Name: Quantificação Absoluta de Pirofosfatos de Inositol por Eletroforese Capilar Eletrospray Ionização Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a quantificar pirofosfatos de inositol em células mamíferas usando eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas. Este método rápido e sensível permite analisar o metabolismo de fosfatos de inositol com alta precisão.

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Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Investigação (CEI) no âmbito do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (convenção de subvenção n.º 864246, para a HJJ). A DQ reconhece o apoio financeiro do Programa Brigitte-Schlieben-Lange. O AS é apoiado pela concessão do programa MRC MR/T028904/1.

1. Configuração do sistema CE-ESI-MS
<ol><li>Configure um sistema CE-ESI-MS que consiste em um sistema CE comercial - e um espectrômetro de massa em tandem quadrupolo triplo, equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) Agilent Jet Stream (AJS). Um kit de pulverização ce-esi-ms e uma bomba isocrática LC (Cromatografia Líquida) são necessários.</li>
	<li>Conecte o divisor de fluxo da bainha 1:100 (incluído no kit de pulverizador CE-MS) e a saída isocrática da bomba LC.</li>
	<li>Certifique-se de que o frasco para injetáveis de entrada do sistema CE está à mesma altura que a ponta do pulverizador do analisador de massa.</li>
	<li>Utilize o MassHunter Workstation (Versão 10.1) ou software MS comparável para controlar todo o sistema e para aquisição e análise de dados.</li>
</ol>2. Preparação do sistema tampão, capilar e CE-MS
<ol><li>Preparar o tampão de funcionamento CE: Ajustar o pH do acetato de amónio 40 mM para 9,0 com hidróxido de amónio. Recomenda-se um balão aferido de 250 ml. Filtre os 250 ml de tampão com filtros de membrana do tamanho de poros de 0,2 μm. Certifique-se de usar apenas água deionizada ultrapura e reagentes de grau MS. NOTA: Este tampão pode ser mantido à temperatura ambiente por 2-3 semanas ou por vários meses em uma geladeira.</li>
	<li>Preparar o líquido da bainha: Misture 100 mL de água ultrapura e 100 mL de isopropanol de grau LC-MS em um frasco de 250 mL. Troque o líquido da bainha pelo menos uma vez por semana. Adicione referência de massa ao líquido da bainha ao empregar um espectrômetro de massa de alta resolução.</li>
	<li>Instale o líquido da bainha: Purge a 5 mL/min por 5 min e defina a taxa de fluxo em 1 mL/min (10 μL/min no pulverizador CE-MS). A pressão da bomba será de cerca de 180 bar. Certifique-se de que a tubulação de reciclagem se conecte novamente ao frasco de líquido da bainha para reutilizar o solvente.</li>
	<li>Preparar capilar: Compre um capilar CE-MS (50 μm i.d. e 365 μM o.d. com um comprimento de 125 cm) com uma janela de detecção UV. O usuário também pode obter capilares de sílica fundidos em barra muito mais baratos de distribuidores especializados. Corte um capilar com um comprimento de 100 cm. Corte corretamente ambas as extremidades capilares com um cortador de coluna capilar com uma lâmina de diamante rotativa e remova 2-3 cm de revestimento de poliimida em ambas as extremidades com um isqueiro. Limpe a superfície capilar com isopropanol.</li>
	<li>Instalar capilar: Combine o capilar no CE-MS. Clique no botão Alterar e instale o no dispositivo CE. A extremidade de entrada do capilar é cerca de 2 mm mais baixa que o eletrodo. Certifique-se de que a extremidade de entrada é inferior à superfície da amostra durante o processo de injeção.</li>
	<li>Ativar capilar: Antes do primeiro uso, lave o capilar com 1 M de NaOH, seguido de água por 10 minutos e tampão de funcionamento CE por 15 minutos.</li>
	<li>Insira a extremidade capilar no pulverizador CE-MS: Coloque suavemente o capilar no pulverizador CE-MS e certifique-se de que a extremidade capilar se projete aproximadamente 0,1 mm para fora da ponta do pulverizador. Certifique-se de fazer um ajuste preciso da extremidade de saída capilar com uma lupa e o parafuso de ajuste no pulverizador. Insira o pulverizador de volta na fonte de íons e evite tocar no parafuso de ajuste. O MS está no modo de espera ao executar esta operação.</li>
	<li>Verifique o spray ESI: Verifique a estabilidade do pulverizador ESI no modo de varredura completa. A flutuação dos eletroferogramas de íons totais deve estar dentro de 5%.</li>
	<li>Executar um teste com padrões InsP: Empregar uma mistura de 2 μM InsP3-InsP 8 padrões (ajustado pelo quantitativo 31P NMR 15,27) para ensaios com uma injeção a 50 mbar por 10 s (10 nL). Defina os parâmetros ESI e MS detalhados, conforme mostrado na Tabela 1. A corrente CE é de cerca de 26 μA. A largura do pico é de cerca de 0,4-0,5 min. Certifique-se de que a relação sinal-ruído atinja pelo menos 400.</li>
</ol>3. Extração de fosfatos de inositol solúveis de células de mamíferos
NOTA: As células HCT116NIH foram um presente gentil de Stephen Shears28. As células HCT116UCL eram do Laboratório26 de Saiardi.
<ol><li>Células semeadoras<ol><li>Cultura de células HCT116NIH ou HCT116UCL em frascos T75 a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de alta umidade de 5% (também referida como condições padrão) no meio de águia modificado (DMEM) da Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).</li>
		<li>Lavar as culturas de estoque de HCT116NIH e HCT116UCL com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5 mL) e incubar as células com ácido tetraacético tripsina-etilenodiamina (EDTA) (3 mL, 0,25%) em condições padrão até que estejam completamente separadas. Tempere a atividade da tripsina adicionando meio (7 mL), colete as células em um tubo de centrífuga e centrifuga (200 x g, 3 min).</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em meio (10 mL). Conte as células e determine a viabilidade através da exclusão azul de tripano.</li>
		<li>Semar as células (6 milhões de células HCT116 por ensaio) em um prato de 150 mm e ajustar 20 mL de meio de cultura celular no total. Pré-misture o meio e as células em um tubo de centrífuga antes da semeadura para obter uma distribuição igual das células no prato. Prepare um prato paralelo quando a normalização por número de célula for necessária.</li>
		<li>Cultivar as células em condições padrão por 72 h. As células atingirão cerca de 80% a 90% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Modulação dos níveis de fosfato de inositol com NaF e colheita celular<ol><li>Tratamento com NaF: Adicionar NaF (10 mM) 1 h antes de colher no meio. Misture o meio rodopiando a placa/pipetagem e incube as células por 60 minutos em condições padrão.</li>
		<li>Após o tratamento com NaF, remova o meio das células e coloque as células no gelo.</li>
		<li>Lave as células duas vezes com PBS (5 mL, 4 °C) e remova completamente o PBS do prato.</li>
		<li>Adicionar ácido perclórico (PA) (1 ml, 1 M, 4 °C). Certifique-se de cobrir toda a superfície com PA (as células ficarão brancas à medida que as proteínas se precipitarem). Incubar as células durante 10 minutos sobre uma mesa de inclinação a 4 °C.</li>
