Name: Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a medir propriedades mecânicas nucleares em células embrionárias de Danio rerio usando pinças ópticas. Este método permite aplicar forças subcelulares sem perturbar a membrana celular ou o citoesqueleto cortical.

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MK reconhece apoio financeiro do Ministério da Economia e Competitividade espanhola através do Plano Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa programa para Centros de Excelência em P&D (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), da Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig, e da Generalitat de Catalunya através do programa CERCA e Pesquisa (2017 SGR 1012), além de financiamento através da ERC (MechanoSystems) e HFSP (CDA00023/2018). A V.R. reconhece o apoio do Ministério da Ciência e Inovação espanhol à parceria da EMBL, do Centro de Excelencia Severo Ochoa, do Plano Nacional da MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) e da Generalitat de Catalunya (CERCA). A V.V. reconhece o apoio do Programa de Doutorado icfostepstone financiado pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie 665884. Agradecemos a Arnau Farré pela leitura crítica do manuscrito; Maria Marsal para a ajuda com a imagem e montagem do embrião de 24 hpf e; Senda Jiménez-Delgado para apoio com micronjeções de zebrafish.

Os autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, descrevemos um método único para interrogar as propriedades mecânicas do núcleo celular dentro das células vivas. Diferente de outras técnicas de espectroscopia de força, a captura óptica não invasiva nos permitiu desacoplar a contribuição da membrana celular e do citoesqueleto da rigidez nuclear da célula. É importante ressaltar que a micromanipulação óptica é compatível com microscopia multimodal, que permitirá ao experimentador estudar diferentes processos envolvidos na mecanobiologia nuclear celular. Como resultado representativo, usamos a coloração DNA-Hoechst para medir a deformação do núcleo após o recuo realizado por forças da ordem de várias centenas de picoNewton.
Aplicações potenciais de nosso método além dos exemplos descritos neste protocolo A possibilidade de extrair informações mecânicas quantitativas de medições dentro de células vivas sem perturbações externas permite uma infinidade de oportunidades sem precedentes que estão apenas começando a ser exploradas. Assim, o protocolo apresentado de nossa plataforma óptica de micromanipulação pode ser estendido a experimentos mais complexos com grande versatilidade. Os defletores acousto-ópticos (AOD) podem gerar múltiplas armadilhas ópticas para medições de força síncrona em diferentes locais de células, bem como podem ser usados para microrrehetologia ativa em uma ampla faixa de frequência51,61. Como foi mencionado, a resposta da força após o recuo pode superar a força máxima de captura, levando a uma fuga da conta da armadilha óptica. Neste caso, um feedback de força pode ser configurado com o AOD para fixar a força óptica. Em suma, múltiplas abordagens microrrehelógicas, como o relaxamento do estresse descrito neste protocolo, mas também a microrrehetologia ativa ou conformidade com rastejantes, podem ser obtidas experimentalmente com esta plataforma e analisadas minuciosamente por novos pacotes de software61,62,63,64,65 . Além disso, a aplicação de forças não se limita ao núcleo, mas poderia, em princípio, ser realizada para medir diversas estruturas intracelulares e em tecidos complexos como demonstrado para prender glóbulos vermelhos fluindo dentro de vasos sanguíneos intactos66,67 ou prender e deformar cloroplastos e mitocôndrias68 . A calibração do momento da luz é independente da forma e tamanho do objeto preso, permitindo assim medições de força direta em qualquer sonda de força com forma arbitrária38,39. O uso de microesferas injetadas nos permitiu aplicar altas forças no núcleo com poder laser relativamente baixo em comparação com a manipulação direta das estruturas celulares69,70,71. No entanto, dada uma alta diferença de índice refrativo suficiente, nenhuma sonda de força aplicada externamente é necessária e organelas intracelulares podem ser manipuladas diretamente sem contas injetadas (observações inéditas e referência70).
