Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo
August 2nd, 2021
Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.
A iniciação da apoptose é mediada pela ativação de caspases em plataformas moleculares marcadoras. Apresentamos a detecção do disc complexo de morte celular de iniciação chave, que serve como uma plataforma para ativação caspase-8. A vantagem dessa técnica é que permite a detecção do conjunto e a composição do complexo disc, juntamente com o fornecimento de informações sobre o processamento caspase-8 neste complexo.
Comece o experimento com células que são de 80% a 90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes. Em seguida, estimule as células com a concentração selecionada de CD95L segurando a placa em um ângulo e encalhando o ligante para o meio sem tocar nas células aderentes.
Para colher as células, coloque o prato de célula no gelo. Adicione 10 mililitros de PBS frios à suspensão da célula e raspe as células anexadas da placa. Colete a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros.
Lave o prato da célula com 10 mililitros de PBS frio duas vezes e adicione a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernasce, resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS frio.
Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a suspensão celular e resuspensar a pelota celular em um mililitro de PBS frio novamente. Repita a centrifugação mais uma vez, depois resuspense a pelota celular em um mililitro de tampão de lise e incuba-a por 30 minutos no gelo.
Após a incubação, centrifute o lysate em velocidade máxima por 15 minutos a quatro graus Celsius, em seguida, transfira o sobrenante para um tubo limpo. Descarte a pelota e colete uma amostra de 50 microliter do lysate em outro tubo para determinar a concentração proteica. Para imunoprecipitação, adicione dois microliters de anticorpo anti-APO1 e 10 microlitres de contas de proteína sepharose preparadas ao lise.
Adicione 10 microliters das contas sozinhos a um tubo separado contendo o lysate para servir como um controle de contas. Incubar a mistura contendo o liseto, os anticorpos e as contas de proteína sepharose durante a noite a quatro graus Celsius com mistura suave. No dia seguinte, centrifufique a mistura a 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernasce, lave as contas adicionando um mililitro de PBS frio e descartando o supernatante após centrifugação. Repita este passo pelo menos três vezes. Depois de descartar a última lavagem PBS, aspire as contas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 microliter.
Para executar a mancha ocidental, adicione 20 microliters de tampão de carregamento 4X às contas e aqueça a 95 graus Celsius por 10 minutos. Simultaneamente, aqueça os controles de lise a 95 graus Celsius durante cinco minutos. Carregue os lises, imunoprecipitantes e um padrão de proteína em um gel SDS de 12,5% e execute com uma tensão constante de 80 volts.
Após a execução do gel, transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana nitrocelulose. Após a transferência estiver completa, coloque a membrana manchada em uma caixa e incuba-a por uma hora na solução de bloqueio sob agitação suave, depois lave a membrana três vezes por cinco minutos com PBST. Para detectar as proteínas, adicione o primeiro anticorpo primário na diluição indicada à membrana e incuba-o durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave.
No dia seguinte, lave a membrana com três lavagens PBST de cinco minutos, depois incuba a membrana com 20 mililitros de anticorpo secundário com agitação suave por uma hora à temperatura ambiente. Lave a membrana três vezes com PBST novamente. Depois de descartar a última lavagem PBST, adicione aproximadamente um mililitro de substrato de peroxidase de rabanete à membrana e detecte o sinal de quimioluminescência.
Estimulação do câncer cervical As células HeLa-CD95 com CD95L resultaram em um alto nível de formação de DISCO CD95 monitorado via imunoprecipitação CD95. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPS foram observados nessas imunoprecipitações CD95 indicando formação eficiente de DISCOs. Os produtos de decote de p43-FLIP e p22-FLIP foram detectados nas imunoprecipitações, indicando ativação do invólucro-8.
Células HeLa-CD95 que expressam por longo tempo c-FLIP foram utilizadas para análise da formação de DISCO CD95. Semelhante às células HeLa-CD95 parentais, não foi detectado o recrutamento de FADD, procaspase-9, procaspase-10, proteínas c-FLIP e PARP1 nas imunoprecipitações dessas células sem tratamento CD95L. As células T primárias ativadas foram caracterizadas por altos níveis de CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPS em imunoprecipitações anti-CD95.
Esta técnica permite a análise da formação de DISC molecular, incluindo o processamento de caspase-8 no DISCO. Todas as etapas de lavagem são muito importantes. Além disso, os pontos de estimulação e os tempos de incubação devem ser levados a sério.
