Name: Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda um método automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento intracelular de Mycobacterium tuberculosis em macrófagos. Esta técnica simplificada permite a triagem rápida de fármacos aprovados para terapias dirigidas ao hospedeiro contra a tuberculose.

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Este trabalho foi financiado pela Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), pelo Health Research Board in Ireland [HRA-POR/2012/4 e HRA-POR-2015-1145] e pelo Royal City of Dublin Hospital Trust.

Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados utilizando a cepa H37Ra atenuada de Mtb, que pode ser manuseada em laboratório de Nível de Contenção 2. Todas as manipulações de micobactérias vivas foram realizadas em gabinete de segurança biológica (BSC) Classe II. Procedimentos experimentais foram projetados para minimizar a geração de aerossóis. A cultura de células eucarióticas (células THP-1) também foi realizada em um BSC Classe II. O laboratório realizou uma avaliação de risco e garantiu que todos os procedimentos fossem realizados de acordo com os regulamentos institucionais e nacionais de segurança biológica. A linhagem celular monocítica humana THP-1 foi utilizada para a realização do método descrito (etapa 1). As células são diferenciadas em macrófagos após estimulação com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA) antes da infecção por micobactérias.
1. Cultura celular
<ol><li>Propagar o estoque de sementes de H37Ra para a fase logarítmica em caldo de Middlebrook 7H9 (MB) suplementado com enriquecimento de albumina-dextrose-catalase (ADC) (10%) e polissorbato 80% a 0,05%. Conservar o stock de H37Ra em alíquotas de 1 ml num congelador de -80 °C durante um período máximo de 1 ano.</li>
	<li>Descongele um frasco para injetáveis de 1 ml de Mtb-H37Ra e transfira-o para um balão de T25 com uma tampa de filtro contendo 9 ml de caldo suplementado MB aproximadamente 1 semana antes da experiência planeada. Incubar a 37 °C durante 5-7 dias numa incubadora estática.</li>
	<li>Cultivar células THP-1 em RPMI-1640 suplementadas com soro fetal de bezerro a 10% não morto por calor (c)RPMI) em um frasco de T75 em uma incubadora umidificado de CO 2 a 5% de CO2/37 °C e subcultura duas vezes por semana para manter uma densidade inferior a 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Diferenciar as células THP-1 em macrófagos 3 dias antes da infecção, pipetando suavemente as células várias vezes usando uma pipeta sorológica em frascos T75 para dispersar quaisquer aglomerados e colocá-los em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar células a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente, decantar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet em 2 ml de RPMI. Realize a contagem de células para estimar células/mL.</li>
	<li>Sementes de 2 mL de macrófagos THP-1 em placas de cultura de tecidos de 12 poços a uma densidade de 100.000 células/mL em cRPMI com 100 ng/mL de PMA por 72 h. Remova o meio contendo PMA das células e reabasteça com cRPMI fresco antes da infecção por Mtb.</li>
	<li>Configure placas individuais para cada ponto de tempo necessário.</li>
	<li>Células de sementes na mesma densidade (100.000 células/mL) em lâminas de câmara de vidro de 2 poços para determinar a multiplicidade de infecção (MOI).</li>
	<li>Colocar numa incubadora humidificada a 5% de CO2 durante 3 dias a 37 °C.</li>
</ol>2. Quantificação da absorção de Mtb
<ol><li>Determinação da captação de Mtb por macrófagos (MOI)
	<ol><li>Configure o gabinete de segurança biológica (BSC) de Classe II no dia da infecção e trabalhe em duas camadas de papel tissue para capturar quaisquer derramamentos. Configure recipientes de descarte de resíduos de acordo com os regulamentos locais.</li>
		<li>Remover 6-8 mL de cultura micobacteriana do frasco de T25 e transferi-lo para um tubo de polipropileno de 15 mL. NOTA: Tubos de menor volume podem ser usados para experimentos menores.</li>
		<li>Centrifugar o tubo numa centrífuga de bancada à temperatura ambiente durante 10 min a 2890 x g.</li>
		<li>Retire cuidadosamente o tubo da centrífuga e transfira-o para o gabinete de segurança biológica. Aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.<ol><li>Despeje o sobrenadante no recipiente de descarte do desinfetante, reencape o tubo e ressuspenda as bactérias no meio restante, tocando no lado do tubo. Aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.</li>
		</ol></li>
		<li>Adicione 2 mL de cRPMI pré-aquecido, misture suavemente e transfira para um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Ressuspeite as micobactérias com muito cuidado usando uma agulha de 25 G e uma seringa de 5 mL. Para ressuspender, retire a suspensão de micobactérias para a seringa e ejete muito suavemente pela parede lateral do tubo para minimizar a produção de aerossóis. Repita 6-8 vezes. NOTA: Tenha o máximo de cautela, pois esta é uma cultura de alta densidade de micobactérias. Para evitar o risco de lesão por picada de agulha, use agulhas contundentes sempre que possível e seringas de bloqueio Luer.</li>