Modificações potenciais do nosso método para estender as aplicações Diferentes tamanhos de microesferas podem ser injetados dependendo do experimento, mas os controles relativos devem ser feitos. Por exemplo, estudar células em estágios posteriores contas menores podem ser injetadas. Isso reduzirá a força máxima que pode ser exercida pela armadilha óptica (como mostrado em referência55). Contas maiores podem ser injetadas para exercer forças mais altas, mas estas podem afetar o desenvolvimento de embriões dependendo de seu tamanho ou estágio de interesse. Em experimentos onde a injeção de microesferas não é uma opção, várias organelas que apresentam diferenças de índices refrativos em comparação com a do citoplasma ainda podem ser manipuladas opticamente, dando origem a forças ópticas mensuráveis a partir de mudanças de momento leve42. Como mencionado acima, esses métodos têm sido empregados por Bambardekar et al. para deformar as junções celulares no embrião Drosophila70. Da mesma forma, o núcleo da célula tem um índice de refração menor do que o médio circundante44, o que permite o recuo livre de contas (observações inéditas e referência72) mesmo com menor força de captura. Assim, o núcleo não pode ser preso facilmente e escapa da armadilha.
O espaçador PDMS revestido de spin é fabricado através de um método conveniente e rápido, mas pode estar fora de alcance para laboratórios sem acesso a uma instalação de micro/nanofabização ou laboratórios de engenharia. Assim, o espaçador pode ser facilmente montado a partir de fita de laboratório ou parafilme (passo 4). O protocolo também pode ser adaptado pela fabricação de canais microfluidos que automatizam a entrega de células únicas em poços de medição predefinidos ou em uma câmara com altura definida para estimar o efeito de confinamento dentro do mesmo espécime. No entanto, tais dispositivos microfluidos devem ser projetados para que se encaixem no espaço entre o objetivo do microscópio e a lente coletora do sensor de força óptica, de cerca de 2 mm (ver passo 3). Observe que o sensor de força óptica deve ser posicionado na altura apropriada para que nenhuma aberração óptica de desfoco afete a medição do momento do fóton.
Outras modificações podem incluir a mudança de repórteres biológicos. Descobrimos que a fluorescência hoechst sangra espectralmente no canal GFP e, assim, favorecemos a combinação com histona mCherry-tagged como um marcador nuclear para medição simultânea em dois canais fluorescentes. Alternativamente, a deformação nuclear pode ser facilmente rastreada com um rótulo direcionado à membrana nuclear interna, como Lap2b-GFP (Figura 2).
O recuo no núcleo celular era da ordem de 2-3 mícrons, que pudemos medir com precisão pela análise de imagem da microscopia confocal de disco giratório limitada de difração. Para o caso de núcleos mais rígidos ou forças menores, o recuo será pouco mensurável usando esta abordagem. No entanto, as pinças ópticas calibradas por força absoluta também podem ser calibradas para medições de posição da conta presa in situ usando interferometria BFP com precisão de nanômetro51. Usando esta abordagem, o sinal de tensão e o sensor de força óptica podem ser traduzidos para a posição da sonda presa através do parâmetro β [nm/V], enquanto o parâmetro invariante α [pN/V] produz valores de força através da calibração de impulso de luz acima mencionada41 (veja abaixo para detalhes).
Solucionando problemas Descobrimos que os seguintes desafios poderiam ocorrer durante o experimento:
Nenhuma armadilha estável é formada e a microesfera escapa facilmente Qualquer sujeira no objetivo do microscópio ou uma coleira de correção desalinhada pode levar a uma falha de uma armadilha estável. Se uma solução imediata não for encontrada, meça a função de propagação de pontos da lente objetiva. Se o espécime de interesse estiver no interior de um tecido opticamente denso, o foco do laser pode experimentar severas aberrações ópticas que levam a armadilhas instáveis (este efeito geralmente é insignificante em células isoladas, mas torna-se mais evidente em tecidos mais grossos). Para a alta rigidez, a força restauradora do núcleo poderia exceder a força de fuga da armadilha, de tal forma que a microesfera se perde e a rotina de recuo falha. Inicialmente, a borda da membrana nuclear proximal à armadilha óptica fica quase sem recuada (Figura S2A). Quando isso ocorre, o laser de trapping não é mais afetado pela força e pelo movimento browniano, o que leva a uma queda de força para zero e uma diminuição do ruído do sinal (Figura S2B). Caso isso aconteça, a potência do laser pode ser aumentada para ter uma armadilha mais forte, a amplitude da trajetória trapezoidal empurrando a conta para o núcleo pode ser reduzida, ou a posição inicial da microesfera presa pode ser definida mais longe do núcleo.