		<li>Recolher o PA num tubo de centrífuga e remover os detritos contaminantes por centrifugação (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Adicione o sobrenadante às contas TiO2 preparadas para o pulldown de InsPs.</li>
		<li>Lavar a antena pós-extração duas vezes com PBS (5 mL, r.t.) para desacidificação; remova completamente o PBS do prato.</li>
		<li>Solubilizar as proteínas na placa através da adição de tampão de lise celular (1,5 mL, r.t.; dodecil sulfato de sódio a 0,1% [SDS] em 0,1 M de NaOH). Incube o prato por 15 min em uma mesa inclinada em r.t. Transferir o lisado celular para um tubo de centrífuga e centrífuga (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Conservar o sobrenadante a -80 °C até que a concentração de proteína seja determinada através do ensaio de proteína CC utilizando albumina sérica bovina como padrão de calibração (normalmente, um prato de 150 mm contém cerca de 10 mg de proteínas).</li>
		<li>Determinação do número de células a partir de pratos paralelos: Colha as células do prato paralelo através de tripsina, conforme descrito no passo 3.1.2 (utilizar 5 ml de tripsina-EDTA para o prato de 150 mm) e remover o meio. Ressuspeite a pastilha celular em PBS (5 mL), misture adequadamente e conte as células. Execute esta etapa logo antes da colheita através de têmpera direta para obter contagens de células representativas. Além disso, meça o volume das células com um método apropriado (por exemplo, com uma máquina multidimensionadora).</li>
	</ol></li>
	<li>TiO2 enriquecimento de fosfatos de inositol NOTA: Para evitar a decomposição ácida de compostos fosforilados, execute todas as etapas de enriquecimento até a eluição no gelo e resfrie todos os reagentes a 4 °C. Mantenha o tempo para a extração a um mínimo (1,5-2 h). Execute todas as etapas de extração com 1 M PA.<ol><li>Preparação de grânulos: Lavar as contas de TiO 2 (5 mg por amostra) com ddH2O (1 mL) e centrífuga (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Retire o ddH2O e lave as contas com PA (1 mL). Remover PA por centrifugação (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Ressuspender as esferas em PA (50 μL por amostra).</li>
		<li>Adicionar o sobrenadante contendo compostos fosforilados (comparar o ponto 3.2, passo 3.2.5) à suspensão do talão, vórtice, e girar a amostra durante 20 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Centrifugar a amostra (3,500 x g, 1 min, 4 °C) e eliminar o sobrenadante. Lavar os grânulos com PA (500 μL) e centrífuga (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Descarte o sobrenadante e repita a etapa de lavagem.</li>
		<li>Adicione NH4OH (200 μL, 3%) às contas e ressuscite. Girar a amostra durante 5 minutos a r.t.</li>
		<li>Centrifugar a amostra (3.500 x g, 1 min) e transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga.</li>
		<li>Repita os passos de eluição 3.3.4 e 3.3.5 e combine os eluentes. Descarte as contas.</li>
		<li>Centrifugar os eluentes combinados (17.000 x g, 1 min, 4 °C) para remover quaisquer resíduos insolúveis.</li>
		<li>Secar completamente o sobrenadante sob evaporação a vácuo (70 min, 60 °C, V-AQ). Adicionar ddH2O (50 μL) aos extractos secos que contenham InsPs. Vórtice para misturar a amostra até que esteja completamente dissolvida. Conservar a amostra a -20 °C até à análise CE-ESI-MS.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Executando as execuções CE-ESI-MS
<ol><li>Preparar uma mistura de padrões internos contendo 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 e 400 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Determinar as concentrações de soluções SIL IS por RMN quantitativas de 31P e 1H, com o auxílio de um padrão de referência certificado, ou seja, ácido fosfoacético. NOTA: Todos os padrões internos (SI) SIL acima do SIL com purezas superiores a 96% foram sintetizados e fornecidos pelo grupo Fiedler15,27. Assim como acontece com os nucleotídeos, esses SI podem transportar muitas moléculas de água cristalina e diversos contra-íons. Em vez de pesar a substância e calcular a concentração, recomenda-se a determinação da concentração de 13C6 soluções-padrão por RMN quantitativa de 31P.</li>
	<li>Misturar 10 μL da amostra com 0,5 μL de mistura de padrões internos num frasco para injetáveis CE para amostras. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 e 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 são as concentrações finais dentro das amostras.</li>
	<li>Ao usar o sistema de reabastecimento, clique no botão Alterar garrafa , coloque os 250 mL preparados de tampão de execução CE no frasco de eletrólitos e clique em Limpar tubos. Mantenha a agulha de reposição em um frasco para injetáveis de água.</li>
	<li>Defina os parâmetros ESI e MS conforme mostrado na Tabela 1. Otimize os parâmetros da fonte usando um otimizador de fonte com uma mistura de padrões de polifosfato de inositol. Obtenha as configurações de monitoramento de reações múltiplas (MRM) usando o Masshunter Optimizer com todos os padrões. Ajuste as configurações ESI e MS/MS para instrumentação diferente.</li>
	<li>Execute uma execução para as extrações InsP e verifique o resultado (Figura 2). Defina uma sequência quando houver mais amostras.</li>
	<li>Deixe o MS estar no modo de espera após as medições. Não desligue a bomba LC. O fluxo de líquido da bainha protege a agulha do pulverizador. Substitua o pulverizador CE-ESI-MS por um pulverizador LC-ESI-MS quando não houver fornecimento de líquido da bainha.</li>
</ol>5. Análise dos dados
<ol><li>Abra o software de Análise Quantitativa (para QQQ), crie um lote para todas as amostras.</li>
	<li>Crie um novo método a partir dos dados MRM adquiridos. Defina o [13C6]InsPs como padrões internos - (ISTD). Verifique a configuração do composto MRM, a configuração do tempo de retenção, a configuração do ISDD, a configuração de concentração e a configuração do qualificador. Passe na validação e saia para aplicar o método ao lote atual. Salve o método.</li>
	<li>Verifique se cada pico no lote está devidamente integrado; caso contrário, integre manualmente o pico.</li>
	<li>Exporte os resultados para uma planilha. Realizar a quantificação de inositol (piro)fosfatos comparando a resposta de pico do analito com a respectiva resposta de pico de SIL IS com concentrações conhecidas. As curvas de calibração teóricas e experimentais são apresentadas na Tabela 2 para 5-PP-InsP 5, InsP 6 e Ins(1,3,4,5,6)P 5 com a faixa linear. NOTA: A pré-condição para a aplicação da curva de calibração teórica é a utilização de um padrão isotópico de alta qualidade de analitos visados e com concentração credível. Avalie o intervalo linear. Uma curva de calibração é essencial para a quantificação absoluta quando a aquisição completa dos padrões isotópicos acima mencionados é impraticável.</li>
	<li>Com a concentração medida na solução de extracto de InsP e o seu volume, calcular as quantidades absolutas. Além disso, normalize a quantidade por contagem de células ou conteúdo de proteína. Calcular a concentração celular com base na contagem de células e no volume celular médio de HCT116 (1,68 fL).</li>
</ol>

