Name: Estimulação dural e teste periorbital von Frey em camundongos como um modelo pré-clínico de dor de cabeça (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Aprenda a aplicar substâncias na dura-máter de camundongos de forma minimamente invasiva e avaliar a hipersensibilidade facial com teste von Frey periorbital. Este modelo permite estudar mecanismos de enxaqueca sem craniotomia.

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Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NS104200 e NS072204 para ODS).

Todos os procedimentos foram conduzidos com aprovação prévia do Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais na Universidade do Texas em Dallas. Foram utilizados neste estudo os camundongos ICR (CD-1) (30-35 g) e C57/BL6 (25-30 g) com idade entre 6 e 8 semanas.
1. Infusor dural
<ol><li>Crie os infundadores/injetores do mouse modificando uma cânula interna e infusora disponível comercialmente para injeções unilaterais com uma tampa de plástico de sílica fundida não metálica que seja ajustável e insira em/se estende abaixo de uma cânula guia de 28 G com diâmetro interno (CID) de 0,18 mm e um diâmetro externo (O.D.) de 0,35 mm (Figura 1A).</li>
	<li>Use uma pinça ou outro dispositivo de medição para ajustar a tampa de plástico de sílica fundida no infusor a um comprimento de 0,6 mm; medido da ponta do infusor até a borda da tampa plástica de sílica.<ol>
<li>Tome cuidado para não dobrar ou embotar o infusor ao ajustar a tampa plástica.</li>
		<li>Para outras cepas de camundongos que não tenham sido usadas anteriormente para injeções durais, determine o comprimento ideal do infusor, definindo o comprimento para 0,6 mm e conduzindo injeções piloto com tinta ou corante, ajustando o comprimento do infusor até que se observe que o corante está apenas na dura-mater e não no cérebro ou no crânio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anexar a extremidade longa (ou a extremidade que não foi medida para ser 0,6 mm) do infusor ajustado ao tubo plástico (tubo de bomba, 2 paradas, 0,19 mm de identidade, comprimento de 406 mm).<ol>
<li>Corte a tubulação para um comprimento mínimo de 8 para garantir que haja linha suficiente para segurar um volume de 5 μL.</li>
		<li>Certifique-se de que o tubo cubra a parte metálica e a parte superior da rolha de plástico localizada no infusor. Isso ajudará a evitar que as bolhas de ar se acumulem na linha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixar a outra extremidade da tubulação a uma microseria de vidro de 10 μL (gás-apertado; agulha cimentada; 21 G com projeção de 10 mm), novamente, certificando-se de ter uma vedação apertada sobre a parte metálica da seringa (Figura 1A).</li>
	<li>Uma vez que a linha esteja conectada, enchimento de fundo a seringa com 5 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), fluido intersticial sintético (SIF) ou outros veículos de escolha para evitar a formação de bolhas de ar.<ol>
<li>Se as bolhas de ar forem observadas na linha, inunde a linha com o veículo até que as bolhas se dissipem. NOTA: Pode ajudar a encher a seringa com o veículo antes de anexá-la à linha e, em seguida, empurrar o fluido através da linha uma vez conectado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois que a linha estiver recheada com 5 μL do veículo e esteja funcionando de forma eficiente, carregue 5 μL da droga/solução na seringa Hamilton (tinta ou corante pode ser usado como alternativa à droga/solução se aprender ou praticar essa técnica).<ol>
<li>Certifique-se de que todas as soluções de veículos administradas na dura são mantidas em pH 7.4 e medidas a uma osmolalidade de 310. Isso reduz a ativação potencial de canais de íons de sensor de ácido e outros canais osmosensíveis dentro da dura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O volume máximo testado em camundongos que não causaram vazamento no cérebro é de aproximadamente 10 μL. Os efeitos comportamentais após injeções com este volume não foram testados. Por esta razão, administre apenas 5 μL da solução na dura. NOTA: Estas observações são baseadas nas cepas/idades/pesos do camundongo de 6-8 semanas de idade CD1/ICR.</li>
</ol>2. Injeções dural
<ol><li>Uma vez que a seringa esteja preparada e a droga esteja carregada, posicione um rato plano em seu abdômen e anestesia-o sob breve isoflurane de 3% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5-1 L/min via nariz.<ol>