		<li>Eliminar a agulha e a seringa num recipiente para objetos cortantes no BSC.</li>
		<li>Transfira a suspensão para um tubo de microfuga de 2 mL (com tampa rosqueada) e centrifugar à temperatura ambiente por 3 min a 100 x g para pellet quaisquer aglomerados restantes. Devolva o tubo ao armário de segurança e aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.</li>
		<li>Transfira o 1-1,5 mL superior do sobrenadante para um novo tubo. Rejeitar o tubo original no balde de resíduos que contém desinfectante. Misture bem e adicione várias quantidades da suspensão micobacteriana (por exemplo, 5, 25, 50, 150 μL) às lâminas da câmara de vidro de 2 poços e incube por 3 h em uma incubadora de CO2 a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração para bactérias ácidas resistentes (BAAR) NOTA: Após 3 h de incubação, os macrófagos são lavados e fixados com paraformaldeído para inativar micobactérias. As lâminas são então coradas usando um kit de Auramina O Modificada (ver Tabela de Materiais) para estimar micobactérias fagocitadas por célula. Devido à sua parede celular cerosa, as micobactérias retêm o corante Auramina após uma lavagem ácido-alcoólica. Os núcleos dos macrófagos são então contra-corados com Hoechst. Este método permite que o número de bactérias fagocitadas por célula seja contado e é usado para determinar a multiplicidade de infecção (MOI) dos macrófagos.<ol><li>Remova o meio da lâmina da câmara de vidro depois de pipetar para cima e para baixo três vezes para desalojar as bactérias que não foram fagocitadas.</li>
		<li>Lave uma vez com 2 mL de PBS à temperatura ambiente.</li>
		<li>Armazenar existências de paraformaldeído a 4%, dissolvido em PBS em alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses. Descongele uma alíquota de 4% de paraformaldeído imediatamente antes do uso. Diluir a 2% de paraformaldeído com PBS e adicionar 2 mL por poço.</li>
		<li>Incubar por 10 min à temperatura ambiente. A lâmina da câmara de vidro pode ser removida do gabinete de segurança nesta fase para manchas.</li>
		<li>Lave o escorregador sob um fluxo suave de água da torneira.</li>
		<li>Dispense Auramina suficiente na lâmina para cobrir as células usando uma pipeta de transferência de plástico e incube por 1 min à temperatura ambiente no escuro (cubra com papel alumínio).</li>
		<li>Lave o excesso de corante da lâmina com água da torneira e adicione o descolorante / quencher por 1 min no escuro.</li>
		<li>Lavar o excesso com água da torneira e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente com Hoechst 33342 (10 μg/ml em PBS) no escuro.</li>
		<li>Lave a mancha Hoechst com água da torneira, remova as câmaras, escorra o excesso de água da lâmina, adicione uma gota de antifade e coverslip e seque ao ar.</li>
		<li>Examine a lâmina sob o microscópio fluorescente usando a objetiva de óleo de 100x. As micobactérias fluorescem em verde sob o filtro FITC. Os núcleos fluorescem em azul sob o filtro DAPI (Figura 1C).</li>
		<li>Determine o MOI contando o número de micobactérias fagocitadas por célula e a porcentagem de células infectadas.</li>
		<li>Calcular o volume de suspensão de micobactérias necessário para atingir o MOI necessário com base na área de superfície de um poço na placa; por exemplo, a área de superfície das lâminas da câmara de vidro utilizadas neste experimento é de 4 cm2. MOI baixo (aproximadamente 1-2 bacilos/célula) é desejável para experimentos conduzidos ao longo de vários dias (por exemplo, 5 dias).</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção de macrófagos
	<ol><li>Misture bem a suspensão de micobactérias e adicione a quantidade necessária às células em placas de 12 poços uma vez que o volume necessário para atingir o MOI desejado tenha sido determinado.</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante 3 h para permitir que as micobactérias sejam fagocitadas.</li>
		<li>Remova as bactérias extracelulares lavando os poços com RPMI ou HBSS quentes várias vezes.</li>
		<li>Lisar os macrófagos em um poço (amostra de 3 h) para determinar o tempo percentual até a positividade (PTT) do inóculo inicial (amostra de 3 h), conforme descrito na etapa 3 abaixo.</li>
		<li>Adicione cRPMI fresco e as doses de drogas necessárias ou controle do veículo aos poços restantes, incubar as placas na incubadora de CO2 a 37 °C pelo tempo necessário (dependendo do projeto experimental, mas geralmente em vários intervalos entre 1 a 8 dias).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Colheita de amostras para o sistema de detecção de cultura líquida