<ol><li>Stephens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection%2C+purification%2C+structural+characterization%2C+and+metabolism+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate%28s%29+and+bisdiphosphoinositol+tetrakisphosphate%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s).</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).</li>
<li>Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+inositol+polyphosphate+pyrophosphates+in+pancreatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+Why+so+many+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biological+Regulation%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).</li>
<li>Irvine, R. F., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+in+the+water%3A+the+return+of+the+inositol+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back in the water: the return of the inositol phosphates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).</li>
<li>Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+inositol+pyrophosphates+on+cellular+energy+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics.</a> Science. 334 (6057), 802-805 (2011).</li>
<li>Wild, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+eukaryotic+phosphate+homeostasis+by+inositol+polyphosphate+sensor+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains.</a> Science. 352 (6288), 986-990 (2016).</li>
<li>Chakraborty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+inhibit+Akt+signaling%2C+thereby+regulating+insulin+sensitivity+and+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain.</a> Cell. 143 (6), 897-910 (2010).</li>
<li>Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+inositol+pyrophosphate+InsP8+directly+modulates+intracellular+Ca2%2B+oscillations+and+controls+C2AB+domain+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).</li>
<li>Hauke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+cell-permeant+caged+inositol+pyrophosphates+controls+oscillations+of+cytosolic+calcium+in+a+%CE%B2-cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line.</a> Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).</li>
<li>Koldobskiy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-mediated+apoptosis+requires+inositol+hexakisphosphate+kinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947(2010).</li>
<li>Rao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase-1+mediates+assembly%2Fdisassembly+of+the+CRL4-signalosome+complex+to+regulate+DNA+repair+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005(2014).</li>
<li>Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+possible+functions+of+inositol+pyrophosphates+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 67(2015).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+between+signalling+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism.</a> The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).</li>
<li>Harmel, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+13C-labeled+myo-inositol+to+interrogate+inositol+phosphate+messengers+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR.</a> Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).</li>
<li>Qiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+inositol+phosphate+metabolism+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nature Communications. 11 (1), 6035(2020).</li>
<li>Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+analysis+of+soluble+inositol+polyphosphates+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+radioactive+labelling+to+elucidate+inositol+polyphosphate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Phosphate+Labeling+and+Sensing+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling.</a> Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+purification+of+inositol+phosphates+from+biological+samples+reveals+that+no+phytate+is+present+in+human+plasma+or+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine.</a> Open Biology. 5 (3), 150014(2015).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PloS One. 4 (5), 5580(2009).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+InsP8+acts+as+an+intracellular+phosphate+signal+in+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis.</a> Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).</li>
<li>Riemer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITPK1+is+an+InsP6%2FADP+phosphotransferase+that+controls+systemic+phosphate+homeostasis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Whitfield, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATP-responsive+metabolic+cassette+comprised+of+inositol+tris%2Ftetrakisphosphate+kinase+1+%28ITPK1%29+and+inositol+pentakisphosphate+2-kinase+%28IPK1%29+buffers+diphosphosphoinositol+phosphate+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels.</a> The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+mammalian-derived+inositol+poly%2Fpyrophosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates.</a> Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).</li>
<li>Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+inositol+pyrophosphate+biosynthetic+pathway+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi.</a> ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+phosphates+purification+using+titanium+dioxide+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads.</a> Bio-Protocol. 8 (15), 2959(2018).</li>
<li>Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+chemoenzymatic+synthesis+of+inositol+pyrophosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates.</a> Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).</li>
<li>Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KO+of+5-InsP7+kinase+activity+transforms+the+HCT116+colon+cancer+cell+line+into+a+hypermetabolic%2C+growth-inhibited+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).</li>
<li>Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+Pyrophosphate+Profiling+of+Two+HCT116+Cell+Lines+Uncovers+Variation+in+InsP8+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels.</a> PloS One. 11 (10), 0165286(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Apresentado aqui é um método prático e sensível para a quantificação de pirofosfatos de inositol altamente carregados em células de mamíferos. Combinando essa abordagem de análise com a atual extração InsP de última geração com ácido perclórico, seguida de enriquecimento com TiO2, a análise CE-ESI-MS tem vantagens sem precedentes. Com relação à sua taxa de transferência, sensibilidade, estabilidade, quantificação absoluta, identificação de isômeros e independência de matriz, esse método se destaca em comparação com outras abordagens. Este protocolo é aplicável a células de mamíferos, mas de fato essa estratégia é bem-sucedida em muitas amostras diferentes (por exemplo, leveduras, plantas, parasitas, tecidos de camundongos, etc.).
O protocolo de extração aplicado recupera totalmente PP-InsPs e InsP6 de extratos celulares de mamíferos16,19. Ele também extrairá muitos outros metabólitos aniônicos, particularmente espécies contendo fosfato, por exemplo, fosfatos de açúcar e nucleotídeos. Seria necessária a avaliação da recuperação e decomposição dos analitos do usuário com este protocolo.
Geralmente, o sistema CE-ESI-MS funciona sem problemas e pode acomodar cerca de 200 amostras por semana usando este protocolo. Ao contrário da HPLC, porém, a CE tem sido considerada um método para especialistas e pessoas especializadas por um longo tempo, o que restringiu seu mercado e limitou sua aplicação. Assim, um dispositivo CE-ESI-MS geralmente está ausente nas faculdades analíticas. As pessoas que desejam realizar a análise CE-ESI-MS provavelmente não têm experiência em CE e passarão mais tempo solucionando problemas. Aqui, as etapas críticas são destacadas. Em primeiro lugar e acima de tudo é a qualidade do corte capilar. A sensibilidade e a estabilidade do spray ESI dependem principalmente de um corte capilar de primeira classe. Em segundo lugar, a extremidade de saída capilar deve estar exatamente 0,1 mm fora da ponta do pulverizador. A agulha do pulverizador e o capilar CE devem estar na direção axial. A qualidade do spray ESI é fundamental para a quantificação; Execuções técnicas devem ser realizadas para avaliar a repetibilidade. 
Com o protocolo descrito, o limite de quantificação (LOQ) para PP-InsPs é de 40 nM com uma injeção a 50 mbar por 10 s (10 nL). Existem várias abordagens para aumentar ainda mais a sensibilidade do método. Em primeiro lugar, uma injeção a 100 mbar por 20 s (40 nL) ainda resultará em uma boa forma de pico e resolução suficiente para regioisomers 5-PP-InsP 5 e 1-PP-InsP5. Em segundo lugar, os extratos de InsP podem ser dissolvidos em uma quantidade menor de água. Em terceiro lugar, o tempo de permanência poderia ser aumentado ao usar menos transições de MRM para quantificação. Além disso, uma fonte de íons CE-MS usando fluxo líquido de bainha ultra-baixo aumentaria significativamente a sensibilidade.
O tampão de execução CE com pH 9 fornece a melhor resolução entre InsP6-InsP 8. Ao aumentar o pH para 9,7, a resolução entre InsP3-InsP 6 melhorará significativamente. Devido à excelente resolução, recomenda-se um comprimento capilar mais curto, de 72 cm, para aumentar ainda mais o rendimento. Além disso, uma temperatura mais alta do CE a 40 °C diminui a viscosidade do tampão eletroforético aquoso e acelera seu movimento sob EOF. De acordo com diferentes demandas de pesquisa, modificações desse método podem facilitar ainda mais a análise de InsPs e PP-InsPs. Portanto, os protocolos CE-ESI-MS descritos têm o potencial de abrir novos caminhos de pesquisa para essa família multifacetada de moléculas sinalizadoras.