<li>Depois que o mouse não exibir mais um reflexo de pinça, ajuste a anestesia e sustente-a a um isoflurane de 1,5%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez anestesiado, aplique pomada opthalmic estéril nos olhos e raspe a cabeça do animal, em seguida, desinfete a pele com povidone-iodo e etanol. Depois disso, fique em uma posição propícia a uma injeção bem sucedida.</li>
	<li>Use uma mão para estabilizar a cabeça do animal e segure o infusor com a outra mão.</li>
	<li>Teste cuidadosamente e localize a junção das suturas sagital e lambdoidal no crânio do rato (Figura 1B, C).<ol>
<li>Para localizar esta discreta junção através da pele, use as características topográficas do crânio e teste suavemente a localização geral da junção com o infusor.</li>
		<li>Verifique a posição da junção ree posicionando o infusor ao longo do crânio e sentindo a localização exata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que a sutura esteja localizada e o infusor esteja no lugar, muito lentamente e suavemente, mova o infusor para frente e para trás até perfurar a pele e cair na junção até a rolha de plástico. NOTA: Certifique-se de inserir toda a ponta de 0,6 mm do infusor na junção.</li>
	<li>Para verificar a precisão, use tinta ou corante como solução de injeção e eutanize e decapite o mouse.<ol>
<li>Remova a tampa do crânio para visualizar o corante dentro da dura-mater (Figura 1C). NOTA: O corante não deve ser observado no cérebro ou no exterior do crânio. Da mesma forma, os camundongos em qualquer experimento devem ser verificados após a morte para verificar a precisão da injeção, bem como para garantir que a integridade do dura mater não tenha sido danificada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a injeção, remova o rato da anestesia, espere que ele recupere a consciência e depois retorne à sua gaiola ou coloque-o em uma câmara de testes para iniciar os ensaios desejados. NOTA: Deixe o rato se recuperar da anestesia por um mínimo de 30 minutos antes de fazer qualquer experimento comportamental.</li>
</ol>3. Periorbital von Frey
<ol><li>Comece o estudo com uma coorte de aproximadamente 16-20 camundongos.</li>
	<li>Um dia antes da habituação, manuseie cada rato por pelo menos 5 minutos.</li>
	<li>Aproximadamente 24 horas após o manuseio, habituar os ratos às condições da sala de testes e ao aparelho de teste von Frey (Figura 2A). NOTA: O aparelho de teste acrílico consiste em compartimentos individuais com tampas que são aproximadamente 3 em x 3,5 em x 5 em (W x H x D) e são suportados por suportes de alumínio conectados através de 0,25 em 19 G de fio de malha de aço galvanizado quadrado.<ol>
<li>Coloque os ratos dentro de um copo de papel branco de 4 oz horizontalmente colocado que é inodoro e não contém cera de polietileno ou parafina. NOTA: Esses tipos de xícaras são preferidas porque reduz a perturbação gastrointestinal nos camundongos se ingeridos (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Enquanto os animais estão em suas respectivas câmaras, coloque uma pelota da dieta normal da comida na câmara individual de cada rato para acalmar os animais e evite qualquer estresse desnecessário para os animais. Faça isso por 3 dias antes de qualquer teste de comportamento von Frey.<ol>
<li>Certifique-se de que toda vez que os ratos estiverem na câmara que há acesso a alimentos.</li>
		<li>Número e atribuir cada animal ao mesmo espaço no rack de teste. Coloque o mouse no mesmo copo todos os dias do período de teste para garantir que cada animal se aclimata ao seu ambiente de teste. NOTA: Os ratos roem as xícaras e, posteriormente, destruirão os copos. Se isso acontecer, substitua o copo e rotule-o pelo número correspondente do mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Após os 3 dias iniciais de habituação, coloque os ratos em suas câmaras individuais.<ol>
<li>Permita que os animais se aclimatar à sala de testes e câmaras por pelo menos 1 h antes de qualquer teste von Frey para permitir que os ratos se acalmem e, posteriormente, são mais fáceis de testar.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a aclimatação para a sala no dia do teste, remova um rato enquanto estiver ainda em seu copo de sua respectiva câmara.<ol>