NOTA: No dia da infecção, as micobactérias extracelulares são removidas por lavagem e as micobactérias intracelulares são colhidas por lise de um poço de macrófagos (amostra de 3 h) para determinar a quantidade inicial fagocitada como controle basal da infecção. Em momentos subsequentes, tanto o meio, o lisado celular e as lavagens são combinados para medir o crescimento micobacteriano total. O crescimento extracelular e intracelular também pode ser avaliado separadamente, se desejado.
<ol><li>Colheita de 3 h de amostra para determinação de PTT
	<ol><li>Lavar as micobactérias extracelulares de todos os poços após as 3 h iniciais de infecção, conforme descrito na etapa 2.3.3. Adicionar 1 mL de meio fresco ao poço de controle de 3 h para equalizar o volume de lisado com os de momentos posteriores. NOTA: Ver passo 3.2.7 se as micobactérias extracelulares devem ser excluídas da análise.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de amostras
	<ol><li>Caldo MB quente e garrafas de cultura de instrumentos para trazê-los à temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfira o meio da placa de 12 poços para os tubos cônicos rotulados correspondentes.</li>
		<li>Adicione 500 μL de tampão de lise estéril (0,1% Triton x-100 em PBS filtrado através de um filtro estéril de 0,2 μm) a cada poço por 10 min.</li>
		<li>Raspe suavemente as células do poço com um raspador estéril e combine com o meio no tubo cônico apropriado.</li>
		<li>Lave o poço com 0,5 mL de PBS estéril e transfira para o tubo apropriado.</li>
		<li>Passe suavemente cada amostra através de uma agulha e seringa (25 G) 6-8 vezes para quebrar os aglomerados. Diluir as amostras 1:10 em caldo MB; Amostra de 100 μL + meio de 900 μL MB.</li>
		<li>Nos horários/dias necessários (geralmente entre 1 a 8 dias), colha as amostras restantes seguindo as etapas 3.2.1-3.2.6 acima. NOTA: Os investigadores podem preferir excluir micobactérias extracelulares de sua análise, caso em que, na etapa 3.2.2 acima, o meio de cada poço é descartado e os macrófagos são lavados várias vezes antes de adicionar tampão de lise.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculação e carregamento de frascos de cultura de instrumentos NOTA: Os detalhes do instrumento de cultura líquida e dos consumíveis relacionados são fornecidos na Tabela de Materiais.<ol><li>Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar. NOTA: Esta etapa precisa ser executada no BSC.</li>
		<li>Prepare frascos transferindo suplementos nutricionais suficientes para todas as amostras em um tubo cônico (0,5 mL / frasco). Use uma agulha e seringa para injetar 0,5 mL de suplemento nutritivo no frasco de cultura do instrumento.</li>
		<li>Pipetar 500 μL da amostra diluída (1:10) para um tubo com fundo em V de 1 ml.</li>
		<li>Use uma agulha e seringa para injetar os 500 μL de amostra no frasco de cultura do instrumento atribuído.</li>
		<li>Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar. Limpe os frascos com papel de seda embebido em álcool a 70% antes de sair do BSC.</li>
		<li>Transporte cuidadosamente as garrafas do armário de biossegurança para o instrumento de carregamento.</li>
		<li>Pressione o botão de carregamento no sistema automatizado de detecção microbiana.</li>
		<li>Digitalize os códigos de barras nos frascos de cultura de instrumentos e coloque os frascos na incubadora do sistema de detecção a 37 °C por até 42 dias. Leia e registre o tempo necessário para alcançar a positividade a partir da tela do instrumento. NOTA: O código de barras permite que o instrumento identifique a garrafa e vincule as leituras de refletância com uma garrafa específica.</li>
		<li>Calcular o tempo percentual até a positividade (PTT) comparando o PTT do inóculo intracelular inicial (Dia 0) com o dos macrófagos cultivados para os tempos indicados. Uma mudança positiva na porcentagem de PTT significa crescimentomicobacteriano 13. Por exemplo, para o dia 3: Variação percentual no tempo para positividade = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62838/62838eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bowness, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+Mycobacterium+tuberculosis+MGIT+time+to+positivity+and+cfu+in+sputum+samples+demonstrates+changing+bacterial+phenotypes+potentially+reflecting+the+impact+of+chemotherapy+on+critical+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).</li>
<li>Basu Roy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auto-luminescent+fluorescent+BCG+whole+blood+assay+to+enable+evaluation+of+paediatric+mycobacterial+responses+using+minimal+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores utilizaram o método de cultura líquida descrito neste protocolo para monitorar o crescimento de Mtb em macrófagos derivados de monócitos e macrófagos alveolares e células THP-1 diferenciadas com PMA 11,16,17. Essa técnica também pode ser modificada para uso com células não aderentes12. Mais recentemente, o instrumento também foi utilizado em estudos pré-clínicos para avaliar o ácido retinóico t...