Desde a descoberta inicial dos pirofosfatos de mio-inositol (PP-InsPs) em 1993 1,2, progressos significativos foram feitos para elucidar sua biossíntese, rotatividade e funções3. Os pirofosfatos de inositol ocorrem onipresente em células eucarióticas4 e servem como moléculas de sinalização metabólica criticamente envolvidas, por exemplo, homeostase de fosfato5,6, sensibilidade à insulina7, oscilações de cálcio8,9, tráfico vesicular 10, apoptose 11, reparo de DNA 12, sinalização imunológica 13 , entre outros. A infinidade de processos importantes sob o controle de pirofosfatos de inositol exige uma compreensão mais profunda de sua abundância celular, flutuação e localização.
Embora InsPs e PP-InsPs tenham atraído a atenção em todas as disciplinas, a análise de sua abundância é rotineiramente realizada usando um método desenvolvido durante os anos 80, consistindo em marcar células com inositol tritiado, resolvendo os PP-InsPs extraídos por forte cromatografia de troca de ânions Sax-HPLC com subsequente contagem de cintilação. Novos métodos baseados em espectrometria de massa ainda enfrentam desafios significativos: pirofosfatos de inositol com até oito unidades de fosfato abrigam ésteres de fosfato e anidridos, levando a uma carga negativa significativa e perda potencial de fosfato durante a ionização. Existem quatro tipos principais de PP-InsPs encontrados em mamíferos (Figura 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (ou 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (ou 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (ou 1-InsP7) e 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (ou5-PP-InsP 4)3,14. Os níveis fisiológicos de PP-InsPs estão tipicamente na faixa nano a micromolar baixa, com 5-PP-InsP 5 como o mais abundante com concentrações celulares de 0,5 - 5 μM. Acredita-se que 1,5-(PP)2-InsP 4 e 1-PP-InsP 5 sejam até cerca de 10% do pool de 5-PP-InsP5 e permaneçam difíceis de rastrear em muitas células15. O 5-PP-InsP4 com grupo OH livre é ainda menor em abundância e geralmente só se torna detectável quando as hidrolases de fosfato são inibidas com fluoreto de sódio (NaF)16.
A alta densidade de carga dos PP-InsPs dificulta sua separação, e a ocorrência de regioisomers PP-InsP complica ainda mais esses esforços. Como resultado, a maioria dos experimentos baseou-se na quantificação por marcação radioativa metabólica de células usando [3H]-inositol, uma vez que o fundo da matriz é excluído e alta sensibilidade é alcançada17,18. No entanto, esse método é caro, demorado e não permite distinguir adequadamente os regioisômeros PP-InsP relacionados. Além disso, a marcação de [3H]-inositol não é responsável pela síntese endógena de inositol a partir da glicose. Um método à base de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma alternativa de baixo custo amplamente aplicada, mas limitada em sua sensibilidade 19,20,21,22. Outras abordagens que evitam a radiomarcação foram publicadas, incluindo cromatografia iônica seguida de derivatização pós-coluna detecção UV23, cromatografia de interação hidrofílica (HILIC)24 ou troca ânion fraca (WAX) acoplada à espectrometria de massas (MS)25. No entanto, eles não estão (ainda) a par com o clássico [3H]-inositol SAX-HPLC protocolo.
Recentemente, a espectrometria de massas por ionização por eletrospray de eletroforese capilar (CE-ESI-MS) foi introduzida como estratégia transformadora para a análise do metabolismo de InsPs e PP-InsPs, atendendo a todos os requisitos discutidos acima16. Combinado com a atual extração InsP de última geração por ácido perclórico seguido de enriquecimento com contas de dióxido de titânio26, o CE-ESI-MS teve sucesso em todos os organismos testados até agora, de leveduras a plantas e mamíferos. O perfil simultâneo de InsPs e PP-InsPs, incluindo todos os possíveis regioisômeros, foi facilmente alcançado. Os padrões internos estáveis marcados com isótopos (SIL) permitiram uma quantificação absoluta rápida e precisa, independentemente dos efeitos da matriz. Como a EM pode capturar diferenças de massa isotópicas, a CE-ESI-MS também pode ser aplicada para estudar as vias de síntese celular compartimentadas de InsPs e PP-InsPs, por exemplo, alimentando células com [13 C 6]-mio-inositol ou [13C6]-D-glicose.
Descrito aqui está um protocolo passo-a-passo detalhado para a quantificação absoluta de PP-InsPs e InsPs de células de mamíferos por CE-ESI-MS. Além do principal isômero 5-PP-InsP 5, 1,5-(PP)2-InsP 4 e 1-PP-InsP5 também são quantificados neste estudo, apesar de sua menor abundância. Duas linhagens celulares de HCT116 de diferentes laboratórios (NIH, UCL) são estudadas, e é validado que as células HCT116UCL contêm níveis 7 vezes mais altos de 1,5-(PP)2-InsP 4 do que os encontrados no HCT116NIH, enquanto as concentrações de 5-PP-InsP5 são comparáveis. Além disso, a síntese de 1-PP-InsP5 na LCU HCT116não é significativamente aumentada. Além disso, o aumento dos níveis de PP-InsP bloqueando sua desfosforilação usando fluoreto de sódio é estudado quantitativamente.