A célula está se movendo durante a estimulação Se as células não estiverem suficientemente ligadas, a armadilha gradiente óptica moverá as células enquanto executa a rotina de recuo intracelular, de tal forma que as forças e a mecânica subjacente do núcleo sejam artefatos. Para evitar o deslocamento de toda a célula, recomendamos aumentar a concentração de moléculas de adesão celular na superfície, por exemplo,.
Compensação inicial de impulso Se uma rotina inicial de compensação de impulso não estiver disponível na plataforma OTs (etapa 6.5), um sinal de linha de base artificial e independente da força precisa ser corrigido. Isso é visível como uma inclinação na curva de força mesmo sem contas presas (Figura S1E). Para fazer a correção, a mesma trajetória precisa ser realizada sem uma conta, fora da cela exatamente na mesma posição. Para isso, mova a célula para longe da armadilha usando o controle do palco. Como referência, o deslocamento de força muda 5 pN em todo o FOV a 200 mW em nosso sistema; assim, torna-se insignificante para trajetórias curtas. Alternativamente, um estágio de varredura piezo pode ser usado para mover as células na amostra, deixando a posição do laser constante.
Etapas críticas do protocolo apresentado Microesferas devem ser injetadas no estágio direito de 1 célula para garantir a distribuição máxima sobre o embrião. As contas não devem ser fluorescentes para que nenhuma luz vaze nos canais fluorescentes usados para imagens. Por exemplo, mesmo as contas típicas vermelha-fluorescentes são claramente visíveis no canal azul usado para a imagem do núcleo celular após a coloração de Hoechst devido ao seu brilho (excitação: 405 nm; emissão: 445 nm). A fixação estável da célula ao substrato é fundamental para evitar o deslocamento lateral durante a rotina de recuo. Se a célula se move durante a rotina, as forças são subestimadas. Caso isso aconteça com frequência, otimize o protocolo de fixação. Para células de cultura tecidual, outras proteínas de adesão celular, como fibronectina, colágeno ou poli-L-lysina levam a um apego satisfatório (observações inéditas). Durante o confinamento, as células são submetidas a um estresse mecânico repentino e severo. Isso pode causar danos às células e, frequentemente, o experimentador encontrará células estouradas se o procedimento não for realizado cuidadosamente. Além disso, se a altura do confinamento for muito pequena, todas as células sofrerão de quebra nuclear ou danos irreversíveis. Para amenizar isso, abaixe a tampa superior mais lentamente e/ou aumente o espaçamento entre o deslizamento de tampas.
Limitações da técnica e sugestões para superá-las Uma clara limitação da técnica é a penetração da luz laser em seções profundas do tecido, o que leva a aberrações e armadilhas instáveis. Assim, um limite menor de profundidade de penetração depende da clareza da amostra, da correção da aberração que pode ser empregada73 e da potência laser aplicada. Deve-se levar em conta que uma maior potência laser leva à excitação térmica da amostra nas proximidades da microesfera. No entanto, o aquecimento da amostra originada pelo ponto laser de comprimento de onda de 1064 nm é minimizado para evitar estresse plausível relacionado ao calor em nossas amostras biológicas74.
Outra limitação é a força máxima que pode ser medida. Embora a detecção direta de impulso de luz permita medições de força muito além do regime de resposta linear da armadilha óptica40,41, a força máxima aplicada está na ordem de algumas centenas de picoNewtons. Isso é limitado pela potência do laser e pelo limiar de dano consequente do material biológico macio e pelas diferenças de índice refrativo, que normalmente não são maiores que 0,1 ou 0,344. Vários métodos foram propostos para aumentar o limite de detecção de força, por exemplo, usando luz estruturada75, microesferas revestidas anti-reflexivas76, partículas de índice de alta refração77 ou pontos quânticos altamente dopados78.
