos.

Os resultados sugeriram que o Latitude-S pode coletar dados crio EM de alta resolução de macromoléculas biológicas. Este Software automatizado de coleta de dados poderia ser usado em qualquer outro sistema de microscopia eletrônica para coletar dados automaticamente.