<li>Mantenha o copo na posição horizontal para que o mouse esteja em ambas as patas dianteiras e traseiras para ajudar a manter seu peso distribuído uniformemente. NOTA: A distribuição desigual do peso pode alterar as respostas dos animais e até impedir que os animais respondam.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o copo com o mouse dentro da mesa abaixo do rack de teste na almofada absorvente.</li>
	<li>Para testes periorbitais von Frey, coloque o filamento de 0,07 g von Frey diretamente no centro do rosto e entre os olhos.</li>
	<li>Aplique pressão suficiente sobre o filamento para fazer com que o cabelo von Frey se dobre em uma formação em forma de "C".<ol>
<li>Mantenha contato com a região pelo menos 3 s, mas não mais do que 5 s ou até que o mouse retire a cabeça e deslize no filamento com a pata. NOTA: Se o filamento escorregar ou mais do que a ponta do filamento tocar o animal durante o teste, quaisquer respostas não devem ser contadas. Essas respostas podem ser em resposta ao pincel que são ativados por diferentes mecanooreceptores e, portanto, podem não refletir resultados precisos.</li>
		<li>Aplique filamentos von Frey de acordo com o método "up-down" de Dixon22,23.<ol>
<li>Inicialmente, aplique o filamento von Frey que tem um peso de 0,07 g. O filamento mais baixo possível e o filamento mais alto testado neste estudo são filamentos com pesos de 0,008 g e 0,6 g, respectivamente.</li>
			<li>Use os filamentos de peso 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g para realizar este ensaio.</li>
			<li>Neste método, se um animal não apresentar uma resposta ao filamento, aplique o filamento do próximo peso grama mais alto.</li>
			<li>Se o mouse responder a um filamento, considere o mouse responsivo a esse filamento. Se este for o caso, aplique o filamento do próximo peso inferior.</li>
			<li>Repita este padrão até que o animal seja testado 4 vezes após a resposta inicial ou o animal esteja sem resposta a quaisquer filamentos testados no ensaio. NOTA: Evite aplicar qualquer pressão adicional decorrente do braço ou pulso. Uma escala pode ser usada para praticar a aplicação do filamento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. Teste para limiares de retirada de linha de base
<ol><li>Antes da inclusão em um experimento, certifique-se de que os ratos atinjam um limite de retirada da linha de base entre 0,5-0,6 g.<ol>
<li>Um mouse atinge a linha de base se não responder a nenhum filamento testado na série mencionada na etapa 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste os ratos diariamente ao estabelecer limites de retirada da linha de base.<ol>
<li>O teste permite que os animais se aclimatam às condições de teste e à pressão dos filamentos von Frey.</li>
		<li>Se os camundongos ainda estiverem extremamente hipersensíveis após o terceiro dia de testes, tente esperar 1 ou 2 dias antes de testar novamente. NOTA: Muito tempo entre os dias de teste pode resultar na não adaptação do animal ao peso do filamento em sua região periorbital, não atingindo assim o limiar de retirada direcionado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste camundongos por aproximadamente 7 dias antes de determinar quais animais não atendem aos critérios de inclusão de um experimento. NOTA: Aproximadamente 70% dos camundongos atingirão o nível de linha de base visado.<ol>
<li>Antes da estimulação dural, analise os dados da linha de base para excluir qualquer mouse que não tenha atingido um valor de linha de base de 0,5-0,6 gramas ou superior.</li>
		<li>Após a exclusão, aloque aleatoriamente cada mouse restante em um grupo de teste. Consiga isso tirando um copo ou escrevendo um script em uma planilha para randomizar números para um grupo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análise dos resultados de von Frey
<ol><li>Uma vez obtida a série de respostas, determine o valor delta, k, o limiar de 50% e o limiar de retirada em gramas de acordo com os métodospublicados anteriormente 24.</li>
	<li>Calcule o limiar de retirada utilizando esta fórmula WT = 10 (x*F+B), onde WT= limiar de retirada, F = limiar de retirada da pata calculado através do método Chaplan, e B = regressão linear de tronco (força de dobra) = x*Número de filamento + B.</li>
	<li>Plote os dados como limite de retirada de 50% ou limite médio de retirada em gramas.</li>
</ol>

