Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Este protocolo disseca as propriedades mecânicas individuais do núcleo celular que o tornam um medidor mecânico para polarização celular, diferenciação e migração. A principal vantagem desta técnica é que ela pode medir propriedades mecânicas e aplicar forças em compartimentos subcelulares sem perturbação externa da membrana ou citoesqueleto cortical. O protocolo pode ser facilmente adaptado para manipular contas dentro de outras células de outros organismos, a fim de estudar a mecânica nuclear em diferentes linhas celulares ou modelos animais.

O alinhamento do sensor de força direta é fundamental para capturar toda a luz que cria e deixa as armadilhas ópticas. Isso garantirá medições precisas de impulso de luz no meio viscoelástico de uma célula. Comece a preparação unicelular colocando os embriões do estágio da esfera quatro horas após a fertilização em um prato de vidro contendo mídia E3 usando uma pipeta pasteur de plástico.

Em seguida, selecione os embriões que são positivos para as contas e expresse a proteína fluorescente em caso de injeção de mRNA. Use fórceps para descurionar manualmente os embriões e transferir aproximadamente 10 a 15 embriões descurionados para um recipiente de reação de 1,5 mililitro com a ajuda de uma pipeta Pasteur de vidro. Remova a mídia E3 do tubo e adicione 500 microliters de meio de cultura de tecido independente de dióxido de carbono pré-aquecido.

Agite suavemente o tubo evitando a formação de bolhas e certifique-se de que o conteúdo do tubo fique turva à medida que as células se dissociam sem grandes pedaços visíveis pelo olho. Em seguida, centrifugar o tubo a 200 vezes G por três minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenante e colete a pelota para proceder com a coloração celular.

Para rotular o núcleo, resuspenque as células adicionando 500 microlitres da solução de coloração de corante hoechst de DNA recém-preparada ao tubo. Incubar as células manchadas por sete minutos no escuro. Em seguida, centrifugar as células como descrito anteriormente e resuspensar a pelota em 50 microliters de DMEM para amostras em suspensão ou 20 microliters de DMEM para células em confinamento.

Para a preparação das armadilhas ópticas ou câmara OT para os experimentos com as células em suspensão, corte um pedaço de fita adesiva de dois lados com um buraco quadrado de aproximadamente 10 milímetros por 10 milímetros no centro. Retire uma das camadas protetoras da fita e coloque o lado descoberto da fita no centro de um prato de fundo de vidro número 1,5 H. Pressione a fita suavemente para obter toda a superfície da fita adere ao vidro, evitando bolhas de ar e retire a camada protetora restante da fita.

Incubar a superfície com 100 microliters de Concanavalina A a 0,5 miligramas por mililitro por 30 minutos. Em seguida, remova a gota de Concanavalina A e enxágue a superfície com DMEM. Adicione 30 microlitres da solução contendo as células na superfície da cavidade.

Em seguida, feche a câmara muito suavemente com um vidro de cobertura de 22 por 22 milímetros. Use um bisturi ou fórceps, se necessário. Em seguida, prossiga para a inicialização óptica de pinças, ligando o laser com potência consideravelmente alta por pelo menos 30 minutos antes do experimento para otimizar a estabilidade de potência de saída.

Quando feito, ligue o módulo eletrônico das unidades de medição óptica de micro manipulação e força. Antes de alinhar o sensor de força óptica, coloque uma gota de água no objetivo de imersão de água 60X 1.2 e coloque a câmara contendo as células no palco. Concentre-se na superfície inferior da câmara onde as amostras de células serão colocadas.

Depois de adicionar uma gota de óleo de imersão em cima do slide de vidro de cobertura que cobre a amostra, baixe a lente coletora da unidade do sensor de força até que ela entre em contato com a gota de óleo. Seguindo o procedimento padrão para o alinhamento do sensor de força óptica, olhe para a imagem do plano de amostra na câmera auxiliar a ser usada para posicionar os OTs e, em seguida, baixe o sensor de força óptica até que sua parada de campo apareça conjugada no plano de amostra. Para verificar se há bolhas de ar com a lente Bertrand, observe o caminho de imagem através da câmera auxiliar.

