Quantificação Absoluta de Pirofosfatos de Inositol por Eletroforese Capilar Eletrospray Ionização Espectrometria de Massa
13 de agosto de 2021
Um procedimento para espectrometria de massa por ionização por eletrospray de eletroforese capilar para a quantificação absoluta de pirofosfatos de inositol de extratos de células de mamíferos é descrito.
Isso fornece resultados de alta qualidade para o metabolismo do fosfato de inositol em todos os organismos que testamos até agora. Ele também fornecerá informações sobre a nova via biossintética celular que estamos atualmente cientes. A análise do metabolismo do fosfato de inositol por CE-ESI-MS é mais rápida, altamente sensível, e capaz de fornecer informações de estrutura para conjuntos de fosfato de inositol.
Para começar, configure um sistema de Espectrometria de Massa de Ionização por Eletrospray de Eletroforese Capilar ou CE-ESI-MS consistindo de um sistema CE comercial e um espectrômetro de massa em tandem quadrupolo triplo, equipado com uma fonte ESI Agilent Jet Stream. Em seguida, conecte o divisor de fluxo 1:100 da bainha e a saída da bomba de cromatografia líquida isocrática e verifique se o frasco de entrada do sistema CE está na mesma altura que a ponta do pulverizador do analisador de massa. Em seguida, utilize a versão MassHunter Workstation ou software MS semelhante, para controlar todo o sistema e aquisição e análise de dados.
Depois de preparar o tampão de corrida CE e o líquido da bainha, instale o líquido da bainha purgando a cinco mililitros por minuto durante cinco minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto e a pressão da bomba para 180 bar. Certifique-se de que a tubulação reciclada se conecta de volta ao frasco líquido da bainha para reutilizar o solvente.
Em seguida, usando um cortador de coluna capilar com uma lâmina diamantada rotativa, corte adequadamente ambas as extremidades de um capilar CE-MS com uma janela de detecção UV. Em seguida, remova dois a três centímetros de revestimento de poliimida em ambas as extremidades com um isqueiro e limpe a superfície capilar com isopropanol. Para instalar o capilar, combine o capilar no CE-MS.
Em seguida, clique no botão Alterar e instale o no dispositivo CE. Para ativar o capilar, primeiro lave o capilar com um hidróxido de sódio molar, seguido de água por 10 minutos e, em seguida, o tampão de corrida CE por 15 minutos. Em seguida, insira o capilar no pulverizador CE-MS.
Usando uma lupa e o parafuso de ajuste no pulverizador, ajuste com precisão a saída capilar, garantindo que a extremidade capilar se projete aproximadamente 0,1 milímetros para fora da ponta do pulverizador. Verifique a estabilidade do pulverizador ESI no modo Full Scan. A flutuação dos eletroferogramas de íons totais deve estar dentro de 5% Em seguida, realize um teste com padrões de fosfato de inositol.
Após a preparação da mistura de padrões internos, misture 10 microlitros da amostra com 0,5 microlitros da mistura de padrões internos e um frasco para injetáveis de amostra CE. Ao usar o sistema de reabastecimento, clique no botão Alterar garrafa. Coloque os 250 mililitros preparados de buffer de funcionamento CE no frasco de eletrólitos.
Em seguida, clique em Limpar tubos mantendo a agulha de reabastecimento em um frasco de água. Defina os parâmetros ESI e MS. Em seguida, otimize os parâmetros da fonte usando um otimizador de fonte com uma mistura de padrões de polifosfato de inositol e várias configurações de monitoramento de reação usando o MassHunter Optimizer com todos os padrões.
Em seguida, execute uma corrida para os extratos de fosfato de inositol e verifique os resultados. Defina uma sequência quando houver mais amostras. Após a medição, deixe o MS estar no modo de espera e não desligue a bomba de cromatografia líquida.
Substitua o pulverizador CE-ESI-MS por um pulverizador LC-ESI-MS quando não houver fornecimento de líquido da bainha. Para análise de dados, abra o software de Análise Quantitativa e crie um lote para todas as amostras. Em seguida, crie um novo método a partir dos dados de monitoramento de reações múltiplas adquiridas e defina os fosfatos de inositol de carbono-13 como padrões internos.
Em seguida, verifique a configuração do Composto de Monitoramento de Reações Múltiplas, Tempo de Retenção, Padrões internos, Concentração e Qualificador. Passe a Validação e Saída para aplicar o método ao lote atual. Salve o método.
Em seguida, verifique se cada pico no lote está integrado corretamente. Caso contrário, integre manualmente o pico. Exportar os resultados para uma planilha e quantificar os pirofosfatos de inositol, comparando a resposta de pico do anolito com a respectiva resposta de pico do isótopo estável rotulado padrões internos com concentrações conhecidas.
Finalmente, com a concentração medida no fosfato de inositol, solução de extrato e seu volume, calcular as quantidades absolutas e normalizar ainda mais a quantidade por contagens de células ou teor de proteína. Calcule a concentração celular com base na contagem de células e no volume celular médio das células HCT116. Os eletroferogramas de íons extraídos dos padrões de pirofosfato de inositol em uma concentração de dois micromoles são mostrados aqui.
O metabolismo dos pirofosfatos de inositol em mamíferos com suas estruturas simplificadas é inserido. Uma execução ce-esi-ms de células HCT116 da University College London ou UCL é mostrada aqui. O CE-MS foi usado para quantificar a variação nos níveis de IP8 entre as células HCT116 da UCL e as do NIH.
As células HCT116 da UCL contêm níveis sete vezes mais elevados de IP8 do que as do NIH. O acúmulo significativo de 1, 5-IP8 nas células HCT116 UCL é paralelo a um aumento considerável no 1-IP7. A análise CE-ESI-MS de células HCT116 tratadas com fluoreto de sódio do NIH demonstrou uma elevação de 5-IP7, juntamente com uma redução no IP6 e um aparecimento de 5-PPIP4.