<table><tbody><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Greiner</td><td>Bio-One Placas de</td> cultura de tecidos de <td>616201-15</td><td></td></tr> <tr><td>cm</td><td>Thermo Fisher</td> Tubos de microcentrífuga <td>de</td> <td>168381-2,0</td></tr> <tr><td>mL</td><td>Greiner Bio-One Tubos de</td> centrífuga <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>623201-50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>Placas</td> <td>de 227261-96</td></tr> <tr><td>poços</td><td>Thermo Fisher</td><td>260836</td><td>para o ensaio de proteína DC</td></tr><tr><td>Sílica fundida CE capilar</td><td>CS Cromatografia</td><td>105180</td><td>50 &micro; M i.d. 360 &micro; M o.d.</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>Starlab</td><td>I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700</td><td>10 mL, 1000 &micro; L, 200 &micro; L, 10 &micro; Ponteiras de pipeta L</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>TPP</td><td>94550, 94525, 94010, 94005</td><td>50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL pipetas sorológicas</td></tr><tr><td>Frascos T75 TPP</td><td></td><td>90076</td><td>-</td></tr><tr><td>Chemicals and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem</td><td>A6829,0500</td><td>pellets de hidróxido de sódio para biologia molecular, para preparação de células tampão de lise</td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>acetato</td> <td>de 25200056-amônio</td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>1677373</td><td>HPLC grau</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermo Fisher</td><td>23209</td><td>padrão de albumina (2,0 mg/mL) para preparação de curva padrão</td></tr><tr><td>Ensaio de proteína DC</td><td>Biorad</td><td>5000116</td><td>Pacote de reagentes de ensaio de proteína DC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td>glicose alta, piruvato</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106, 10500064 (inativado pelo calor)</td><td>10270106 para HCT116UCL, 10500064 para HCT116NIH</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth</td><td>AE73.2</td><td>99,95% LC-MS grau</td></tr><tr><td>NH4OH, 10%</td><td>Carl Roth</td><td>6756,1</td><td>para preparação de 3% NH4OH</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Ácido</td><td></td> <td>10010015-perclórico</td> Gibco</tr><tr><td>, 70%</td><td>Carl Roth</td><td>9216.1</td><td>para preparação de ácido perclórico 1 M</td></tr><tr><td>SDS</td><td>SERVA</td><td>20760.02</td><td>para preparação de tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920-TiO</td><td></td></tr><tr><td>2 grânulos GL</td><td>Sciences</td><td>5020-75000</td><td>5 &micro; m tamanho de partícula</td></tr><tr><td>Solução azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>mancha azul de tripano (0,4%)</td></tr><tr><td>Água ultrapura (Tipo 1)</td> Modelo <td>Milli-Q</td><td>ZRQSVP3WW</td><td>: Sistema de Purificação de Água UV Direct-Q 3</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Modelo 30105893 Mettler Toledo</td><td></td>: <td>XPE26; para pesagem de esferas ( 5-6 mg por amostra)</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40002</td><td>modelo: Centrífuga de bancada de contador de células automatizada LUNA-II</td></tr><tr><td></td> Modelo <td>Hettich</td><td>1401</td><td>: UNIVERSAL 320</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada com refrigeração</td><td>VWR</td><td>521-1647P</td><td>modelo: Sistema Microstar 17R</td></tr><tr><td>CE Kit</td><td>de adaptador Agilent</td><td>G7100A-CE</td><td></td></tr><tr><td>/MS Agilent</td><td></td><td>G1603A-CE</td><td></td></tr><tr><td>/MS Kit de Pulverizador</td><td>Agilent</td><td>G1607A-Lâminas</td> <td>de</td></tr> <tr><td>contagem de células</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>Lâminas de contagem de células LUNA</td></tr><tr><td>Evaporador centrífugo</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5305000304 modelo: Concentrador mais sistema completo</td></tr><tr><td>Fonte ESI</td><td>Agilent</td><td>AJS ESI-Super</td><td></td></tr> <tr><td>Filme de Suporte</td><td>Nisshin EM Co. Ltd, Tóquio</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora umidificada</td><td>Binder</td><td>9040-0088</td><td>modelo: CB E6.1, para cultivo de células de mamíferos</td></tr><tr><td>Caixa de gelo</td> <td>-</td><td></td> <td>deve fornecer espaço suficiente para amostras, pratos, etc.</td></tr><tr><td>Sistema LC isocrático</td><td>Agilent</td><td>G7110B 1260 Iso Modelo da bomba</td><td>: Infinity II Sistema quaternário</td></tr><tr><td>MSD</td><td>Agilent</td><td>G6495C</td><td>triplo quadrupolo</td></tr><tr><td>Leitor multiplacas</td> Modelo <td>de 30086375</td><td>tecan</td><td>: SPARK 10 M</td></tr><tr><td>Enchedor de pipetas</td><td>Thermo Fisher</td><td>10072332</td><td>para pipetas serológicas</td></tr><tr><td>Pipetas Marca</td><td></td><td>705884, 705880, 705878, 705872, 705870</td><td>várias pipetas</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Labnet</td><td>H5500</td><td>modelo: Mini LabRoller Rotator</td></tr><tr><td>Shortix cortador de coluna capilar</td><td>SGT</td><td>S0020-Agitador</td> <td>de</td></tr> <tr><td>tubo de ensaio (misturador de vórtice)</td><td>Carl Roth</td><td>Modelo HXH6.1</td><td>: Rotilabo-Mini Vortex</td></tr><tr><td>Mesa basculante</td><td>Labnet</td><td>S0600</td><td>modelo: EDURO MiniMix Nutating</td></tr><tr><td>Mixer Banho-maria</td><td>Thermo Modelo</td><td>de FSGPD05</td> Fisher<td>: Isotemp GPD 05</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter Workstation</td><td>Agilent</td><td>Versão 10.1-MassHunter</td><td></td></tr> <tr><td>Workstation LC/MS Data Acquisition</td><td>Agilent</td><td>Versão 10.1-MassHunter</td><td></td></tr> <tr><td>Workstation Optimizer</td><td>Agilent</td><td>Versão 10.1</td><td>-</td></tr><tr><td>MassHunter Workstation Análise Qualitativa</td><td>Agilent</td><td>Versão 10.0-QQQ</td><td></td></tr> <tr><td>Análise de Quantição</td><td>Agilent</td><td>Versão 10.1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