Esta é a única maneira de medir a montagem no complexo DISC. No entanto, para medir a ativação caspase-8, pode-se também implementar ensaios de atividade caspase-8. Essa abordagem nos permitiu obter novas percepções sobre a iniciação da apoptose.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um fluxo de trabalho experimental para detectar o processamento da caspase-8 no complexo de sinalização indutora de morte (DISC). A metodologia permite a determinação da composição do complexo DISC, que tem amplas aplicações na compreensão das vias de morte celular e redes de apoptose.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Apoptose
- Mecanismos Moleculares
Fundamentos
- A apoptose é iniciada pela ativação da caspase em plataformas moleculares específicas.
- O complexo DISC é crucial para a ativação da caspase-8.
- Compreender a composição do DISC pode fornecer insights sobre os mecanismos de morte celular.
- Esta técnica melhora a capacidade de estudar a dinâmica da apoptose.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método para detectar a montagem e composição do DISC.
- Fornecer insights sobre o processamento da caspase-8 dentro do DISC.
- Facilitar a pesquisa em redes de apoptose.
Métodos Utilizados
- Comece com células aderentes a 80% a 90% de confluência.
- Substitua o meio por meio fresco.
- Estimule as células com CD95L pipetando no meio.
- Observe a montagem do complexo DISC.
Principais Resultados
- A metodologia detecta com sucesso a composição do DISC.
- O processamento da caspase-8 foi observado diretamente no DISC.
- A técnica permite a modelagem dinâmica das redes de apoptose.
- Aplicações amplas no estudo das vias de morte celular foram identificadas.
Conclusões
- Este fluxo de trabalho experimental melhora a compreensão da apoptose.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores estudando mecanismos de morte celular.
- Os resultados podem levar a novas percepções em estratégias terapêuticas visando a apoptose.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding the composition and dynamics of the death-inducing signaling complex (DISC) is critical for de-risking apoptosis-targeted therapeutic strategies. This method enables direct measurement of procaspase-8 recruitment and processing within the DISC, providing mechanistic insights that support target validation in extrinsic apoptosis pathways. By quantifying DISC formation and caspase-8 activation, researchers can assess target engagement and pathway modulation with greater predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DISC assembly to validate death receptor targets like CD95/Fas in apoptosis pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible immunoprecipitation-western blot workflow to assess target complex formation and caspase-8 processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of DISC components (CD95, FADD, procaspase-8/10, c-FLIP) and cleavage products for assay standardization.
- Operational Value: Supports development of cell-based assays to screen modulators of death receptor signaling with defined biochemical outputs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links DISC composition to caspase-8 activation, enabling mechanistic de-risking of apoptosis-inducing compounds in disease-relevant systems.
- Operational Value: Facilitates comparison of DISC dynamics across models (e.g., HeLa-CD95, primary T-cells) to support translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by providing biochemical evidence of pathway modulation at the DISC level.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of death receptor agonists or antagonists by measuring DISC assembly and caspase-8 processing.
- Screening: Enables assay readiness through standardized detection of DISC components and cleavage fragments as quantitative endpoints.
- Analytics: Delivers measurable outputs (e.g., p43-FLIP, p22-FLIP cleavage) that allow comparison of compound effects on caspase-8 activation within the DISC.
- Translational Research: Connects early DISC dynamics to apoptotic outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing death receptor-targeted therapeutics across multiple apoptosis models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by directly measuring caspase-8 processing at the DISC.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for DISC analysis applicable across adherent and primary cell models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis-inducing compound screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of death receptor modulators based on DISC engagement and caspase-8 activation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, western blotting, and apoptosis biology.
- Dependent on high-quality antibodies (e.g., anti-APO1/CD95) and Protein A Sepharose beads for efficient DISC isolation.
- Necessitates standardized cell stimulation, lysis, and washing conditions to ensure reproducible DISC recovery.
- Adaptation to non-adherent or primary immune cells may require optimization of stimulation and harvesting steps.
- Practical limitations include the need for careful titration of death ligand (e.g., CD95L) to avoid nonspecific activation and ensure physiological relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Preparing Cells and CD95L Stimulation
1:11
Cell Harvest and Lysis
2:29
Immunoprecipitation
3:28
Western Blot
4:21
Western Blot Detection
5:05
Analysis of CD95 DISC Formation in HeLa-CD95 cells, c-FLIPL-overexpressing HeLa-CD95 cells, and Primary T Cells
6:25
Conclusion