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<li>Rea, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+administered+calcitonin+gene-related+peptide+induces+spontaneous+pain+in+mice%3A+implications+for+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine.</a> Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

As alterações maladaptivas no sistema nociceptivo local na dura são consideradas um dos principais contribuintes para a fase de dor de cabeça dos ataques de enxaqueca, apesar da falta de lesão tecidual25,26. Aqui o estudo apresenta um método pelo qual a estimulação minimamente invasiva da dura dura pode induzir hipersensibilidade tátil facial. Elucidar os mecanismos e eventos envolvidos na ativação do nociceptor dural sem causar danos ao crânio e tecidos pode ref...

A dor da enxaqueca continua sendo um grande problema de saúde pública em todo o mundo. A Organização Mundial da Saúde classifica-a como a sexta doença mais prevalente no mundo, acometendo pouco menos de 15% da população da Terra1 e causando uma carga socioeconômica substancial sobre a sociedade 2,3. As opções de tratamento e sua eficácia têm sido subótimas e apenas proporcionam alívio sintomático e não modificam significativamente eventos fisiopatológicos que subjacentes à ocorrênciade enxaqueca 4,5. A falta de sucesso do tratamento deve-se provavelmente à enxaqueca ser uma doença multifatorial cuja patologia é mal compreendida, levando a um número limitado de alvos terapêuticos. A enxaqueca também é desafiadora para capturar totalmente em modelos animais, especialmente dado que o diagnóstico de enxaqueca é feito com base na comunicação verbal com pacientes que descrevem sua experiência com marcas de enxaqueca, como aura, dor de cabeça, fotofobia e aodynia. Não obstante, é importante notar que os recentes avanços nos tratamentos para enxaqueca estão atualmente superando os tratamentos para muitas condições neurológicas que foram bem validadas por modelos pré-clínicos. Por exemplo, anticorpos monoclonais e pequenas moléculas que visam o peptídeo relacionado à calcitonina, ou seu receptor têm sido muito bem sucedidos em melhorar a qualidade de vida dos portadores de enxaqueca e podem potencialmente transformar o manejo clínico da enxaqueca. Embora tenha havido avanço na compreensão desse transtorno, ainda não há muito a ser elucidado.
Com base em modelos de animais pré-clínicos e estudos humanos, é amplamente aceito que as dores de cabeça da enxaqueca são iniciadas pela ativação aberrante de fibras nociceptivas dentro das meninges que sinalizam através da gânglio dorsal trigêmeo e superior 6,7,8,9,10. Apesar dessa teoria, muitos estudos ainda utilizam a administração sistêmica de drogas para entender mecanismos subjacentes contribuintes na enxaqueca. Embora a dosagem sistêmica de drogas tenha reforçado substancialmente nosso entendimento, esses achados não avaliam diretamente se as ações locais dentro do tecido alvo de interesse desempenham um papel na enxaqueca. Por outro lado, vários estudos têm tomado uma abordagem para estimular a dura; no entanto, esses experimentos requerem implantação de cânula através de uma craniotomia invasiva erecuperação estendida vezes 11,12. Por causa dessas limitações, desenvolvemos uma abordagem minimamente invasiva para estimular localmente a dura duração onde a falta de uma craniotomia elimina a recuperação pós-cirúrgica e permite o teste imediato em animais acordados 12,13,14. Estas injeções são realizadas sob anestesia isoflurana leve e administradas na junção das suturas sagital e lambdoid em camundongos.
Várias abordagens foram desenvolvidas para avaliar respostas comportamentais nociceptivas em roedores15. A aodídia cutânea foi relatada em aproximadamente 80% dos portadores de enxaqueca16,17 e representa um ponto final translacional potencial para uso em roedores. Em modelos pré-clínicos, a aplicação de filamentos von Frey na região plantar da pata de roedor tem sido usada para avaliar comportamentos de dor em modelos de enxaqueca pré-clínico. A principal limitação dessa abordagem é que ela não testa a região cefálica. A pontuação da careta facial tem sido usada para capturar comportamentos de dor em roedores, analisando expressões faciais após a indução de estímulos de dor18,19. No entanto, suas limitações incluem apenas capturar respostas a estímulos agudos e não condições crônicas de dor orofacial. O preparo facial e a diminuição da criação também são considerados saídas de respostas comportamentais em modelos pré-clínicos de enxaqueca20,21. As limitações do primeiro incluem a dificuldade em diferenciar as respostas à dor do preparo normal da rotina e outras sensações, como coceira. No caso deste último, os comportamentos de criação normalmente diminuem rapidamente após a introdução de roedores em novos ambientes. Embora cada um desses pontos finais comportamentais seja valioso na compreensão de vários mecanismos que contribuem para as condições de dor, há uma necessidade crítica de modelos pré-clínicos de distúrbios da dor, como enxaqueca, para incluir pontos finais que capturam especificamente respostas de hiperssensibilidade cefálica. Avaliar a hipersensibilidade tátil da pele periorbital após a estimulação dura é um método que pode fornecer uma melhor visão dos mecanismos que contribuem para enxaquecas onde os sintomas sensoriais são predominantemente cefálicos na natureza. Aqui, descrevemos um método para administrar substâncias na dura do rato como um modelo pré-clínico de enxaqueca. Após a aplicação dural, também apresentamos um método detalhado para testar a hipersensibilidade tátil periorbital usando filamentos von Frey calibrados aplicados no método de up-down de Dixon.