Se alguma sujeira ou bolhas de ar forem visíveis, limpe a lente e a câmara com tecido de lente livre de poeira antes de repetir o procedimento como descrito, adicionando mais óleo de imersão. Utilizando os parafusos laterais colocados no suporte do sensor de força óptica, centralize a parada de campo no campo de visão. Para precisão, abra a parada de campo quase para ocupar o campo de visão visível na câmera auxiliar.

Depois de colocar a amostra no microscópio e alinhar o sensor de força óptica, use a placa de meia onda rotativa para definir a potência inicial da armadilha para 200 miliwatts se a rigidez do núcleo ou da estrutura intercelular investigada não for conhecida. Uma vez feito, use o controlador de software de estágio do microscópio para procurar uma célula com uma ou duas contas através de microscopia Brightfield transmitida. Na folha numérica, escreva o deslocamento e o tempo de cada etapa de trajetória subsequente.

Alternativamente, carregue a tabela S1 do material complementar. Para um experimento de estresse/relaxamento, programe as cargas trapezoidais a serem aplicadas. No software OT, ative as armadilhas ópticas.

Para capturar uma microesfera, coloque os planos de imagem ligeiramente acima da esfera com um controlador de software de estágio de microscópio. Clique no microesfera de poliestireno na janela de imagem da câmera auxiliar calibrada. O confinamento bem sucedido da conta pela armadilha óptica reduzirá fortemente o movimento da conta.

Clique e arraste a pérola através do citoplasma e coloque-a a uma distância de aproximadamente dois mícrons do envelope nuclear. Certifique-se de que a trajetória seja definida para que o recuo de contas seja perpendicular à membrana nuclear. Quando a configuração estiver pronta, vá para o software de imagem e clique no botão de aquisição para iniciar a aquisição de imagens.

Abra a janela de leitura de força em tempo real, clique em dados e salve na janela de leitura de força em tempo real para salvar. Inicie a posição da armadilha e force os dados de medição. Inicie a trajetória previamente carregada clicando no lado direito da conta e selecionando a trajetória inicial.

Aguarde até que a trajetória esteja concluída e o sistema se estabilize antes de terminar o registro dos dados de medição da força de armadilha. Pare a aquisição de imagens e plote os resultados no software pós-processamento. Na análise representativa, uma célula-tronco progenitora de zebrafish isolada com uma única microesfera próxima ao núcleo é exibida.

A distribuição da microesfera de poliestireno cinco horas após a injeção dentro de um embrião foi monitorada. Brightfield e a imagem de fluorescência mostram que as contas estão espalhadas pelo tecido do embrião. A projeção máxima da pilha Z fluorescente confocal e uma projeção máxima de uma subco pilha na mesma região confirma que uma grande fração de células profundas continha de uma a duas contas.

Às 24 horas após a fertilização, as contas foram distribuídas por todo o corpo do embrião. Foram obtidos os micrografos Brightfield das células de suspensão nas células confinadas com uma ou duas contas injetadas. Além disso, vários rótulos fluorescentes facilitaram a investigação de diferentes aspectos das células, como membrana internuclear, membrana plasmática, DNA e linha transgênica.

Instantâneos representativos descreveram núcleos rotulados por Hoechst cinco segundos antes/durante e cinco segundos após o recuo com uma microesfera presa opticamente. Foram estudados perfis de intensidade ao longo do segmento de recuo para três quadros e trajetórias diferentes dos limites distal e proximal do núcleo durante um experimento de recuo de células suspensas e confinadas. Trajetória e força presas experimentadas pela microesfera presa opticamente durante um repetido experimento de recuo nuclear foram medidos.

A mecânica do núcleo nas celas em suspensão e sob confinamento confirmou que o confinamento resultou em uma expansão da área projetada e uma mudança insignificante na rigidez nuclear. Se as contas forem injetadas no embrião de um estágio celular, elas provavelmente distribuirão uniformemente nos estágios posteriores. Lembre-se que a conta deve estar presa.

Se a conta escapar da armadilha óptica, redefina a trajetória ou aumente a potência do laser. Esses experimentos podem ser facilmente realizados em múltiplas microesferas dentro de uma célula e estendidos a medidas ativas de microrrehecologia.