Name: Adaptação de organoides gastrointestinais para infecção por patógenos e sequenciamento de células únicas sob condições de nível de biossegurança 3 (BSL-3) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a infectar organoides intestinais humanos para estudar interações hospedeiro/patógeno usando sequenciamento de células únicas. Este método permite analisar respostas celulares a vírus em nível individual.

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Megan Stanifer e Steeve Boulant foram apoiadas por bolsas de pesquisa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projeto número 240245660, 278001972, 415089553 e 272983813 para Steeve Boulant e 416072091 para Megan Stanifer), o estado de Baden-Wuerttemberg e o Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B para MS e 01KI20198A e NUM (-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) para SB. Os esquemas foram criados em BioRender.

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Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Patógenos entéricos geralmente iniciam seu ciclo de vida infectando células epiteliais intestinais de seu lado apical voltado para o lúmen do intestino. Embora os organoides sejam bem reconhecidos como um bom modelo para reproduzir a complexidade celular e a organização do epitélio intestinal, sua organização como estruturas tridimensionais e fechadas tornam sua membrana apical inacessível ao patógeno. Este protocolo descreveu métodos para infectar organoides intestinais de seu lado apical, seu lado basolateral, ou ambos com patógenos BLS-3. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para estudar qualquer patógeno entérico sob contenção BSL-2 ou BLS-3 ou qualquer outro modelo organoide seguindo algumas etapas críticas que são destacadas abaixo. O método descrito acima é para o isolamento e preparação de gotículas unicelulares de acordo com as regulamentações na Alemanha. Como isenção de responsabilidade, este protocolo não descreve as medidas de tratamento de biossegurança (procedimentos operacionais padrão) que precisam ser tomadas enquanto trabalham sob condições BSL-3. Também é importante insistir que as regulamentações podem variar em outros países e que as autoridades locais devem ser contatadas para garantir que todas as regulamentações locais sejam respeitadas.
Um dos passos críticos na semeadura de organoides em duas dimensões para infecção apical é controlar que as células se diferenciarão da mesma forma em comparação com quando cultivadas como organoides tridimensionais clássicos. Dependendo do patógeno entérico, o tropismo pode ser restrito a células muito raras ou a células que precisam ser altamente diferenciadas. Neste caso, o uso de um organoide bidimensional que não se diferenciava totalmente poderia resultar na má conclusão de que este patógeno entérico não pode infectar organoides intestinais. Sugere-se, se possível, a realização de infecções utilizando as três configurações deste protocolo: organoide 2D apenas para infecção apical (seção 2), organoides 3D abertos para infecção apical e basolateral (seção 3), e organoides 3D completos apenas para infecção basolateral (seção 3). Esta abordagem ajudará a discernir a rota de entrada do patógeno (apical vs. basolateral) e também controlará que um nível semelhante de diferenciação foi alcançado. Uma alternativa para infecção apical 2D é a microinjeção, que usará um organoide 3D, mas fornecerá o patógeno diretamente para o lado apical (ver Bartfeld et al.27 para obter detalhes). Este método requer um injetor qualificado para garantir que o patógeno esteja devidamente colocado, e os organoides permaneçam intactos. A microinjeção é comumente usada na contenção BSL-2 e pode não ser adequada para contenção BSL-3.