O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da TB, foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente em 20191. Para escapar das defesas do hospedeiro, o Mtb subverte a atividade micobactericida de células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas (DCs), permitindo que ele persista intracelularmente e se replique2. A falta de uma vacina eficaz para prevenir a tuberculose pulmonar adulta e o crescente surgimento de cepas resistentes a medicamentos destacam a necessidade urgente de novas terapias.
As terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) podem encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência3. A avaliação pré-clínica de candidatos a HDT in vitro para determinar a atividade micobactericida dentro de macrófagos geralmente depende da quantificação do crescimento de Mtb por unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar sólido. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Sistemas de detecção microbiana automatizados e baseados em caldo comercialmente disponíveis são mais comumente usados em laboratórios de microbiologia clínica para detecção e teste de suscetibilidade a medicamentos de Mtb e outras espécies micobacterianas em espécimes clínicos4. Esses instrumentos medem o crescimento indiretamente com base na atividade metabólica bacteriana que leva a mudanças físicas nos meios de cultura (mudança nos níveis ou pressão de CO2 ou O2) monitoradas ao longo do tempo5. A leitura é do tempo de positividade (TPP), que já demonstrou se correlacionar com a UFC de Mtb em espécimes de escarro de pacientes com TB em resposta ao tratamento 6,7 e em lisados de pulmão e baço murinos infectados8. Além disso, sistemas de detecção de cultura líquida têm sido utilizados para medir o efeito de terapias convencionais dirigidas a patógenos sobre o crescimento de micobactérias em cultura axênica e macrófagos cultivados 9,10. O instrumento também tem sido utilizado para investigar a capacidade inata de células dendríticas e de macrófagos alveolares para controlar o crescimento intracelular de Mtb11,12. Este protocolo experimental demonstra que um sistema de diagnóstico de cultura líquida pode ser adaptado para realizar triagem pré-clínica de HDT para TB em macrófagos cultivados. Em comparação com a enumeração da UFC, a principal vantagem desta técnica é que reduz consideravelmente o trabalho experimental e o tempo necessário para quantificar o crescimento/sobrevivência das micobactérias intracelulares. Esta técnica baseia-se no acesso a um instrumento de cultura automatizado que pode ser usado para avaliar a sobrevivência micobacteriana intracelular em células imunes tratadas com uma ampla gama de reagentes farmacológicos visando as funções celulares para aumentar a imunidade do hospedeiro.

