Name: Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprenda a montagem híbrida de genoma de novo para bactérias urinárias usando sequenciamento de leitura curta e longa. Este método gera genomas circulares completos para estudar colonização e resistência antimicrobiana.

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Agradecemos ao Dr. Moutusee Jubaida Islam e ao Dr. Luke Joyce por suas contribuições para este protocolo. Também gostaríamos de reconhecer a Universidade do Texas no Centro de Genoma de Dallas por seu feedback e apoio. Este trabalho foi financiado pela Fundação Welch, número do prêmio AT-2030-2020401 para n.J.D., pelos Institutos Nacionais de Saúde, prêmio número R01AI11610 para K.P., e pela Felecia e John Cain Chair in Women's Health, realizada pela P.E.Z.

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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo abrangente de montagem de genomas híbridos descrito aqui oferece uma abordagem simplificada para a cultura bem sucedida de diversas microbiota urinária e uropatógenos, e a montagem completa de seus genomas. O sucesso do WGS de genomas bacterianos começa com o isolamento de micróbios diversos e às vezes exigentes, a fim de extrair seu DNA genômico. Até o momento, os protocolos de cultura urinária existentes ou não têm a sensibilidade necessária para detectar muitas espécies urinárias ou envolvem abordagens longas e extensas que requerem tempo e recursos prolongados11. A abordagem modificativa da cultura da urina aprimorada descrita oferece um protocolo simplificado, mas abrangente, para o isolamento bem-sucedido de bactérias pertencentes a 17 gêneros urinários comuns, incluindo espécies commensais potencialmente patogênicas ou benéficas, e bactérias aeróbicas ou aeróbicas facultativas e obrigatórias. Isso, por sua vez, fornece o material inicial necessário para sequenciamento preciso e montagem de genomas bacterianos e para experimentos fenotípicos críticos, que contribuem para a compreensão da saúde urinária e da doença. Além disso, essa abordagem cultural modificada prevê um diagnóstico clínico mais definido de microrganismos viáveis encontrados em amostras de urina e permite seu biobanco para futuros estudos genômicos. No entanto, este protocolo não é sem limitações. Pode exigir longos tempos de incubação, dependendo do organismo, bem como do uso de recursos como uma câmara de hipóxia ou incubadoras controladas que podem não estar prontamente disponíveis. O uso de GasPaks anaeróbicos oferece uma solução alternativa, mas estes são caros e nem sempre produzem um ambiente sustentado e controlado. Finalmente, o viés cultural, bem como a diversidade de amostras podem permitir que organismos particulares e uropatógenos superem as bactérias exigentes. Apesar dessas limitações, uma cultura de diversas bactérias urinárias é possível por essa abordagem.
O sequenciamento genômico ganhou popularidade com o avanço das tecnologias de Sequenciamento de Próxima Geração, que aumentaram tremendamente o rendimento e a precisão dos dados de sequenciamento14,15. Juntamente com o desenvolvimento de algoritmos para processamento de dados e montagem de novo, sequências completas de genomas estão na ponta dos dedos de cientistas novatos e especialistasapenas 15,45. O conhecimento da organização geral do genoma fornecida por genomas completos oferece importantes insights evolutivos e biológicos, incluindo duplicação genética, perda genética e transferência horizontal de genes14. Além disso, genes importantes para a resistência antimicrobiana e virulência são frequentemente localizados em elementos móveis, que normalmente não são resolvidos nos conjuntos degenomas 15,16.
O protocolo aqui segue uma abordagem híbrida para a combinação de dados de sequenciamento de plataformas de leitura curta e longa leitura para gerar conjuntos completos de genomas. Embora focado em genomas bacterianos urinários, este procedimento pode ser adaptado a diversas bactérias de várias fontes de isolamento. As etapas críticas nesta abordagem incluem seguir a técnica estéril adequada e utilizar condições adequadas de mídia e cultura para o isolamento de bactérias urinárias puras. Além disso, a extração de gDNA intacto e de alto rendimento é essencial para gerar dados de sequenciamento livres de leituras contaminantes que podem dificultar o sucesso da montagem. Os protocolos subsequentes de preparação da biblioteca são fundamentais para a geração de leituras de qualidade de comprimento e profundidade suficientes. Portanto, é de total importância lidar com gDNA com cuidado durante a preparação da biblioteca para sequenciamento de leitura longa em particular, já que o maior benefício desta tecnologia é a geração de leituras longas sem limite teórico de comprimento superior. Também estão delineadas seções para o controle de qualidade apropriado (QC) de leituras de sequenciamento que eliminam dados barulhentos e melhoram o resultado da montagem.
Apesar do sucesso do isolamento do DNA, da preparação da biblioteca e do sequenciamento, a natureza da arquitetura genômica de algumas espécies ainda pode fornecer um obstáculo para a geração de um conjunto de genomasfechados 45,46. Sequências repetitivas muitas vezes complicam a computação de montagem e, apesar dos dados de leitura longa, essas regiões podem ser resolvidas com baixa confiança, ou não. As leituras longas, portanto, devem ser, em média, mais longas do que a maior região de repetição do genoma ou a cobertura deve ser alta (>100x)19. Alguns genomas podem permanecer incompletos e requerem abordagens manuais para conclusão. No entanto, genomas incompletos montados em híbridos são tipicamente compostos de menos contigs do que genomas de rascunho de leitura curta. Ajustar os parâmetros padrão do algoritmo de montagem ou seguir cortes mais rigorosos para ler QC pode ajudar. Alternativamente, uma abordagem sugerida é mapear leituras longas para as regiões incompletas em busca de evidências para o caminho de montagem mais provável e, em seguida, confirmar o caminho utilizando pcr e sequenciamento Sanger da região amplificada. O mapeamento de leituras usando o Minimap2 é sugerido e o Bandge oferece uma ferramenta útil para a visualização de leituras mapeadas ao longo de contigas montadas fornecendo evidências para a ligação de contig47.
Um desafio adicional para gerar genomas completos está na familiaridade e conforto com ferramentas de linha de comando. Muitas ferramentas bioinformáticas são desenvolvidas para oferecer oportunidades computacionais a qualquer usuário; no entanto, sua utilização depende de um entendimento com o básico da UNIX e programação. Este protocolo visa fornecer instruções suficientemente detalhadas para permitir que indivíduos sem experiência prévia de linha de comando gerem conjuntos de genomas fechados e as anotem.