Uma consideração importante adicional na realização de experimentos de infecção em organoides semeados em 2D é a densidade celular final. Como mencionado na etapa 2.3, 100-150 organoides serão semeados em um poço de uma placa de 48 poços ou um poço de um deslizamento de câmara de vidro de 8 poços. Dependendo da linha organoide e da pessoa que manuseia os organoides, o tamanho desses organoides pode ser significativamente diferente. Isso pode resultar em densidades celulares muito diferentes na placa de 48 poços ou em deslizamento de câmara de vidro de 8 poços. Dependendo do vírus entérico, alguns vírus preferem células mais esparsas, enquanto outros também serão capazes de infectar células confluentes. A origem molecular de tais diferenças na infectividade para diferentes confluências celulares não é clara; portanto, experimentos piloto com o objetivo de encontrar a melhor densidade celular para o patógeno entérico de escolha devem ser realizados antes de realizar uma caracterização mais a jusante.
Muitas vezes a classificação FACS é realizada antes de realizar a emulsão de gotícula de célula única. Esta etapa é frequentemente usada para separar mortos de células vivas e células únicas de doublets. Ao trabalhar com patógenos BSL-3, requer que a instalação esteja equipada com um classificador FACS apropriado, o que não é frequentemente o caso. Além disso, nem todas as células em um organoide têm o mesmo tamanho, e muitas vezes é difícil discriminar entre um doublet ou uma célula maior, causando assim o risco de seleção negativa contra um tipo de célula específica. Além disso, ainda há discussão no campo se o tempo necessário para a triagem entre 5.000-10.000 para cada amostra poderia resultar em uma modificação significativa do perfil de transcrição das células individuais. Embora tenham sido descritos métodos de fixação celular compatíveis com sequenciamento unicelular (por exemplo, metanol e RNAassist), observou-se que isso leva a uma diminuição na qualidade do sequenciamento18. Finalmente, suspeita-se que a triagem de células usando marcadores de morte celular também pode levar a um viés. Dada a proliferação direcional e diferenciação das células através do eixo cripta-villi, as células mais diferenciadas, que serão derramadas e liberadas, estão localizadas na ponta do villi. Essas células são muitas vezes positivas para diferentes marcadores de vias de morte celular (porexemplo, apoptose, necrose e necroptose); no entanto, ao olhar para a infecção rotavírus do intestino do camundongo, a ponta do villi é a área mais infectada28. Assim, filtrar células que possam parecer positivas para marcadores de morte resultaria em uma seleção negativa das células infectadas que podem representar a infecção fisiológica. Atualmente, não há uma boa solução para classificar e fixar organoides antes do sequenciamento unicelular. O uso de células vivas e não sortidas é recomendado, pois são necessários estudos adicionais para encontrar protocolos alternativos adequados.
O sequenciamento unicelular revolucionou a forma como as respostas celulares podem ser avaliadas. Esta técnica permite a identificação de respostas específicas da linhagem celular, tanto em condições basais quanto sob infecções por patógenos. Este método abriu portas em muitos campos que antes eram limitados por leituras em massa. Embora este método seja muito poderoso, ele tem suas limitações. Uma limitação fundamental é a extensa análise bioinformática que é necessária a jusante do sequenciamento. Isso é especialmente fundamental ao analisar tecidos e atribuir tipos de células onde atualmente não há anotação. Ter um bioinformático qualificado é necessário para apoiar todos os estudos unicelulares.
Este protocolo descreve como semear e lidar com organoides intestinais humanos, infectá-los com patógenos entericos e realizar scRNAseq. Adaptar essa abordagem a outros órgãos agora é possível, já que sistemas de modelo organoide foram desenvolvidos para a maioria dos órgãos. Os organoides pulmonares e hepáticos são igualmente organizados em comparação com organoides intestinais, e como tal, o uso de uma abordagem análoga poderia ser transposto para esses organoides. O controle crítico será validar que, quando cultivados em duas dimensões ou abertos, esses organoides alcançam diferenciação semelhante à de suas contrapartes organoides 3D. As características e genes específicos que definem um status diferenciado são específicos para cada modelo de órgão. Outros modelos organoides, como organoides renais e vasculares, grandes estruturas densas, precisarão de métodos adicionais para dissociar essas estruturas em células únicas.