<table><tbody><tr><td>Copos de Papel Quente de 4 oz</td><td>Choice Paper Company</td><td>5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html</td><td></td></tr><tr><td>Absorventes Underpads</td><td>Fisherbrand</td><td>14-206-65</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048</td></tr><tr><td>C313I/SPC Cânula Interna 28 G</td><td>P1 Technologies (anteriormente Plastics One)</td><td>8IC313ISPCXC</td><td>I.D. 18 mm, O.D. 35 mm</td></tr><tr><td>Gastight Modelo 1701 SN Seringas</td><td>Hamilton</td><td>80008</td><td>https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008</td></tr><tr><td>Tubulação de Bomba Ismatec, 0,19 mm</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-96460-10</td><td>Suporte https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010</td></tr><tr><td>com tela de galinha</td><td>Personalizado</td><td></td><td>As dimensões do arame de aço galvanizado são de 0,25 pol. x Rack de Teste de 19-gauge</td></tr><tr><td>com individual&nbsp; Câmaras</td><td>personalizadas</td><td></td><td>Cada câmara deve ter uma divisão entre cada mouse e tampas para conter o mouse. As câmaras também devem ser grandes o suficiente para conter um copo de papel de 4 onças.</td></tr><tr><td>von Frey Filamentos</td><td>Teste de Toque/Armazenamento</td><td>58011</td><td>https://www.stoeltingco.com/touch-test.html</td></tr></tbody></table>

estimulação dural e teste periorbital von frey em camundongos como um modelo pré-clínico de dor de cabeça

Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache

As meninges cranianas, compostas pela dura mater, aracnoide e pia mater, são pensadas para servir principalmente funções estruturais para o sistema nervoso. Por exemplo, eles protegem o cérebro do crânio e ancoram/organizam o suprimento vascular e neuronal do córtex. No entanto, as meninges também estão implicadas em distúrbios do sistema nervoso, como a enxaqueca, onde a dor experimentada durante uma enxaqueca é atribuída à inflamação estéril local e posterior ativação de aferentes nociceptivos locais. Das camadas nas meninges, a dura-mater é de particular interesse na fisiopatologia das enxaquecas. É altamente vascularizado, abriga neurônios nociceptivos locais, e abriga uma variedade diversificada de células residentes, como células imunes. Mudanças sutis no microambiente meningeal local podem levar à ativação e sensibilização dos nociceptores perivasculares durais, levando assim à dor da enxaqueca. Estudos têm procurado abordar como os aferentes durais se tornam ativados/sensibilizados usando eletrofisiologia in vivo, técnicas de imagem ou modelos comportamentais, mas estes geralmente requerem cirurgias muito invasivas. Este protocolo apresenta um método para aplicação comparativamente não invasiva de compostos na dura-idade em camundongos e um método adequado para medir a sensibilidade tátil semelhante à dor de cabeça usando testes periorbitais von Frey após a estimulação dural. Este método mantém a integridade da dura e do crânio e reduz os efeitos de confusão de técnicas invasivas ao injetar substâncias através de uma cânula modificada de 0,65 mm na junção de suturas sagicionais e lambdoides não afusadas. Este modelo pré-clínico permitirá que os pesquisadores investiguem uma ampla gama de estímulos duradouros e seu papel na progressão patológica da enxaqueca, como ativação de nociceptor, ativação de células imunes, alterações vasculares e comportamentos de dor, tudo isso mantendo condições livres de lesões no crânio e meninges.