Os OTs podem ser usados para medições de posição em escala de nanômetros através da interferometria BFP, de modo que a posição da conta dentro da armadilha seja Δx = β Sx, onde Sx é o sinal de tensão do sensor, e β [μm/V] pode ser calibrado em tempo real seguindo diferentes protocolos35,54. Para um sensor de força óptica, pode-se provar que o fator de conversão invariante de tensão para força α [pN/V] se relaciona diretamente com β e a rigidez da armadilha, k [pN/μm], através de α = kβ 37) Em experimentos com deslocamentos de contas que são muito pequenos para serem detectados a partir de imagens ópticas, essa estratégia pode ser usada para complementar as medições de força com pequenas detecção de posição. Um exemplo é a aplicação das rotinas experimentais apresentadas aqui em núcleos muito rígidos, para os quais forças a potências laser razoáveis (200-500 mW) não são suficientes para induzir valores de recuo grandes o suficiente. Nesse caso, a conta precisa ser trazida em contato com o núcleo e a rigidez de trapping deve ser calibrada antes da medição (etapa 8.6). O recuo do núcleo em função da força pode ser indiretamente determinado como:
d = xtrap - F/k
onde xtrap é a posição da armadilha. Diferente do fator de impulso de luz invariante α [pN/V], o fator β [μm/V] precisa ser calibrado antes de cada experimento, uma vez que depende de muitas variáveis locais determinando a dinâmica de captura, como o tamanho da partícula, tamanho do ponto de armadilha óptico e índices relativos de refração.

A morfogênese tecidual é um processo complexo no qual sinais bioquímicos e forças físicas são coordenados espacialmente. No embrião em desenvolvimento, gradientes de fatores de sinalização bioquímica ditam a especificação do destino e garantem a padronização correta do tecido1,2. Ao mesmo tempo, forças intrínsecas e extrínsecas desempenham um papel na construção da arquitetura do embrião3,4. A influência da mecânica do córtex celular neste contexto tem sido estudada extensivamente5,6. A interconexão apertada entre os processos mecano-químicos durante a morfogênese depende das propriedades de células únicas para sentir e responder às forças mecânicas em seu microambiente tecidual. As células, assim, decodificam sinais mecânicos através da presença de elementos subcelulares e moleculares sensíveis à força que transduzem informações mecânicas em vias específicas de sinalização controlando o comportamento celular, o destino celular e a mecânica celular.
Uma marca dos processos de desenvolvimento é que as células se organizam como grupos para construir estruturas multicelulares. Como tal, as células únicas raramente reorganizam e se movem sozinhas, mas estão associadas a um sociotope apertado no qual mostram comportamentos coletivos como migração supracelular7, (un)transições de interferência8,9 ou compactação blastocisto10. As forças mecânicas geradas dentro e entre as células servem como importantes pistas para instruir a dinâmica celular coletiva7,11. Mas mesmo quando as células se movem sozinhas, como células progenitoras que se espremem entre folhas de tecido ou nichos de tecido estreitos, elas experimentam extensas forças mecânicas anisotrópicas ao navegar em um ambiente tridimensional. Essas tensões mecânicas nas células têm profundas consequências no comportamento celular12,13. Vários mecanismos têm sido investigados que convergem no núcleo como um elemento principal de mecanotransdução14,15, como elemento mecânico passivo ou ativo durante a migração dentro de um ambiente desnso de tecido 3D15,16.
Recentemente propusemos um mecanismo que equipa células para medir deformações de forma usando o núcleo como um medidor de mecano intracelular elástico12. O núcleo, sendo a maior organela de uma célula, sofre grandes deformações quando as células polarizam, migram ou mudam sua forma sob estiramento mecânico, confinamento ou estresse osmótico16,17,18,19. Descobrimos que o estiramento do envelope nuclear junto com o posicionamento intracelular do núcleo fornece às células informações sobre a magnitude e o tipo de deformação celular (como compressão celular versus inchaço celular). O alongamento do núcleo está associado a um desdobramento da membrana nuclear interna (INM), que promove a atividade de lipase dependente de cálcio cPLA2 (fosfolipase citossolica A2) no INM seguido da liberação do Ácido Aracidônico (AA) e rápida ativação da minocina II no córtex celular. Isso leva ao aumento da contratilidade celular e migração de células amoeboides acima de um limiar de contratilidade cortical6. A resposta mecanosensível à deformação celular ocorre em menos de um minuto e é reversível após a liberação do confinamento, sugerindo que o núcleo age como um medidor de tensão para propriocepção celular regulando o comportamento celular adaptativo em condições mecânicas de estresse. Este caminho mecanosensível mostra-se ativo em células-tronco progenitoras derivadas de embriões de zebrafish, tanto em células pluripotentes quanto em linhagem12 e é conservado em diferentes espécies e linhas celulares20.