Estudar o tropismo específico do tipo celular e a resposta imune específica do tipo celular aos vírus entéricos humanos tem sido historicamente desafiador devido à falta de modelos celulares humanos primários. Essa limitação foi agora parcialmente erradicada com o desenvolvimento de organoides1. No caso do trato gastrointestinal, foram desenvolvidos modelos organoides gástricos e intestinais para humanos e várias outras espécies (porexemplo,murina, bovina, felina, morcego)2,3,4,5,6. Organoides intestinais reproduzem a arquitetura estrutural do epitélio intestinal humano e contêm estruturas cripta e villi, linhagens intestinais funcionais e até têm sido usadas para identificar linhagens celulares até então desconhecidas. Duas abordagens diferentes podem ser usadas para cultivar organoides intestinais. Primeiro, as células de hastes intestinais contendo criptas são isoladas de ressecções teciduais ou biópsias e cultivadas sob condições específicas de cultura (por exemplo, Wnt3A, R-spondin, Noggin e EGF) para expandir e, em seguida, diferenciar as células-tronco para a maioria das linhagens celulares intestinais (porexemplo,, enterócitos, células panételes, células de Cálice, células enteroendrinas)7. Este método permite o isolamento de organoides de todas as seções do trato gastrointestinal(porexemplo, estômago, duodeno, jejunum, íleo e cólon). O segundo método baseia-se em células-tronco pluripotentes ou embrionárias induzidas pelo homem, que são então diferenciadas em um processo stepwise em células epiteliais intestinais8. Esses organoides induzidos à base de células-tronco são frequentemente descritos como sendo mais embrionários na natureza em comparação com organoides derivados do paciente. Embora todos esses modelos organoides tenham sido fundamentais para desvendar as pistas de desenvolvimento necessárias para formar o trato intestinal, seu uso em pesquisas de doenças infecciosas ainda está em sua infância.
O vírus entérico é um termo amplo que abrange todos os vírus, que infectam através do trato gastrointestinal, como picornavírus(porexemplo, EV-71), reovírus (por exemplo, rotavírus) e calicivírus (por exemplo, norovírus)9. Os vírus entéricos iniciam seu ciclo de vida infeccioso através da ingestão de alimentos e água contaminados, o que deixa as pessoas em países em desenvolvimento em alto risco devido à descarga de resíduos não tratados no meio ambiente e à falta de cuidados médicos após o início da infecção10. Dependendo do tipo de patógeno, a infecção pode levar à gastroenterite, vômitos e/ou diarreia aquática devido ao vazamento do revestimento intestinal. Os norovírus humanos são um patógeno entérico altamente prevalente e altamente infeccioso, que leva a mais de 600 milhões de infecções e 15 milhões de internações em todo o mundo11. Os organoides têm sido fundamentais para a pesquisa do norovírus, pois apoiam a infecção e a replicação do norovírus humano, que antes era incapaz de ser cultivado nos modelos de cultura celular padrão12.
Nas últimas duas décadas, os coronavírus emergiram como patógenos humanos-chave13. Esta família inclui os MERS altamente patogênicos, SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, que requerem restrições rigorosas de nível de segurança ao realizar pesquisas sobre esses vírus. Curiosamente, embora todos esses três patógenos sejam reconhecidos principalmente por seus sintomas respiratórios induzidos e angústia, agora é evidente que esses vírus não infectam apenas o trato respiratório, mas também outros órgãos. Uma patologia importante induzida em pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 além do problema respiratório é a presença de sintomas gastrointestinais14. Uma fração de pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 apresenta tais sintomas, variando de diarreia muito leve a grave. Além disso, genomas SARS-CoV-2 podem ser detectados em fezes e biópsias do trato gastrointestinal de pacientes infectados15. É importante ressaltar que a presença de sintomas gastrointestinais não se limita ao SARS-CoV-2, pois também foram observados em pacientes infectados pelo MERS e SARS-CoV-1. Para entender como o SARS-CoV-2 induz a angústia gastrointestinal e identifica precisamente o tropismo do SARS-CoV-2 no trato gastrointestinal, os organoides intestinais humanos têm sido uma ferramenta-chave e agora são explorados para desvendar respostas específicas do tipo celular a este patógeno16,17.
O perfil transcricional de uma população celular (sequenciamento de RNA em massa) tem sido uma prática padrão ao avaliar infecções por patógenos tanto de linhas celulares imortalizadas quanto com organoides. Embora isso nos permita determinar mudanças globais em resposta a patógenos (por exemplo, a regulação das citocinas), o RNAseq em massa não nos permite determinar por que células específicas em uma população são mais propensas à infecção do que outras. O sequenciamento de RNA unicelular (scRNAseq) tornou-se uma ferramenta poderosa para desvendar programas transcricionais específicos da linhagem celular e pode ser usado para determinar como esses programas suportam ou reprimem a infecção por vírus18,19. A primeira descrição do scRNAseq foi em 2009 e foi usada para avaliar os perfis de transcrição das diferentes células encontradas em um blastomerede camundongos 20. Essas tecnologias foram expandidas e podem ser implementadas através de diversas plataformas diferentes. As versões iniciais desta tecnologia aplicaram o classificador celular ativado pela fluorescência (FACS) para separar células individuais para sequenciamento, que muitas vezes era limitado a placas de 96 ou 384 poços, dando assim 300 células individuais para analisar por amostra21. Esses métodos foram agora avançados pelas plataformas de sequenciamento unicelular, que usam um dispositivo microfluido para encapsular células únicas em gotículas individuais com código de barras contendo contas. Esta tecnologia permite que até 10.000 células sejam capturadas por condição amostral.