<table><tbody><tr><td>IX51 Microscópio Fluorescente</td><td>Olympus, Japão</td><td>N/A</td><td>AFB detecção e imagem</td></tr> 2 <tr><td>mL microtubo, fundo plano, tampa de rosca, estéril</td><td>Sarstedt, Carolina do Norte, EUA</td><td>72.694.006</td><td>Infecção por Mtb de macropahges Seringa de</td></tr><tr><td>5 mL, Luer lock</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>SZR-150-031K</td><td>Infecção por Mtb de macropahges/UFC</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL, estéril</td><td>Sarstedt, Norte Carolina, EUA</td><td>62.547.254</td><td>Infecção por Mtb de macropahges</td></tr><tr><td>all-trans-Retinoic Acid (ATRA) &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>R2625</td><td>Candidato à terapia dirigida pelo hospedeiro</td></tr><tr><td>BacT/ALERT Sistema de Detecção Microbiana 3D</td><td>Biomerieux (Hampshire, Reino Unido)</td><td>247001</td><td>Sistema de detecção colormétrica baseado em caldo</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP&nbsp; Suplemento Nutritivo BACT/ALERT MP</td><td>Biomerieux (Hampshire, Reino Unido</td><td>)414997</td><td>Ensaio de detecção colormétrica baseado em caldo</td></tr><tr><td>Garrafas de cultura BACT/ALERT MP</td><td>Biomerieux (Hampshire, Reino Unido</td><td>)419744</td><td>Ensaio de detecção colormétrica baseado em caldo</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook ADC Enriquecimento, 20 mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>M0553</td><td>Cultura líquida de micobactéria</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook OADC Enriquecimento, 20mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>M0678</td><td>Unidades Formadoras de Colônias</td></tr><tr><td>Raspador de células, 25 cm</td><td>Sarstedt, Carolina do Norte, EUA</td><td>83.1830</td><td>Colheita de lisados de lmacrófagos Filtro de</td></tr><tr><td>seringa Corning, 0.2 &micro; m</td><td>Corning Incorporated, Alemanha</td><td>431219</td><td>Esterilização de tampão de lise Vidro de</td></tr><tr><td>cobertura (borossilicato), 24 x 50 mm, espessura #1,5</td><td>VWR International Limited</td><td>631 - 0147</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida, de micróbio</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>C7698</td><td>Unidades Formadoras de Colónias</td></tr><tr><td>Dako Meio de Montagem Fluorescente Agilent</td><td>Technologies Ireland Limited</td><td>S3023</td><td>Antifad suporte de montagem</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado solução salina</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>D8537</td><td>Infecção por Mtb de macropahges Soro</td></tr><tr><td>bovino fetal, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EUA</td><td>10270106</td><td>Cultura de células de macrófagos</td></tr><tr><td>Glicerol, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>228220</td><td>Unidades Formadoras de Colônias</td></tr><tr><td>Hoescht 33342 (tricloridrato de bisbenzimida H 33342)</td> <td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>B2261</td><td>Coloração nuclear</td></tr><tr><td>IFN&gamma;, R& humano recombinante</td><td> D Systems Inc, Minnesota, EUA</td><td>285-IF</td><td>Candidato à terapia dirigida pelo hospedeiro</td></tr><tr><td>Labtek lâmina de câmara de 2 poços, estéril, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EUA</td><td>TKT-210-150R</td><td>Infecção por Mtb de macropahges</td></tr><tr><td>L-Asparagina, anidro</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>A4159</td><td>Unidades Formadoras de Colônias</td></tr><tr><td>Linezolid</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>Antibiótico</td><td></td></tr> <tr><td>PZ0014Agulha hipodérmica Microlance 25 G</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>300400</td><td>Infecção por Mtb de macropahges/UFC</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Base de ágar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>M0303</td><td>Unidades formadoras de colônias</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Base de caldo</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>M0178</td><td>Cultura líquida de micobactéria</td></tr><tr><td>Auramina modificada O Mancha e descolorante</td><td>Scientific Device Laboratory, IL, EUA</td><td>345-250</td><td>Coloração AFB</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>158127</td><td>Infecção por Mtb de placas de Petri macropahges</td></tr><tr><td>, 92 x 16 mm (20/saco)</td><td>Sarstedt, Carolina do Norte, EUA</td><td>82.1473.001</td><td>Unidades Formadoras de Colônias</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EUA</td><td>P8139</td><td>Cultura de células de macrófagos</td></tr><tr><td>Polissorbato 80, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>231181</td><td>Cultura líquida de Mycobacterium</td></tr><tr><td>RPMI-1640, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EUA</td><td>52400025</td><td>Espalhador</td></tr> de células estéreis para cultura de células de macrófagos<tr>, marca Fisher<td>em forma de L</td><td>, Thermo Fisher, MA, EUA</td><td>RB-44103</td><td>Unidades Formadoras de Colônias</td></tr><tr><td>T25 TC frasco, gargalo angular, tampa do filtro, estéril, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EUA</td><td>156367</td><td>Cultura líquida de Mycobacterium</td></tr><tr><td>THP-1 linha celular</td><td>ATCC, Virgínia, EUA ATCC</td><td>TIB-202</td><td>Cultura de células de macrófagos</td></tr></tbody></table>