Além das propriedades nucleares como mecanosensor celular, a arquitetura nuclear e a mecânica são intrinsecamente reguladas durante o desenvolvimento e em resposta à especificação de destino celular21, afinando assim a sensibilidade à mecano celular22,23. A consequência pode ser uma mudança na conformidade nuclear que permite mudanças morfológicas e transições de um pré-aluno para um estado migratório e vice-versa8.
Várias técnicas para medir a mecânica do núcleo celular foram aplicadas, como microscopia de força atômica24,25, aspiração de micropipette26,27, tecnologia microfluida28 e microaícetas29. No entanto, muitas dessas técnicas são invasivas no sentido de que toda a célula deve ser deformada, limitando a medição de características mecânicas e respostas dependentes da força do próprio núcleo. Para contornar a deformação simultânea da superfície celular e seu córtex celular mecanosensível30, núcleos isolados foram estudados em diversos contextos31,32. No entanto, não se pode descartar que o isolamento nuclear esteja associado a uma mudança nas propriedades do núcleo mecânico e sua regulação (referência24 e próprias observações inéditas).
Pinças ópticas (OTs) são uma tecnologia versátil que permitiu uma infinidade de experimentos na mecanobiologia celular e têm sido fundamentais em nossa compreensão de como as máquinas moleculares convertem produtos químicos em energia mecânica333,34. As pinças ópticas usam um raio laser bem focado para exercer forças ópticas em partículas dielétricas que têm um índice de refração superior ao médio circundante33. Tais forças podem ser da ordem de centenas de pico-newtons e resultar em confinamento efetivo da partícula dentro do foco da armadilha laser, permitindo a manipulação da partícula presa em três dimensões. O uso da luz tem uma vantagem importante na medida em que a medida pode ser realizada não invasivamente dentro das células vivas. As manipulações ópticas estão ainda limitadas ao foco da armadilha do raio laser. Assim, a manipulação pode ser realizada sem estimular as membranas celulares circundantes e não perturba os processos do córtex de actina ou mecanosensíveis na membrana plasmática, como a ativação dependente da força dos canais de íons.
A dificuldade da abordagem óptica da pinça é determinar precisamente as forças aplicadas à microesfera usando abordagens clássicas que dependem da calibração da força indireta com base no teorema da equipartição ou no uso de forças definidas de arrasto de Stokes para medir uma força de fuga dependente de laser35. Considerando que esses métodos são simples de implementar em um experimento in vitro, eles geralmente não podem ser traduzidos em um ambiente celular. Várias estratégias foram introduzidas no campo que dependem de uma calibragem direta da força, derivada dos primeiros princípios de conservação do momento36,37. Ao contrário de outras abordagens de espectroscopia de força, as medidas de força são deduzidas de um intercâmbio local de impulso de luz com a partícula presa de forma arbitrária38,39. Em nossa configuração experimental, as mudanças no momento da luz decorrentes de forças ópticas são diretamente medidas sem a necessidade de calibração in situ trap40,41,42,43. Assim, as medidas se tornam possíveis em um ambiente viscoso, como o interior da célula ou mesmo dentro de um tecido, e as forças podem ser facilmente quantificadas até o nível pN.