A combinação da tecnologia organoides com a scRNAseq nos permite estudar como os patógenos entéricos impactam o trato gastrointestinal de uma maneira específica do tipo celular. No entanto, várias considerações técnicas e de biossegurança precisam ser tomadas. Em primeiro lugar, os métodos de cultura organoides clássicos (3D) organoides, embutidos em uma matriz extracelular (ECM)) expõem o lado basolateral das células epiteliais para o exterior do organoide. À medida que os patógenos entéricos iniciam sua infecção através da ingestão de alimentos/água contaminados, a infecção mais frequentemente inicia a partir do lado apical das células, que não é acessível nesses organoides intestinais 3D. Portanto, os organoides precisam estar preparados para tornar o lado apical acessível para infecção por patógenos, seja através da semeadura 2D, expondo diretamente o lado apical das células, ou através da microinjeção22,23. Em segundo lugar, para realizar scRNAseq de amostras biológicas infectadas, é importante considerar sua natureza infecciosa. Embora métodos para corrigir células e inativar patógenos antes do isolamento unicelular para rnaseq subsequente tenham sido propostos, esses métodos muitas vezes levam a uma diminuição na qualidade de sequenciamento18. O protocolo abaixo descreverá várias abordagens para infectar organoides intestinais com vírus entéricos considerando o lado da infecção (infecção apical vs. basolateral)(Figura 1). Além disso, o protocolo incluirá um fluxo de trabalho para dissociar e isolar células únicas de organoides infectados com vírus altamente patogênicos para scRNAseq. O protocolo destacará as principais etapas que precisam ser implementadas ao trabalhar sob condições de contenção de nível 3 (BSL-3) de biossegurança para evitar a geração de aerossóis e a contaminação potencial.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Cabeça de rato recombinante</td><td>Peprotech</td><td>Cat#250-38</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#25300054</td><td></td></tr><tr><td>placa tratada sem cultura celular de 24 poços</td><td>Corning</td><td>Cat#3738</td><td></td></tr><tr><td>Corrediça de câmara de fundo de vidro de 8 poços</td><td>iBIDI</td><td>Cart#80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller & Próximo Kit de Acessórios GEM</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000202</td><td>Usado na preparação de solução de célula única e preparação de esferas de gel em emulsão (GEM)</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Kit de célula única</td><td>10X Genomics</td><td>Cat #1000127</td><td>Usado na preparação de solução de célula única e preparação de esferas de gel em emulsão (GEM)</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3&prime; Kit v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000268</td><td>Usado na preparação de solução de célula única e preparação de grânulos de gel em emulsão (GEM)</td></tr><tr><td>Colágeno da placenta humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A forward</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>reverso Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCC</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>Leitura rápida 102 lâminas de contagem</td><td>Biosigma</td><td>Cat# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovein Serum (FBS)</td><td>Capricorn</td><td>Cat#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>células L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>Esta linha celular é usada para fazer os meios condicionados contendo Wnt 3A, R-Spondin e Noggin. O protocolo para a produção dos meios condicionados pode ser encontrado no site de fabricação.</td></tr><tr><td>MatriGel. GFR, LDEV livre</td><td>Corning</td><td>Cat#354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 forward</td><td>Eurofins</td><td>TGTAGGCATCGCTCTTCA</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>MUC-2 reverse</td><td>Eurofins</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>N-acetil-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 forward</td><td>Eurofins</td><td>ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>OLMF4 reverso</td><td>Eurofins</td><td>TGGACATATTCCCTCACTTTGGA</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante FGF básico</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante IGF-1</td><td></td><td>BioLegend Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo recombinante EGF</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI forward</td><td>Eurofins</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>SI reverse</td><td>Eurofins</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>Primers usados para verificar a diferenciação</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Caymann Chemicals</td><td>Cat#10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptação de organoides gastrointestinais para infecção por patógenos e sequenciamento de células únicas sob condições de nível de biossegurança 3 (bsl-3)