Este método de injeção é usado para administrar estímulos na duração de camundongos para que testes comportamentais subsequentes possam ocorrer. A saída comportamental mais comum medida com este modelo é a hipersensibilidade facial cutânea avaliada via von Frey 12,13,14. Aqui mostramos como esse modelo pode ser usado para avaliar potenciais contribuições específicas do sexo para a patologia da enxaqueca (Fig...

O sintoma mais notável da enxaqueca é a dor severa na cabeça, e é supor que isso é mediado por neurônios sensoriais que inervam as meninges. Aqui, apresentamos um método para aplicar localmente substâncias à dura de forma minimamente invasiva ao usar a hipersensibilidade facial como saída.

Estimulação dural e teste periorbital von Frey em camundongos como um modelo pré-clínico de dor de cabeça

The cranial meninges, comprised of the dura mater, arachnoid, and pia mater, are thought to primarily serve structural functions for the nervous system.  ...

Quais eventos ocorrem dentro das meninges que contribuem para a dor de cabeça na ausência de lesão tecidual? Ao contrário do uso prévio de modelos de estimulação dural em ratos, permite o uso do extenso catálogo de camundongos geneticamente modificados. A luta primária seria localizar a intersecção das suturas lambdoidal e sagital, palpando o crânio com o injetor.Para começar, crie os infusores do mouse modificando uma cânula interna e infusor disponíveis comercialmente com uma tampa de plástico de sílica fundida que é ajustável e insere em uma cânula guia de 28 bitola. Use uma pinça para ajustar a tampa de plástico de sílica fundida no infusor sem dobrar o infusor. Ajuste o infusor a um comprimento de 6 milímetros medidos desde a ponta do infusor até a borda da tampa plástica de sílica.Realize injeções piloto para outras cepas do mouse e ajuste o comprimento para injetar precisamente na dura mater. Em seguida, conecte a extremidade longa do infusor ao tubo plástico de oito polegadas ou mais para conter o volume de cinco microliters. Insira o tubo, garantindo a cobertura completa da parte metálica e da parte superior da rolha plástica localizada no infusor para evitar que as bolhas de ar se acumulem na linha.Em seguida, encha a microsinga e conecte a outra extremidade da tubulação a uma microsinga de vidro de 10 microliteres, garantindo a vedação apertada sobre a parte metálica da seringa. Em seguida, enchimento da seringa com cinco microlitres de PBS ou fluido intersticial sintético ou outros veículos de escolha para evitar a formação de bolhas de ar. Se necessário, inunde a linha com o veículo para dissipar bolhas pré-formadas.Alternativamente, pré-encha a seringa e, após a conexão, empurre o fluido através da linha conectada. Uma vez que a linha cheia de veículos esteja funcionando eficientemente, carregue cinco microliters da solução na seringa Hamilton. Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado, aplique pomada oftalmica estéril nos olhos e raspe a cabeça do animal, em seguida, desinfete a pele com iodo de povidona e etanol.Estante a cabeça do animal com uma mão e segure o infusor com a seringa carregada de drogas na outra. Em seguida, usando um infusor, teste cuidadosamente, localize e verifique a junção das suturas sagital e lambdoidal no crânio do rato. Uma vez que a sutura esteja localizada e o infusor esteja no lugar, devagar e suavemente mexa o infundador para frente e para trás até que o infusor in piercee através da pele e cai para baixo na junção todo o caminho até a rolha de plástico, garantindo a inserção de toda a ponta infusora de 6 milímetros na junção.Em seguida, empurre lentamente o êmbolo da seringa para expulsar os cinco microliters de fluido para dentro da dura-mater. No dia do teste, pós-aclimatação para a sala, remova um rato junto com o copo da respectiva câmara. Mantenha o copo na posição horizontal para o peso corporal distribuído uniformemente, pois a distribuição desigual de peso pode alterar ou impedir a resposta dos animais.Coloque o copo com o mouse em uma almofada absorvente mantida na mesa abaixo do rack de teste. Então, para testes periorbitais von Frey, coloque o filamento von Frey de 07 gramas no centro do rosto entre os olhos e aplique pressão suficiente sobre o filamento para fazer com que o cabelo von Frey se curve em uma formação em forma de C. Mantenha o contato com filamentos por cerca de três a cinco segundos ou até que o mouse deslize o filamento usando a cabeça ou as patas.Para seguir o método de up-down de Dixon, aplique o próximo filamento de peso mais baixo se o mouse responder ao filamento, caso contrário, aplique filamento de peso mais alto. O procedimento foi utilizado para examinar os efeitos da prolactina dural na hipersensibilidade facial mecanicamente evocada. Os resultados do estudo demonstraram redução significativa dos limiares de abstinência facial em camundongos ICR femininos em resposta a cinco microgramas de prolactina dural.Uma dose dez vezes menor de 5 microgramas de prolactina também mostrou limiares reduzidos de abstinência facial, semelhante a uma alta dose de prolactina. As injeções de prolactina produziram comportamentos espontâneos relacionados à dor, que foram avaliados via careta. Dural 5 microgramas de prolactina causaram uma grimacing significativa em camundongos fêmeas e demonstraram ainda um papel claro para a prolactina dural em comportamentos femininos semelhantes à enxaqueca Testes comportamentais usando filamentos von Frey ou careta facial para determinar se o estímulo, na ausência de lesão, causa uma resposta à dor de cabeça.Esta técnica agora pode ser usada para investigar mecanismos de base inflamatória nas meninges sem preocupação com ressalvas causadas por craniotomias e inflamação subsequente.