Neste protocolo, descrevemos um ensaio para manipular mecanicamente organelas ou estruturas intracelulares e avaliar quantitativamente suas propriedades mecânicas por uma configuração óptica de pinça. Esta configuração é integrada a um microscópio fluorescente de disco giratório que permite imagens paralelas do comportamento celular ou dinâmica intracelular. O ensaio permite a caracterização das propriedades mecânicas de compartimentos celulares específicos, como o núcleo, ao mesmo tempo em que estuda a possível mecanoresponse e ativação de vias de sinalização molecular como resultado da própria deformação. Além disso, a captura óptica de microesferas injetadas dentro das células permite um aumento da força de recuo graças a um índice refrativo consideravelmente maior da conta de poliestireno (n = 1,59) em comparação com o contraste refrativo intrínseco44 do núcleo (n ~ 1,35) versus citoplasma (n ~ 1,38). A estratégia apresentada pode ser facilmente adaptada ao estudo de outras estruturas intracelulares e organelas, bem como outras abordagens envolvendo microrrehetologia ativa, uso de múltiplas armadilhas ópticas para sondar as mesmas/diferentes estruturas subcelulares simultaneamente, e medições visando a mecanobiologia celular no embrião vivo.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Óculos de cobertura de 22 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 mm Óculos de cobertura</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H pratos de fundo de vidro</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>10-um contas</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>1-mm capilares de vidro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>1-um poliestireno microesferas</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-um contas vermelho-fluorescentes</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Câmeras Aqcuisition sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>Câmera auxiliar (Figura 3, AUX)</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0,17 mM KCl. 0,33 mM CaCl2. 0,33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de imagem</td> Óleo de imersão <td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cargille</td><td>Tipo B: 16484</td><td></td></tr><tr><td>Proteção IR googles</td><td>Pipeta de micro carregador Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microinjetor Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos</td> de <td>precisão mundial</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromiter slide</td><td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisões</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>Estágio motorizado</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulhas</td><td>Sutter instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de pinças ópticas</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs software (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Agente de cura</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Software de pós-processamento (Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico de passagem curta (Figura 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Sistemas de revestimento especiais</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de disco giratório</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinjeção triangular</td><td>Ferramentas Adaptativas da Ciência</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Forno Universal</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de imersão em água</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Durante o desenvolvimento de um organismo multicelular, uma única célula fertilizada se divide e dá origem a múltiplos tecidos com funções diversas. A morfogênese tecidual acompanha mudanças moleculares e estruturais no nível celular único que resultam em variações de propriedades mecânicas subcelulares. Como consequência, mesmo dentro da mesma célula, diferentes organelas e compartimentos resistem de forma diferente aos estresses mecânicos; e as vias de mecanotransdução podem regular ativamente suas propriedades mecânicas. A capacidade de uma célula de se adaptar ao microambiente do nicho tecidual, portanto, deve-se, em parte, à capacidade de sentir e responder a tensões mecânicas. Recentemente propusemos um novo paradigma de mecanosensação no qual a deformação e o posicionamento nuclear permitem que uma célula avalie o ambiente 3D físico e dota a célula com um senso de propriocepção para decodificar mudanças na forma celular. Neste artigo, descrevemos um novo método para medir as forças e propriedades materiais que moldam o núcleo celular dentro das células vivas, exemplificado em células aderentes e células mecanicamente confinadas. As medições podem ser realizadas não invasivamente com armadilhas ópticas dentro das células, e as forças são diretamente acessíveis através da detecção livre de calibração do momento da luz. Isso permite medir a mecânica do núcleo independentemente das deformações da superfície celular e permitir a dissecção de vias de mecanodução exteroceptiva e interoceptiva. É importante ressaltar que o experimento de captura pode ser combinado com microscopia óptica para investigar a resposta celular e a dinâmica subcelular usando imagens de fluorescência do citoesqueleto, íons de cálcio ou morfologia nuclear. O método apresentado é simples de aplicar, compatível com soluções comerciais para medições de força, e pode ser facilmente estendido para investigar a mecânica de outros compartimentos subcelulares, por exemplo, mitocôndrias, fibras de estresse e endossários.