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Organoides intestinais humanos constituem o melhor modelo celular para estudar infecções por patógenos do trato gastrointestinal. Esses organoides podem ser derivados de todas as seções do trato GI (gástrico, jejunum, duodeno, óleo, cólon, reto) e, após diferenciação, contêm a maioria dos tipos celulares que são naturalmente encontrados em cada seção individual. Por exemplo, organoides intestinais contêm enterócitos absorventes de nutrientes, células secretas (Cálice, Paneth e enteroendocrino), células-tronco, bem como todos os intermediários de diferenciação específicos da linhagem (por exemplo, tipos de células precoces ou imaturas). A maior vantagem no uso de organoides derivados do trato gastrointestinal para estudar doenças infecciosas é a possibilidade de identificar precisamente qual tipo de célula é alvo do patógeno entérico e abordar se as diferentes seções do trato gastrointestinal e seus tipos de células específicas respondem da mesma forma aos desafios do patógeno. Ao longo dos últimos anos, modelos gastrointestinais, bem como organoides de outros tecidos, têm sido empregados para estudar o tropismo viral e os mecanismos da patogênese. No entanto, utilizar todas as vantagens do uso de organoides ao empregar vírus altamente patogênicos representa um desafio técnico e requer rigorosas considerações de biossegurança. Além disso, como os organoides são frequentemente cultivados em três dimensões, o lado basolateral das células está voltado para o lado externo do organoide enquanto seu lado apical está voltado para o interior (lúmen) dos organoides. Esta organização representa um desafio para os patógenos entéricos, pois muitas infecções entéricas iniciam a partir do lado apical/luminal das células após a ingestão. O manuscrito a seguir fornecerá um protocolo abrangente para preparar organoides intestinais humanos para infecção com patógenos entéricos, considerando o lado da infecção (apical vs. basolateral) para realizar sequenciamento de RNA unicelular para caracterizar interações de hospedeiro/patógeno específicas do tipo celular. Este método detalha a preparação dos organoides, bem como as considerações necessárias para realizar este trabalho sob condições de contenção nível 3 (BSL-3).