um sistema de cultura automatizado para uso em testes pré-clínicos de terapias dirigidas ao hospedeiro para tuberculose

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente até o advento da COVID-19. O Mtb evoluiu para persistir em seu ambiente intracelular, evadir as defesas do hospedeiro e desenvolveu resistência a muitas drogas antituberculares. Uma abordagem para resolver a resistência é identificar os medicamentos aprovados existentes que aumentarão a resposta imune do hospedeiro ao Mtb. Essas drogas poderiam então ser reaproveitadas como terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) para encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência aos antibióticos.
A quantificação do crescimento intracelular de Mtb em macrófagos é um aspecto crucial da avaliação do potencial HDT. O padrão-ouro para medir o crescimento de Mtb é a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Neste protocolo, um sistema de cultura automatizado, baseado em caldo, que é mais comumente usado para detectar Mtb em espécimes clínicos, foi adaptado para triagem pré-clínica de terapias direcionadas ao hospedeiro. Avaliou-se a capacidade do sistema de ensaio de cultura líquida para investigar o crescimento intracelular de Mtb em macrófagos tratados com HDT. Os HDTs testados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de Mtb foram ácido retinóico totalmente trans (AtRA), tanto em solução quanto encapsulado em micropartículas poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e a combinação de interferon-gama e linezolida. As vantagens desta técnica automatizada baseada em cultura líquida em relação ao método CFU incluem simplicidade de configuração, preparação menos trabalhosa e tempo mais rápido para os resultados (5-12 dias em comparação com 21 dias ou mais para placas de ágar).

O instrumento automatizado de cultura de líquidos utilizado neste estudo monitora os níveis de CO2 a cada 10 min. Uma mudança de cor no sensor na parte inferior do frasco do instrumento é medida colorimetricamente e expressa como unidades de reflectância. O software do instrumento então aplica algoritmos de detecção para calcular o tempo de positividade (TTP), ou seja, o número de dias desde a inoculação até que as culturas sejam sinalizadas como positivas (Figura 1A). Uma relação...