quantificação absoluta de pirofosfatos de inositol por eletroforese capilar eletrospray ionização espectrometria de massa

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Os pirofosfatos de inositol (PP-InsPs) são um importante grupo de moléculas de sinalização intracelular. Derivadas de fosfatos de inositol (InsPs), essas moléculas apresentam a presença de pelo menos uma porção de pirofosfato energético no anel de mio-inositol. Eles existem onipresente em eucariotas e operam como mensageiros metabólicos pesquisando a homeostase do fosfato, a sensibilidade à insulina e a carga de energia celular. Devido à ausência de um cromóforo nesses metabólitos, uma densidade de carga muito alta e baixa abundância, sua análise requer marcador radioativo e, portanto, é complicada e cara. Aqui, o estudo apresenta um protocolo detalhado para realizar quantificação absoluta e de alto rendimento de pirofosfatos de inositol de células de mamíferos por espectrometria de massa por eletroforese capilar por eletrospray de ionização de massa (CE-ESI-MS). Este método permite o perfil sensível de todas as espécies de PP-InsPs biologicamente relevantes em células de mamíferos, permitindo a separação basal de regioisômeros. Concentrações celulares absolutas de PP-InsPs, incluindo isômeros menores, e monitoramento de suas alterações temporais em células HCT116 sob várias condições experimentais são apresentados.