Preparação de organoides para sequenciamento unicelular Os resultados de sequenciamento de células únicas são altamente dependentes do uso de células de boa qualidade. Para garantir que os organoides sejam de boa qualidade, eles devem ser devidamente mantidos e observados diariamente para determinar quando estão prontos para serem divididos(Figura 2). O tempo de divisão dos organoides é dependente do doador; alguns doadores crescem mais rapidamente e precisam ser divididos a cada 5 dias, enquanto outros são mais lentos e precisam ser divididos a cada 10 dias. Em média, os organoides são divididos uma vez por semana quando os centros ficam escuros(Figura 2B). Se os organoides se tornarem muito grandes e acumularem muitas células mortas no centro, o organoide morrerá.
Organoides são mantidos em uma mídia que contém altas quantidades de Wnt3A. Isso suporta o nicho de células-tronco e promove que os organoides continuem a crescer e proliferar. Nessas condições de crescimento, os organoides contêm altas quantidades de células-tronco e células amplificadoras de trânsito e uma menor quantidade de populações celulares diferenciadas, como enterócitos maduros, células de cálice e células enteroendócrinas. No entanto, para imitar a complexidade celular encontrada dentro do intestino humano, é importante empurrar a diferenciação celular e produzir mais dessas células. Isso é feito alterando as condições de mídia e removendo o Wnt3A, e reduzindo R-Spondin e Noggin (Tabela 1). Normalmente, a diferenciação celular em relação a enterócitos, células de cálice e células enteroendócrinas requer 4 dias de mídia de diferenciação(Figura 3). É fundamental obter uma boa diferenciação; caso contrário, avaliar o tropismo patógeno e as respostas específicas do tipo celular se tornarão difíceis.
Confirmação da inativação do patógeno BSL-3 A inativação total deve ser confirmada com o patógeno de escolha e validada que é seguro remover o cDNA do BSL-3. Para o SARS-CoV-2, a inativação total do vírus foi validada tomando 100 μL de SARS-CoV-2 e incubando-o em uma máquina PCR por 5 min a 85 °C. O vírus foi então adicionado de volta às células vero ingênuas, e a infecção por vírus foi comparada com o vírus não-térmico tratado por imunofluorescência e ensaios de placa a 24 h, 48 h e 72 h pós-infecção para garantir que todas as partículas não fossem mais infecciosas. Esses resultados foram enviados à agência reguladora local e, após sua aprovação, foi realizado o experimento unicelular e o processamento de CDNA.
Resultados de sequenciamento de células únicas Para avaliar como o SARS-CoV-2 infecta organoides humanos de cólon e íleo, foi realizado sequenciamento unicelular. Os organoides foram preparados como descritos acima e infectados em formato 2D para permitir a infecção apical pelo SARS-CoV-2. As células infectadas foram colhidas às 12h e 24 h pós-infecção e processadas para sequenciamento unicelular, conforme descrito acima. A análise dos dados de sequenciamento unicelular nos permitiu determinar que apenas uma subpopulação (enterocyto imaturo 2) de células epiteliais intestinais humanas suportava a infecção do SARS-CoV-2 (Figura 4). Além disso, como nem todas as células de uma população foram infectadas, tanto células infectadas quanto células de espectadores não infectadas foram analisadas(Figura 5). Esses resultados mostraram que o SARS-CoV-2 induziu uma cascata de sinal pró-inflamatório em células infectadas, enquanto as células de espectadores não infectadas mostraram uma resposta imune mediada por interferon. Além disso, o SCRNA-Seq mostrou que as células infectadas não conseguiam sentir interferons devido ao bloqueio mediado pelo vírus da via(Figura 5). Não foi possível obter essas informações ao usar sequenciamento de RNA em massa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg"> Figura 1: Esquema representando os três métodos diferentes para preparar organoides intestinais humanos para infecção com patógenos entéricos. A infecção apical pode ser alcançada através da semeadura de organoides intestinais em 2D. Uma infecção apical e basolateral pode ser realizada interrompendo o organoide 3D. Finalmente, uma única infecção basolateral pode ser realizada infectando organoides intestinais 3D intactos. Cada um desses métodos pode ser usado para gerar amostras para sequenciamento de células únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de manutenção organoide e imagens representativas de brightfield. (A) Esquema para manutenção e passagem de organoides intestinais humanos. (B) Imagens representativas de brightfield dos dias 1, 3, 5 e 7 pós-divisão. No dia 7, os organoides se tornam grandes e escuros devido ao acúmulo de células mortas e estão prontos para serem divididos. A barra de escala indica 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg"> Figura 3: Representante qPCR de organoides intestinais humanos 4 dias após a mudança para mídia de diferenciação. Os organoides intestinais foram mantidos em meios de crescimento ou mudaram para mídia de diferenciação por 4 dias. O RNA foi colhido e o qPCR foi realizado para marcadores de células-tronco (OLFM4), células paneth (LYZ), células de cálice (MUC2) e enterócitos (SI). N = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg"> Figura 4: Identificação da população celular infectada pelo SARS-CoV-2. Organoides derivados de cólon humano e íleo foram infectados com SARS-CoV-2. Após 12 e 24 h, células pós-infecção foram colhidas e submetidas ao sequenciamento de RNA unicelular para identificar quais populações celulares apoiaram a infecção pelo SARS-CoV-2. A infecção por vírus aumentou com o tempo e infectou principalmente enterócito imaturo 2. Este número foi modificado a partir de Triana et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg"> Figura 5: Determinação da resposta imune intrínseco inata. Organoides derivados do cólon humano foram infectados com SARS-CoV-2. Após 12 e 24 h, células pós-infecção foram colhidas e submetidas ao sequenciamento de RNA de células únicas para determinar a resposta imune intrínseco inata em células de espectadores viralmente infectadas e não infectadas. As células infectadas pelo SARS-CoV-2 apresentaram uma forte resposta pró-inflamatória, enquanto as células de espectadores não infectadas apresentaram uma resposta mediada por interferon. Figura modificada de Triana et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Mídia de Crescimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Composto</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ad DMEM/F12</td>
			<td>GlutaMAX (1X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+GlutaMAX</td>
			<td>HEPES 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+HEPES</td>
			<td>Caneta 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>Estreptocos 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-WRN</td>
			<td>50% em volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetil-cisteína</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGF-1</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF básico</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mídia de diferenciação</td>
		</tr>
<tr>
<td>Composto</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ad DMEM/F12</td>
			<td>GlutaMAX (1x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+GlutaMAX</td>
			<td>HEPES 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+HEPES</td>
			<td>Caneta 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>Estreptocos 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetil-cisteína</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-spondin</td>
			<td>5% em volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Composição de mídia para mídia de crescimento e diferenciação.