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

A principal vantagem deste protocolo é que ele é menos trabalhoso e demorado do que o método tradicional de contagem de unidades formadoras de colônias para estimar o crescimento intracelular do Mycobacterium tuberculosis. Essa técnica torna mais fácil para os pesquisadores rastrear rapidamente os medicamentos aprovados pela FDA com o objetivo de reaproveitá-los como terapias direcionadas ao hospedeiro para tratar a tuberculose. O método é muito simples e direto.O conhecimento básico das técnicas de cultura de micobactérias e células T portadoras de EO seria suficiente para seguir o protocolo passo a passo. Para começar, transfira de seis a oito mililitros de cultura micobacteriana atenuada H37Ra do frasco de T25 para um tubo de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugar o tubo em uma centrífuga de bancada.Depois de remover cuidadosamente o tubo, transfira o tubo para o gabinete de segurança biológica e aguarde um minuto para que as bactérias se instalem. Despeje o sobrenadante no recipiente de descarte do desinfetante. Em seguida, recapeie o tubo e suspenda as bactérias no meio restante, batendo suavemente no lado do tubo e permitindo que as bactérias se depositem por um minuto.Adicione e misture dois mililitros de RPMI completo pré-aquecido e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Para ressuspender as micobactérias, desenhe a suspensão em uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25. Em seguida, ejete muito suavemente a parede lateral do tubo para minimizar a produção de aerossóis e repita o processo de seis a oito vezes.Descarte a agulha e a seringa em um recipiente de objetos cortantes no armário de biossegurança. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e centrífuga para abaixar quaisquer aglomerados restantes. Devolva o tubo ao armário de segurança e deixe que as bactérias se instalem por um minuto.Transfira o 1 a 1,5 mililitros superiores do sobrenadante para um novo tubo. Rejeitar o tubo original no balde de resíduos que contém o desinfectante. Misture bem e adicione várias quantidades da suspensão micobacteriana às duas lâminas da câmara de vidro do poço e incube as lâminas por três horas a 37 graus Celsius.Depois de pipetar para cima e para baixo três vezes para desalojar bactérias não fagocitadas, remova o meio da lâmina da câmara de vidro. Lave uma vez com dois mililitros de PBS. Descongelar as alíquotas de 4%PFA em PBS armazenadas a menos 20 graus Celsius.Diluir a alíquota a 2%PFA e adicionar dois mililitros a cada alvéolo. Depois de incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, remova a lâmina do armário de segurança para coloração. Descarte o PFA no recipiente de resíduos químicos PFA e lave o escorregador sob um fluxo suave de água da torneira.Usando uma pipeta de transferência de plástico, dispense auramina suficiente para cobrir as células na lâmina e incube a lâmina por um minuto à temperatura ambiente no escuro. Lave o excesso de corante da lâmina com água da torneira e adicione o quencher por um minuto no escuro. Depois de lavar o excesso de quencher, incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente com a mancha Hoechst no escuro.Em seguida, lave a mancha Hoechst. E depois de drenar o excesso de água, adicione uma gota de antifade e um deslizamento de cobertura. Examine a lâmina seca ao ar sob o microscópio fluorescente usando a objetiva de óleo de 100x.As micobactérias fluorescerão em verde sob o filtro Fitz e os núcleos fluorescerão em azul sob o filtro DAPI. Conte o número de micobactérias fagocitadas por célula e a porcentagem de células infectadas para determinar o MOI. Calcule o volume de suspensão de micobactérias necessário para atingir o MOI necessário com base na área de superfície de um poço na placa.Depois de misturar a suspensão de micobactérias, adicione o volume calculado às células em placas de 12 poços para obter o MOI desejado. Incubar a placa a 37 graus Celsius por três horas para permitir que as micobactérias sejam fagocitadas. Em seguida, remova as bactérias extracelulares lavando os poços com RPMI quente várias vezes.Adicione 500 microlitros de tampão de lise por 10 minutos para lisar os macrófagos em um poço da amostra de três horas e colete o lisado para determinar a taxa de infecção basal. Em seguida, adicione o RPMI completo fresco e as doses de drogas necessárias, ou controle do veículo, aos poços restantes. Incubar as placas na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por um a oito dias, dependendo do projeto do experimento.Para determinar o tempo percentual de positividade, ou TTP, do inóculo inicial da amostra de três horas, aqueça o caldo de Middlebrook e os frascos de cultura de instrumentos à temperatura ambiente. Transfira o meio da placa de 12 poços para os tubos cônicos rotulados correspondentes e adicione 500 microlitros de tampão de lise estéril a cada poço. Após 10 minutos, raspe suavemente as células do poço com um raspador estéril e combine-as com o meio no tubo cônico apropriado.Uma vez que o poço é lavado com 0,5 mililitros de PBS estéril e combinado com o meio e lisado, quebre os aglomerados passando suavemente cada amostra através de uma seringa de agulha de calibre 25 seis a oito vezes. Diluir a amostra em caldo MB adicionando 900 microlitros de caldo MB a 100 microlitros de amostra e repetir o processo de colheita nos momentos necessários durante a incubação. Prepare os frascos do painel de instrumentos esterilizando a tampa de borracha com álcool a 70%.Transfira suplementos nutricionais suficientes para todas as amostras em um tubo cônico e use uma agulha e seringa para injetar 0,5 mililitros de suplemento nutricional no frasco de cultura do instrumento. Em seguida, pipete 500 microlitros da amostra diluída de um em cada 10 em um tubo de um mililitro em V-bottom. Use uma agulha e seringa para injetar os 500 microlitros de amostra nos frascos de cultura do instrumento atribuídos.Depois de transportar cuidadosamente as garrafas do armário de biossegurança para o instrumento de carregamento, pressione o botão "loading" no sistema automatizado de detecção microbiana. Digitalize os códigos de barras em garrafas de cultura de instrumentos e coloque as garrafas na incubadora do sistema de detecção a 37 graus Celsius por até 42 dias. Leia e registre o tempo necessário para alcançar a positividade a partir da tela do instrumento e calcule a porcentagem de TTP.Um TTP positivo indica crescimento micobacteriano. O instrumento automatizado de cultura líquida monitorou os níveis de dióxido de carbono a cada 10 minutos e calculou o TTP, que é o número de dias desde a inoculação até que as culturas sejam sinalizadas como positivas. Foi ilustrada uma relação inversa entre a PTT e os valores log(10) da UFC no inóculo inicial.Quando o crescimento intracelular de Mycobacterium tuberculosis dentro de macrófagos determinado pela enumeração da UFC foi comparado ao método de cultura automatizada descrito, obteve-se uma correlação significativa entre os resultados. O crescimento do Mycobacterium tuberculosis foi apresentado graficamente comparando-se os valores de TTB por até oito dias após a infecção dos macrófagos com o valor inicial de PTT. Uma tendência semelhante entre UFC e cultura líquida demonstrou inibição significativa do crescimento do Mycobacterium tuberculosis em macrófagos na presença de ácido retinóico totalmente trans, ou AtRA, em solução, ou a dose equivalente de AtRA encapsulada em micropartículas de PLGA.Um experimento dose-resposta foi realizado em células THP-1 infectadas para determinar a eficácia do antibiótico Linezolida isoladamente, ou a combinação de linezolida e interferon gama. Não foi observada interação significativa entre os fármacos. A coloração AFP nos permite usar um MOI baixo para minimizar a morte celular ao infectar macrófagos e garantir que o mesmo MOI seja usado, independentemente do tratamento usado.Seguindo esse protocolo, os medicamentos anti-TB de chumbo podem ser identificados e estudados mais a fundo para investigar sua eficácia in vivo.