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as propriedades mecânicas intracelulares de células isoladas de zebrafish em bidimensionais com medição direta de força por uma armadilha óptica.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Este protocolo disseca as propriedades mecânicas individuais do núcleo celular que o tornam um medidor mecânico para polarização celular, diferenciação e migração. A principal vantagem desta técnica é que ela pode medir propriedades mecânicas e aplicar forças em compartimentos subcelulares sem perturbação externa da membrana ou citoesqueleto cortical. O protocolo pode ser facilmente adaptado para manipular contas dentro de outras células de outros organismos, a fim de estudar a mecânica nuclear em diferentes linhas celulares ou modelos animais.O alinhamento do sensor de força direta é fundamental para capturar toda a luz que cria e deixa as armadilhas ópticas. Isso garantirá medições precisas de impulso de luz no meio viscoelástico de uma célula. Comece a preparação unicelular colocando os embriões do estágio da esfera quatro horas após a fertilização em um prato de vidro contendo mídia E3 usando uma pipeta pasteur de plástico.Em seguida, selecione os embriões que são positivos para as contas e expresse a proteína fluorescente em caso de injeção de mRNA. Use fórceps para descurionar manualmente os embriões e transferir aproximadamente 10 a 15 embriões descurionados para um recipiente de reação de 1,5 mililitro com a ajuda de uma pipeta Pasteur de vidro. Remova a mídia E3 do tubo e adicione 500 microliters de meio de cultura de tecido independente de dióxido de carbono pré-aquecido.Agite suavemente o tubo evitando a formação de bolhas e certifique-se de que o conteúdo do tubo fique turva à medida que as células se dissociam sem grandes pedaços visíveis pelo olho. Em seguida, centrifugar o tubo a 200 vezes G por três minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenante e colete a pelota para proceder com a coloração celular.Para rotular o núcleo, resuspenque as células adicionando 500 microlitres da solução de coloração de corante hoechst de DNA recém-preparada ao tubo. Incubar as células manchadas por sete minutos no escuro. Em seguida, centrifugar as células como descrito anteriormente e resuspensar a pelota em 50 microliters de DMEM para amostras em suspensão ou 20 microliters de DMEM para células em confinamento.Para a preparação das armadilhas ópticas ou câmara OT para os experimentos com as células em suspensão, corte um pedaço de fita adesiva de dois lados com um buraco quadrado de aproximadamente 10 milímetros por 10 milímetros no centro. Retire uma das camadas protetoras da fita e coloque o lado descoberto da fita no centro de um prato de fundo de vidro número 1,5 H. Pressione a fita suavemente para obter toda a superfície da fita adere ao vidro, evitando bolhas de ar e retire a camada protetora restante da fita.Incubar a superfície com 100 microliters de Concanavalina A a 0,5 miligramas por mililitro por 30 minutos. Em seguida, remova a gota de Concanavalina A e enxágue a superfície com DMEM. Adicione 30 microlitres da solução contendo as células na superfície da cavidade.Em seguida, feche a câmara muito suavemente com um vidro de cobertura de 22 por 22 milímetros. Use um bisturi ou fórceps, se necessário. Em seguida, prossiga para a inicialização óptica de pinças, ligando o laser com potência consideravelmente alta por pelo menos 30 minutos antes do experimento para otimizar a estabilidade de potência de saída.Quando feito, ligue o módulo eletrônico das unidades de medição óptica de micro manipulação e força. Antes de alinhar o sensor de força óptica, coloque uma gota de água no objetivo de imersão de água 60X 1.2 e coloque a câmara contendo as células no palco. Concentre-se na superfície inferior da câmara onde as amostras de células serão colocadas.Depois de adicionar uma gota de óleo de imersão em cima do slide de vidro de cobertura que cobre a amostra, baixe a lente coletora da unidade do sensor de força até que ela entre em contato com a gota de óleo. Seguindo o procedimento padrão para o alinhamento do sensor de força óptica, olhe para a imagem do plano de amostra na câmera auxiliar a ser usada para posicionar os OTs e, em seguida, baixe o sensor de força óptica até que sua parada de campo apareça conjugada no plano de amostra. Para verificar se há bolhas de ar com a lente Bertrand, observe o caminho de imagem através da câmera auxiliar.Se alguma sujeira ou bolhas