Este protocolo descreve como infectar organoides intestinais humanos de seu lado apical ou basolateral para caracterizar interações hospedeiro/patógeno no nível de célula única usando a tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (scRNAseq).

Adaptação de organoides gastrointestinais para infecção por patógenos e sequenciamento de células únicas sob condições de nível de biossegurança 3 (BSL-3)

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Este protocolo nos permite entender como os tipos de células individuais estão presentes na resposta do epitélio intestinal humano à infecção viral. Nós apresentamos aqui três maneiras independentes de semear organoides intestinais humanos para abordar como a rota da infecção pode impactar como a célula responde. Destacamos como preparar amostras para o sequenciamento de RNA de células únicas considerando os regulamentos de biossegurança que precisam ser respeitados ao trabalhar com patógenos de categoria 3.Este método pode ser facilmente adaptado a outros patógenos e culturas organoides. A consideração mais importante é garantir que seus modelos organoides sejam totalmente diferenciados com o método de semeadura escolhido e possam suportar a infecção viral. Antes de colher os organoides infectados, remova as contas de gel unicelular de menos 80 graus Celsius e aqueça-as à temperatura ambiente.Além disso, equilibre o reagente RT, reduzindo a enzima B e a enzima RT à temperatura ambiente e resuspenque o oligo do interruptor de modelo, conforme descrito nas instruções do fabricante. Em seguida, para coletar organoides 3D infectados com o patógeno BSL-3, remova a placa de cultura celular da incubadora e coloque-a na capa de cultura celular. Em seguida, usando uma pipeta P1000, remova a mídia de diferenciação de cada poço da placa de 24 poços, adicione 500 microliters de PBS gelado a cada poço e incubar em temperatura ambiente por três minutos.Em seguida, para interromper totalmente a solução de matriz extracelular, pipeta para cima e para baixo 10 vezes para resuspend o PBS, matriz extracelular e organoides, em seguida, transferir os organoides resuspended em um tubo cônico de 15 mililitros e colocar os tubos no gelo. Colete cada condição de infecção em tubos cônicos separados de 15 mililitros. Depois de trocar as luvas, limpe o lado de fora do tubo e remova o tubo da capa de cultura celular.Gire as amostras por cinco minutos. Mova o tubo de volta para a capa de cultura celular e remova o PBS, evitando a ressuspensão da pelota do organoide a partir da parte inferior do tubo. Em seguida, resuspense a pelota em um mililitro de enzima dissociação.em seguida, troque as luvas, limpe o tubo e incuba as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, mova o tubo de volta para a capa de cultura celular a cada 10 minutos e resuspense os organoides pipetando para cima e para baixo. Para determinar se os organoides são dissociados em células únicas, coloque 10 microliters da suspensão organoide em um disto de contador de células plásticas descartáveis usando uma pipeta P10 e, em seguida, sele a porta de entrada da amostra com fita transparente.Depois de trocar luvas, limpe o lado de fora do balcão da célula e usando um microscópio Brightfield, confirme que uma única suspensão celular é criada. Após a confirmação da suspensão celular única, pare a digestão adicionando um mililitro de mídia DMEM F12 contendo 10% de FBS e pipeta para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, troque as luvas, limpe o tubo e gire a amostra.Após a centrifugação, remova cuidadosamente a mídia contendo a enzima dissociação, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular na parte inferior. Em seguida, resuspenha as células únicas em um volume mínimo de PBS contendo 0,1% BSA. Depois de passar a suspensão da célula em um tubo FACS através de um filtro para remover grandes aglomerados, coloque o tubo no gelo.Em seguida, para determinar o número de células por microliter, adicione 10 microliters da suspensão celular a uma câmara de contagem de células plásticas descartáveis. Em seguida, sele a porta de entrada da amostra com fita clara antes de remover a amostra da capa de cultura celular. Troque as luvas, limpe a câmara de contagem de células, então conte o número de células usando um microscópio Brightfield.Em seguida, dentro da capa de cultura celular, prepare uma mistura mestre de reagente RT, oligo de interruptor de modelo, reduzindo o agente B e a enzima RT C em um tubo de 1,5 mililitro, de acordo com as instruções do fabricante, dependendo do número de amostras no experimento. Para cada amostra, alíquota de 33,4 microliters de mistura mestre em um tubo PCR, em seguida, adicione as células e a água à mistura mestre de acordo com o número da célula alvo. Depois de trocar luvas, mova o controlador de célula única para o capô de cultura celular e prepare o chip.Em seguida, adicione o chip de célula única no suporte do chip e encha as pistas nãousadas com 50% de glicerol. Adicione a mistura mestre, as contas e o óleo de particionamento nas pistas que contenham amostras de acordo com as instruções do fabricante e cubra o chip com uma junta. Depois de carregar o chip no controlador, inicie o programa.Após a conclusão do programa, remova o chip e a junta, em seguida, usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microliters das emulsões para limpar tubos PCR. Certifique-se de que cada emulsão tenha uma cor branca uniforme indicando que ocorreu uma emulsão completa. Depois de trocar luvas e limpar os tubos, transfira os tubos PCR para uma máquina PCR e inicie o programa.No final da execução do PCR, a maioria dos vírus envoltos serão inativados. As imagens representativas de Brightfield nos dias um, três, cinco e sete organoides pós-divisão são mostradas aqui. Em média, os organoides são divididos uma vez por semana quando os centros ficam escuros.Alterando as condições da mídia, removendo wnt-3a e reduzindo R-spondin e noggin, a complexidade celular encontrada dentro do intestino humano pode ser imitada. Normalmente, a diferenciação celular em relação às células paneth, células de cálice e enterócitos requer quatro dias de mídia de diferenciação. A análise dos dados de sequenciamento de células únicas do SARS-CoV-2 infectou cólon humano e organoides derivados de ípio mostrou que apenas uma subpopulação de células epiteliais intestinais humanas apoiou a infecção do SARS-CoV-2 após 12 e 24 horas.A análise das respostas imunes inatas em organoides derivados do cólon infectados pelo SARS-CoV-2 mostrou que o SARS-CoV-2 induziu uma cascata de sinal pró-inflamatório em células infectadas, enquanto células de espectadores não infectadas mostraram uma resposta imune mediada por interferon. Além disso, o sequenciamento de RNA de células únicas mostrou que as células infectadas não conseguiam sentir interferons devido ao bloqueio mediado pelo vírus da via. Os organoides devem ser bem diferenciados e saudáveis.Isso pode ser controlado determinando o nível de marcadores de diferenciação celular por qPCR antes da infecção. Se as células não forem bem diferenciadas, elas não suportarão a infecção viral e levarão a resultados não informativos. Esta técnica nos permite infectar a mucosa tanto do lado luminal quanto do tecido.Isso é muito importante, pois nos permite desvendar mecanismos usados pelas superfícies mucosas para tolerar um ambiente sujo de um lado e um estéril do outro.