Os resultados aqui apresentados visam ilustrar o potencial da análise CE-ESI-MS. Os números relatados são descritivos de uma execução tecnicamente impecável do CE-ESI-MS. Primeiramente, apresenta-se uma mistura de padrões de pirofosfato de inositol (Figura 1) e um extrato de células de mamíferos (Figura 2). Em segundo lugar, é fornecida uma comparação de duas linhagens celulares de HCT116 (Figura 3) e HCT116 tratadas com NaF (Figura 4).
Os eletroferogramas de íons extraídos (EIEs) dos padrões de inositol (piro)fosfato a uma concentração de 2 μM são mostrados na Figura 1. O metabolismo dos pirofosfatos de inositol em mamíferos com suas estruturas simplificadas é inserido. Os quatro pirofosfatos de inositol em mamíferos, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 e5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 são bem distinguidos usando o método descrito. Uma execução ce-esi-ms de HCT116UCL é representada na Figura 2. Com o auxílio de padrões internos estáveis marcados com isótopos (SIL), uma quantificação absoluta pode ser prontamente alcançada comparando a resposta do sinal com o SIL cravado de concentração conhecida. Os EIEs integrados do fosfato de inositol de InsP5 a (PP)2-InsP 4 e EIEs não integrados de seus padrões isotópicos são exibidos. Os RSDs de todos os analitos de seis repetições técnicas estão dentro de 4%. Com a concentração medida e o volume de extractos, a quantidade de analitos pode ser calculada. Com a contagem de células e o volume celular, ou conteúdo proteico, a concentração celular absoluta (μM) ou a quantidade normalizada pelo teor de proteína (pmol/mg de proteína) são comumente os resultados finais de tal análise.
De acordo com um estudo anterior, dois lotes de células HCT116 divergentes têm uma variação dos níveis de InsP 8, as células HCT116UCL contêm níveis 6 vezes mais elevados de InsP8 do que as células HCT116NIH 29. Com o método CE-MS, 1,5-(PP)2-InsP 4 no HCT116 NIH poderia ser facilmente quantificado (Figura 3), e as células HCT116UCL contêm níveis 7 vezes maiores de InsP8 do que no HCT116NIH. Além disso, o acúmulo significativo de 1,5-(PP)2-InsP 4 em células HCT116UCL é paralelo a um aumento significativo de 1-PP-InsP5, que agora é mostrado quantitativamente na Figura 3.
Os níveis de PP-InsPs aumentam inibindo sua desfosforilação usando fluoreto de sódio. A análise CE-ESI-MS de células de HCT116 NIH tratadas comNaF demonstrou a elevação de -5-PP-InsP 5, juntamente com uma redução naInsIns6 e um aparecimento de 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (Figura 4). Além disso, a elevação dos níveis de InsP8 é perceptível, enquanto o 1-PP-InsP5 diminui até certo ponto. O 1-PP-InsP5 não está completamente ausente no HCT116NIH tratado com NaF, mas principalmente sob o limite de detecção ou quantificação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig01.jpg"> Figura 1: Eletroferogramas de íons extraídos típicos (EIEs) de padrões de inositol (piro)fosfato na análise CE-ESI-MS usando o protocolo descrito. A concentração de cada substância a analisar é de 2 μM. O volume da amostra injectada é de cerca de 10 nL com uma injeção a 50 mbar durante 10 s. Inserções mostram o metabolismo de pirofosfatos de inositol em mamíferos. IPPK: inositol pentakisfosfato 2-quinase, IP6K: inositol hexakisphosphate quinase, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfato quinase, DIPP1: difosfoinositolpolifosfato fosfohidrolase 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig02.jpg"> Figura 2: Perfil representativo do InsP das célulasUCL HCT116. (A) EIEs dos principais inositol (piro)fosfatos no HCT116NIH e SIL ISs cravados 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), e 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). As inserções mostram seis repetições técnicas da análise de InsP por CE-ESI-MS, os dados são apresentados como meios ± SD. (B) Concentração celular de PP-InsPs e InsPs em linhagens celulares humanas HCT116UCL e (C) PP-InsPs e InsPs quantidade normalizada pelo teor de proteína. Os dados são meios ± MEV de três experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig03.jpg"> Figura 3: Variação nos níveis de InsP8 entre duas células HCT116 divergentes. (A) EIEs de pirofosfato de inositol em HCT116 UCL e HCT116NIH. InsP8 em HCT116UCL é marcadamente mais abundante do que em HCT116NIH. (B) Proporção de pirofosfato de inositol para InsP6 (%) em ambas as células HCT116. As células HCT116UCL contêm níveis 7 vezes mais elevados de InsP8 em comparação com o HCT116NIH, enquanto os níveis de 5-PP-InsP5 são iguais. Os dados são meios ± MEV de três experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig04.jpg"> Figura 4: Níveis de inositol (piro)fosfato em células HCT116NIH, com tratamento com NaF. (A) EIEs de inositol (piro)fosfato em HCT116NIH com tratamento com fluoreto de sódio (NaF, 10 mM). Os níveis de pirofosfato de inositol, incluindo 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 e5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 aumentam através do bloqueio de sua desfosforilação usando NaF. (B) Níveis de inositol (piro)fosfato (as quantidades são normalizadas pelo teor de proteína) em célulasde HCT116 NIH não tratadas e tratadas com NaF. Os dados são meios ± MEV de três experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Configurações de parâmetros CE-ESI-MS. O parâmetro Source e os parâmetros iFunnel são otimizados pelo Source e pelo iFunnel Optimizer. Configurações de parâmetros MSM para inositol (piro)fosfatos são otimizados pelo MassHunter Optimizer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table1.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Equação de regressão teórica e experimental. A concentração de [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 e [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 é de 4 μM, 20 μM e 20 μM, respectivamente. Para a equação de regressão, a concentração de 5-PP-InsP 5 está em 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 e Ins (1, 3, 4, 5,6)A concentração de P 5 está em 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM,5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x é concentração, y é (Área InsP)12C/(Área InsP)13C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table%202.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Um procedimento para espectrometria de massa por ionização por eletrospray de eletroforese capilar para a quantificação absoluta de pirofosfatos de inositol de extratos de células de mamíferos é descrito.

Quantificação Absoluta de Pirofosfatos de Inositol por Eletroforese Capilar Eletrospray Ionização Espectrometria de Massa