de ar forem visíveis, limpe a lente e a câmara com tecido de lente livre de poeira antes de repetir o procedimento como descrito, adicionando mais óleo de imersão. Utilizando os parafusos laterais colocados no suporte do sensor de força óptica, centralize a parada de campo no campo de visão. Para precisão, abra a parada de campo quase para ocupar o campo de visão visível na câmera auxiliar.Depois de colocar a amostra no microscópio e alinhar o sensor de força óptica, use a placa de meia onda rotativa para definir a potência inicial da armadilha para 200 miliwatts se a rigidez do núcleo ou da estrutura intercelular investigada não for conhecida. Uma vez feito, use o controlador de software de estágio do microscópio para procurar uma célula com uma ou duas contas através de microscopia Brightfield transmitida. Na folha numérica, escreva o deslocamento e o tempo de cada etapa de trajetória subsequente.Alternativamente, carregue a tabela S1 do material complementar. Para um experimento de estresse/relaxamento, programe as cargas trapezoidais a serem aplicadas. No software OT, ative as armadilhas ópticas.Para capturar uma microesfera, coloque os planos de imagem ligeiramente acima da esfera com um controlador de software de estágio de microscópio. Clique no microesfera de poliestireno na janela de imagem da câmera auxiliar calibrada. O confinamento bem sucedido da conta pela armadilha óptica reduzirá fortemente o movimento da conta.Clique e arraste a pérola através do citoplasma e coloque-a a uma distância de aproximadamente dois mícrons do envelope nuclear. Certifique-se de que a trajetória seja definida para que o recuo de contas seja perpendicular à membrana nuclear. Quando a configuração estiver pronta, vá para o software de imagem e clique no botão de aquisição para iniciar a aquisição de imagens.Abra a janela de leitura de força em tempo real, clique em dados e salve na janela de leitura de força em tempo real para salvar. Inicie a posição da armadilha e force os dados de medição. Inicie a trajetória previamente carregada clicando no lado direito da conta e selecionando a trajetória inicial.Aguarde até que a trajetória esteja concluída e o sistema se estabilize antes de terminar o registro dos dados de medição da força de armadilha. Pare a aquisição de imagens e plote os resultados no software pós-processamento. Na análise representativa, uma célula-tronco progenitora de zebrafish isolada com uma única microesfera próxima ao núcleo é exibida.A distribuição da microesfera de poliestireno cinco horas após a injeção dentro de um embrião foi monitorada. Brightfield e a imagem de fluorescência mostram que as contas estão espalhadas pelo tecido do embrião. A projeção máxima da pilha Z fluorescente confocal e uma projeção máxima de uma subco pilha na mesma região confirma que uma grande fração de células profundas continha de uma a duas contas.Às 24 horas após a fertilização, as contas foram distribuídas por todo o corpo do embrião. Foram obtidos os micrografos Brightfield das células de suspensão nas células confinadas com uma ou duas contas injetadas. Além disso, vários rótulos fluorescentes facilitaram a investigação de diferentes aspectos das células, como membrana internuclear, membrana plasmática, DNA e linha transgênica.Instantâneos representativos descreveram núcleos rotulados por Hoechst cinco segundos antes/durante e cinco segundos após o recuo com uma microesfera presa opticamente. Foram estudados perfis de intensidade ao longo do segmento de recuo para três quadros e trajetórias diferentes dos limites distal e proximal do núcleo durante um experimento de recuo de células suspensas e confinadas. Trajetória e força presas experimentadas pela microesfera presa opticamente durante um repetido experimento de recuo nuclear foram medidos.A mecânica do núcleo nas celas em suspensão e sob confinamento confirmou que o confinamento resultou em uma expansão da área projetada e uma mudança insignificante na rigidez nuclear. Se as contas forem injetadas no embrião de um estágio celular, elas provavelmente distribuirão uniformemente nos estágios posteriores. Lembre-se que a conta deve estar presa.Se a conta escapar da armadilha óptica, redefina a trajetória ou aumente a potência do laser. Esses experimentos podem ser facilmente realizados em múltiplas microesferas dentro de uma célula e estendidos a medidas ativas de microrrehecologia.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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