adapting-gastrointestinal-organoids-for-pathogen-infection-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção de organoides gástricos por microinjeção do patógeno gástrico Helicobacter pylori no lúmen dos organoides. Este modelo ajuda no estudo das alterações induzidas por infecções nas células gástricas.

Estabelecendo um Modelo de Infecção por Microinjeção de Organoides Gástricos com Bactérias Patogênicas

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro   sistema modelo.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

As culturas derivadas de células-tronco abrigam um tremendo potencial para modelar doenças infecciosas. Aqui, a cultura de organoides gástricos de camundongos e humanos derivados de células-tronco adultas é descrita. Os organoides são microinjetados com o patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Os organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) oferecem oportunidades emocionantes para modelar doenças entéricas in vitro. Nós demonstramos a diferenciação de hiPSCs em organoids intestinais (iHOs), na estimulação destes iHOs com cytokines, e na microinjeção de Salmonella typhimurium no lúmen de Iho, permitindo o estudo de uma invasão epithelial por este Patógeno.

Usando organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para estudar e modificar a proteção de células epiteliais contra Salmonella e outros patógenos

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

Este estudo apresenta um protocolo para geração de monocamadas 2D intestinais bovinas a partir de organoides, oferecendo melhor acesso para o estudo das interações patógeno-hospedeiro. Inclui métodos para avaliar a integridade e funcionalidade da membrana, avançando modelos in vitro que imitam a fisiologia gastrointestinal do gado. Essa abordagem promete benefícios biomédicos e agrícolas significativos, incluindo estratégias de tratamento aprimoradas.

Avanços na tecnologia de organoides bovinos usando interfaces de monocamada de intestino delgado e grosso

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

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Aqui, descrevemos um protocolo para gerar organoides intestinais apicais a partir de culturas organoides incorporadas à matriz padrão. Ele também descreve a incorporação subsequente de EdU em células de proliferação ativa e a quantificação semiautomática de células EdU-positivas.

Geração de organoides intestinais apicais e avaliação da taxa de proliferação de organoides usando marcação EdU

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

Aprenda a infectar organoides intestinais humanos para estudar interações hospedeiro/patógeno usando sequenciamento de células únicas. Este método permite analisar respostas celulares a vírus em nível individual.

Adaptação de organoides gastrointestinais para infecção por patógenos e sequenciamento de células únicas sob condições de nível de biossegurança 3 (BSL-3) (Vídeo) | JoVE Journal

Adaptação de organoides gastrointestinais para infecção por patógenos e sequenciamento de células únicas sob condições de nível de biossegurança 3 (BSL-3)

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