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Isso fornece resultados de alta qualidade para o metabolismo do fosfato de inositol em todos os organismos que testamos até agora. Ele também fornecerá informações sobre a nova via biossintética celular que estamos atualmente cientes. A análise do metabolismo do fosfato de inositol por CE-ESI-MS é mais rápida, altamente sensível, e capaz de fornecer informações de estrutura para conjuntos de fosfato de inositol.Para começar, configure um sistema de Espectrometria de Massa de Ionização por Eletrospray de Eletroforese Capilar ou CE-ESI-MS consistindo de um sistema CE comercial e um espectrômetro de massa em tandem quadrupolo triplo, equipado com uma fonte ESI Agilent Jet Stream. Em seguida, conecte o divisor de fluxo 1:100 da bainha e a saída da bomba de cromatografia líquida isocrática e verifique se o frasco de entrada do sistema CE está na mesma altura que a ponta do pulverizador do analisador de massa. Em seguida, utilize a versão MassHunter Workstation ou software MS semelhante, para controlar todo o sistema e aquisição e análise de dados.Depois de preparar o tampão de corrida CE e o líquido da bainha, instale o líquido da bainha purgando a cinco mililitros por minuto durante cinco minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto e a pressão da bomba para 180 bar. Certifique-se de que a tubulação reciclada se conecta de volta ao frasco líquido da bainha para reutilizar o solvente.Em seguida, usando um cortador de coluna capilar com uma lâmina diamantada rotativa, corte adequadamente ambas as extremidades de um capilar CE-MS com uma janela de detecção UV. Em seguida, remova dois a três centímetros de revestimento de poliimida em ambas as extremidades com um isqueiro e limpe a superfície capilar com isopropanol. Para instalar o capilar, combine o capilar no CE-MS.Em seguida, clique no botão Alterar e instale o no dispositivo CE. Para ativar o capilar, primeiro lave o capilar com um hidróxido de sódio molar, seguido de água por 10 minutos e, em seguida, o tampão de corrida CE por 15 minutos. Em seguida, insira o capilar no pulverizador CE-MS.Usando uma lupa e o parafuso de ajuste no pulverizador, ajuste com precisão a saída capilar, garantindo que a extremidade capilar se projete aproximadamente 0,1 milímetros para fora da ponta do pulverizador. Verifique a estabilidade do pulverizador ESI no modo Full Scan. A flutuação dos eletroferogramas de íons totais deve estar dentro de 5% Em seguida, realize um teste com padrões de fosfato de inositol.Após a preparação da mistura de padrões internos, misture 10 microlitros da amostra com 0,5 microlitros da mistura de padrões internos e um frasco para injetáveis de amostra CE. Ao usar o sistema de reabastecimento, clique no botão Alterar garrafa. Coloque os 250 mililitros preparados de buffer de funcionamento CE no frasco de eletrólitos.Em seguida, clique em Limpar tubos mantendo a agulha de reabastecimento em um frasco de água. Defina os parâmetros ESI e MS. Em seguida, otimize os parâmetros da fonte usando um otimizador de fonte com uma mistura de padrões de polifosfato de inositol e várias configurações de monitoramento de reação usando o MassHunter Optimizer com todos os padrões.Em seguida, execute uma corrida para os extratos de fosfato de inositol e verifique os resultados. Defina uma sequência quando houver mais amostras. Após a medição, deixe o MS estar no modo de espera e não desligue a bomba de cromatografia líquida.Substitua o pulverizador CE-ESI-MS por um pulverizador LC-ESI-MS quando não houver fornecimento de líquido da bainha. Para análise de dados, abra o software de Análise Quantitativa e crie um lote para todas as amostras. Em seguida, crie um novo método a partir dos dados de monitoramento de reações múltiplas adquiridas e defina os fosfatos de inositol de carbono-13 como padrões internos.Em seguida, verifique a configuração do Composto de Monitoramento de Reações Múltiplas, Tempo de Retenção, Padrões internos, Concentração e Qualificador. Passe a Validação e Saída para aplicar o método ao lote atual. Salve o método.Em seguida, verifique se cada pico no lote está integrado corretamente. Caso contrário, integre manualmente o pico. Exportar os resultados para uma planilha e quantificar os pirofosfatos de inositol, comparando a resposta de pico do anolito com a respectiva resposta de pico do isótopo estável rotulado padrões internos com concentrações conhecidas.Finalmente, com a concentração medida no fosfato de inositol, solução de extrato e seu volume, calcular as quantidades absolutas e normalizar ainda mais a quantidade por contagens de células ou teor de proteína. Calcule a concentração celular com base na contagem de células e no volume celular médio das células HCT116. Os eletroferogramas de íons extraídos dos padrões de pirofosfato de inositol em uma concentração de dois micromoles são mostrados aqui.O metabolismo dos pirofosfatos de inositol em mamíferos com suas estruturas simplificadas é inserido. Uma execução ce-esi-ms de células HCT116 da University College London ou UCL é mostrada aqui. O CE-MS foi usado para quantificar a variação nos níveis de IP8 entre as células HCT116 da UCL e as do NIH.As células HCT116 da UCL contêm níveis sete vezes mais elevados de IP8 do que as do NIH. O acúmulo significativo de 1, 5-IP8 nas células HCT116 UCL é paralelo a um aumento considerável no 1-IP7. A análise CE-ESI-MS de células HCT116 tratadas com fluoreto de sódio do NIH demonstrou uma elevação de 5-IP7, juntamente com uma redução no IP6 e um aparecimento de 5-PPIP4.Embora os níveis de 1-IP7 tenham diminuído até certo ponto, ele não está completamente ausente nas células tratadas com fluoreto de sódio, mas principalmente abaixo do limite de detecção. É importante formar uma classe CE-ESI-MS estável. Recomendamos verificar a repetibilidade e a sensibilidade do sistema antes das medições.Esta técnica permite fornecer metabolismo de fosfato de inositol, implantes e tecidos, e também fornecer uma oportunidade para estudar de perto o pirofosfato de inositol biologicamente relevante.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Pirofosfatos inositol desempenhar um papel importante em patologias humanas como câncer, diabetes e obesidade, no entanto, o mecanismo exato de ação é uma questão de disputa. A falta de disponível comercialmente pirofosfatos inositol estudos detalhados torna problemática. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para produzir e isolar miligramas de pirofosfatos inositol.

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Um protocolo para perfis metabólicos de amostras biológicas por capilar espectrometria de eletroforese em massa usando um design de interface ponta porosa sheathless é apresentado.

Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Aqui descrevemos a forte cromatografia líquida de alta performance de [3H]- mio-inositol-labelelings que é um método altamente sensível para detectar e quantificar polifosfatos inositol em...

Extração e Quantificação de Polifosfatos inositol solúveis e radiolabelados de diferentes espécies vegetais usando SAX-HPLC

Apresentamos um protocolo para identificação e quantificação dos componentes em misturas de espécies que possuem proteínas semelhantes. A espectrometria de massa detecta peptídeos para identificação e fornece quantificação relativa por proporções de áreas de pico. Como alimento de ferramenta para detecção de fraudes, o método pode detectar 1% de cavalo na carne bovina.

Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Aprenda a quantificar pirofosfatos de inositol em células mamíferas usando eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas. Este método rápido e sensível permite analisar o metabolismo de fosfatos de inositol com alta precisão.

Quantificação Absoluta de Pirofosfatos de Inositol por Eletroforese Capilar Eletrospray Ionização Espectrometria de Massa

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