dural-stimulation-periorbital-von-frey-testing-mice-as-preclinical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste estudo, os autores relatam pela primeira vez um 3D imersivo e interativo neuronavegação (3D-IIN), através do impacto de um ataque de enxaqueca dor de cabeça espontânea no sistema μ-opióides do cérebro de um paciente in vivo romance.

3D-neuronavegação<em&gt; In Vivo</em&gt; Através do cérebro de um paciente durante uma espontânea enxaquecas

Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

Roedores não são capazes de relatar sintomas de enxaqueca. Aqui, descrevemos um paradigma de teste gerenciável (ensaios de campo claro/escuro e aberto) para medir a aversão à luz, um dos sintomas mais comuns e incômodos em pacientes com enxaquecas.

Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos

O presente protocolo descreve o modelo de liberação ex vivo do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e a estratégia para quantificar o efeito de agentes farmacológicos sobre a quantidade de CGRP liberada do sistema trigeminovascular em roedores.

Ex Vivo Liberação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina do sistema trigeminovascular em roedores

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

Descrevemos um protocolo padrão para quantificação do reflexo optocinético. Combina estimulação virtual de tambor e vídeo-oculografia, permitindo assim uma avaliação precisa da seletividade característica do comportamento e sua plasticidade adaptativa.

Quantificação da Seletividade Visual do Reflexo Optocinético em Camundongos

A lesão por constrição crônica do nervo infraorbital distal em camundongos induz mudanças no comportamento espontâneo (aumento da atividade de limpeza facial) e no comportamento nocifensivo em resposta à estimulação tátil (hiperresponsividade à estimulação capilar de von Frey) que são sinais de dor contínua e alodinia e serve como modelo para a dor neuropática do trigêmeo.

Lesão por Constrição Crônica do Nervo Infraorbital Distal (DIoN-CCI) em Camundongos para Estudo da Dor Neuropática do Trigêmeo

Um procedimento cirúrgico minimamente invasivo é mostrado aqui, que envolve a colocação da sonda Doppler a laser no crânio sobre a região distal da artéria cerebral média (ACM), um local periorbital adequado para ratos e camundongos, para avaliar o fluxo sanguíneo durante a oclusão transitória da ACM.

Colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral antes da oclusão da artéria cerebral média em modelos de roedores

Este protocolo fornece um método para rastrear o estrabismo ocular automatizado em roedores ao longo do tempo de maneira compatível com o bloqueio de tempo para medidas neurofisiológicas. Espera-se que este protocolo seja útil para pesquisadores que estudam mecanismos de distúrbios dolorosos, como a enxaqueca.

Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

Neste artigo, vamos examinar a metodologia e considerações relevantes para a combinação de TMS e fMRI para examinar os efeitos de estimulação cerebral na rede padrão.

Combinando Estimulação Magnética Transcraniana e fMRI para o Exame da rede de modo padrão

Aprenda a aplicar substâncias na dura-máter de camundongos de forma minimamente invasiva e avaliar a hipersensibilidade facial com teste von Frey periorbital. Este modelo permite estudar mecanismos de enxaqueca sem craniotomia.

Estimulação dural e teste periorbital von Frey em camundongos como um modelo pré-clínico de dor de cabeça

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