Embora os níveis de 1-IP7 tenham diminuído até certo ponto, ele não está completamente ausente nas células tratadas com fluoreto de sódio, mas principalmente abaixo do limite de detecção. É importante formar uma classe CE-ESI-MS estável. Recomendamos verificar a repetibilidade e a sensibilidade do sistema antes das medições.
Esta técnica permite fornecer metabolismo de fosfato de inositol, implantes e tecidos, e também fornecer uma oportunidade para estudar de perto o pirofosfato de inositol biologicamente relevante.
Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para espectrometria de massa de ionização por eletrospray de eletroforese capilar (CE-ESI-MS) para quantificar pirofosfatos de inositol a partir de extratos de células de mamíferos. O método é conhecido por sua velocidade, sensibilidade e capacidade de fornecer informações estruturais sobre conjuntos de fosfato de inositol.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectrometria de Massa
- Bioquímica
- Biologia Celular
Fundamentos
- Os pirofosfatos de inositol desempenham um papel crucial na sinalização celular.
- Entender seu metabolismo pode fornecer insights sobre vários processos biológicos.
- CE-ESI-MS oferece um método de análise rápido e sensível.
- Métodos anteriores não tinham a eficiência e o detalhe fornecidos pelo CE-ESI-MS.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para quantificar pirofosfatos de inositol.
- Analisar o metabolismo de fosfato de inositol em células de mamíferos.
- Explorar variações nos níveis de pirofosfato de inositol em diferentes linhagens celulares.
Métodos Utilizados
- Configuração de um sistema CE-ESI-MS com configurações específicas de equipamentos.
- Preparação do buffer de execução CE e do líquido de bainha.
- Lavagem e ativação da capilar para desempenho ideal.
- Aquisição e análise de dados usando o software MassHunter.
Principais Resultados
- CE-ESI-MS quantificou com sucesso os níveis de pirofosfato de inositol em células HCT116.
- Diferenças significativas nos níveis de IP8 foram observadas entre células HCT116 de diferentes fontes.
- Alterações no metabolismo de fosfato de inositol foram notadas com o tratamento de fluoreto de sódio.
- O método demonstrou alta repetibilidade e sensibilidade.
Conclusões
- CE-ESI-MS é uma ferramenta valiosa para estudar o metabolismo de fosfato de inositol.
- A técnica pode melhorar nossa compreensão das vias biossintéticas celulares.
- Aplicações futuras podem incluir estudos mais amplos sobre fosfatos de inositol em vários contextos biológicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantitation of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) enables mechanistic de-risking in target validation by providing quantitative readouts of phosphate homeostasis and cellular energy charge. This CE-ESI-MS method supports assay development for intracellular signaling pathways, offering baseline separation of regioisomers and absolute concentration data. The approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling temporal monitoring of PP-InsPs under experimental conditions, informing go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking PP-InsPs to metabolic signaling and insulin sensitivity pathways.
- Operational Value: Provides high-throughput, sensitive quantification of low-abundance PP-InsPs without radioactive tracers, reducing assay complexity and cost.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by delivering absolute cellular concentrations of PP-InsPs, including minor isomers, for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers baseline separation of PP-InsP regioisomers, enabling specific detection of biologically relevant species in mammalian cells.
- Operational Value: Offers reproducible, quantitative outputs via stable isotope-labeled internal standards, ensuring assay standardization across runs.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening compound effects on inositol phosphate metabolism in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase PP-InsP dynamics to preclinical validation by monitoring temporal changes in HCT116 cells under experimental conditions like sodium fluoride treatment.
- Mechanistic De-risking: Reveals alterations in IP7/IP8 levels and PPIP4 appearance, supporting pathway-specific biomarker alignment and risk-adjusted advancement decisions.
- Disease-Relevant System: Applicable to studying phosphate homeostasis and cellular energy charge in oncology and metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by supplying quantitative, structurally resolved PP-InsP data that inform mechanistic understanding and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PP-InsPs as metabolic messengers surveying phosphate homeostasis and insulin sensitivity.
- Screening: Enables assay readiness through sensitive detection and baseline separation of PP-InsPs, allowing reliable compound evaluation in metabolic signaling assays.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (absolute concentrations, temporal changes) via MRM, enabling statistical comparison across conditions and cell lines.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by monitoring PP-InsP modulation in disease-relevant systems, supporting biomarker alignment and risk-adjusted decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable CE-ESI-MS capability for longitudinal studies of inositol phosphate metabolism across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through absolute quantitation of PP-InsPs, reduction of mechanistic ambiguity in inositol phosphate signaling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and sensitivity achieved via CE-ESI-MS with internal standard normalization and optimized source parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via quantitative PP-InsP readouts, capital efficiency by avoiding radioactive methods, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on PP-InsP modulation data, enabling informed advancement of compounds affecting phosphate homeostasis and energy signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry optimization, and metabolite quantification using stable isotope-labeled standards.
- Needs instrumentation including a commercial CE system, triple quadrupole MS with Agilent Jet Stream ESI source, and MassHunter software for data acquisition and analysis.
- Demands cross-team standardization of CE running buffer preparation, sheath liquid flow rates (1 mL/min), and capillary installation procedures to ensure ESI spray stability (<5% TIC fluctuation).
- Involves adaptation considerations for different sample types (cells, tissues) requiring normalization to cell counts or protein content and appropriate internal standard selection.
- Includes practical limitations such as the need for system repeatability and sensitivity checks before measurements, and potential interference from high-abundance inositol phosphates during method development.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