an-automated-culture-system-for-use-preclinical-testing-host-directed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Testes de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis é um desafio, mas fundamental para o atendimento ao paciente. Este formato de placa de microtitulação oferece testes de 12 drogas antimicobacterianos e fornece concentração inibitória mínima (MIC) valores, o que ajudará no tratamento adequado.

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia de medicamentos contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  É gerado um modelo de infecção in vitro contendo agregados de Mtb/macrófagos que mimetiza a infecção in vivo. Após a introdução de antibióticos adequados, sua eficácia é testada por meio do ensaio de resuzarina para monitorar a sobrevivência das bactérias com o aumento das concentrações de drogas.

Um ensaio para avaliar a eficácia do medicamento contra um modelo de infecção por Mycobacterium tuberculosis

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Aqui, demonstramos a preparação do filtrado de cultura Mtb (CF), que é o meio de crescimento bacteriano que consiste em proteínas secretadas pela bactéria. O Mtb secreta proteínas para modular a sinalização do hospedeiro e a resposta imune, que são cruciais para a patogênese. Os FCs preparados são analisados por espectrometria de massas para identificar todos os fatores secretores.

Preparação do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis para entender a patogênese da TB

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos por meio de triagem fenotípica, abrangendo a síntese química de um composto de 4-aminoquinolina, a determinação de sua concentração inibitória mínima contra Mycobacterium tuberculosis e a avaliação de sua citotoxicidade em linhagens celulares de mamíferos.

Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda um método automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento intracelular de Mycobacterium tuberculosis em macrófagos. Esta técnica simplificada permite a triagem rápida de fármacos aprovados para terapias dirigidas ao hospedeiro contra a tuberculose.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

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