O microbioma urinário é uma área emergente de pesquisa que destruiu um equívoco de décadas de que o trato urinário é estéril em indivíduos saudáveis. Os membros da microbiota urinária podem servir para equilibrar o ambiente urinário e prevenir a infecção do trato urinário (ITU)1,2. Bactérias uropatômicas invadem o trato urinário e empregam diversos mecanismos de virulência para deslocar a microbiota residente, colonizar o urotélio, evitar respostas imunológicas e neutralizar pressões ambientais3,4. A urina é um meio relativamente limitado por nutrientes caracterizado por alta osmolaridade, disponibilidade limitada de nitrogênio e carboidratos, baixa oxigenação e baixo pH5,6,7. A urina também é considerada antimicrobiana, composta de altas concentrações de ureia inibitória e peptídeos antimicrobianos, como o cathelicidina humano LL-378. Investigar mecanismos empregados tanto por bactérias residentes quanto por uropatógenos para colonizar o trato urinário é fundamental para entender melhor a saúde do trato urinário e desenvolver novas estratégias para o tratamento da ITU. Além disso, à medida que a falha das terapias antimicrobianas de linha de frente se torna mais comum, é cada vez mais importante monitorar a disseminação de elementos genéticos móveis que carregam determinantes de resistência antimicrobiana dentro de populações de bactérias urinárias9,10.
Para investigar genótipos e fenótipos de bactérias urinárias, sua cultura bem sucedida e sequenciamento de genomas inteiros subsequentes (WGS) é imperativo. Métodos dependentes da cultura são necessários para detectar e identificar micróbios viáveis em amostras de urina11. A cultura clínica de urina padrão envolve a criação de urina em 5% de ágar de sangue de ovelha (BAP) e ágar MacConkey e incubação aerobicamente a 35 °C por 24 h12. No entanto, com um limiar de detecção de≥10 5 CFU/mL13, muitos membros da microbiota urinária não são relatados por este método. Técnicas aprimoradas de cultivo, como a Cultura Quantitativa Aprimorada da Urina (EQUC)11 empregam várias combinações de diferentes volumes de urina, tempos de incubação, mídia cultural e condições atmosféricas para identificar micróbios comumente perdidos pela cultura de urina padrão. Descrito neste protocolo é uma versão modificada do EQUC, denominada aqui protocolo Modified Enhanced Urine Culture, que permite a cultivo de diversas bactérias urinárias e uropatógenos usando mídia seletiva e condições atmosféricas ideais, mas não é inerentemente quantitativo. O isolamento bem sucedido das bactérias urinárias permite a extração de DNA genômico (gDNA) para WGS a jusante e montagem de genoma.
Montagens de genomas, conjuntos completos em particular, permitem a descoberta de fatores genéticos que podem contribuir para a colonização, manutenção de nicho e virulência entre as microbiotas residentes e as bactérias uropatogênicas. Os conjuntos de genomas de rascunho contêm um número diversificado de sequências conguosas (contigs) que podem conter erros de sequenciamento e falta de informações de orientação. Em um conjunto completo do genoma, tanto a orientação quanto a precisão de cada par de base foram verificadas14. Além disso, a obtenção de sequências completas de genomas fornece uma visão da estrutura do genoma, da diversidade genética e dos elementos genéticosmóveis 15. Leituras curtas por si só podem identificar a presença ou ausência de genes importantes, mas podem não identificar seu contexto genômico16. Com a habilitação de tecnologias de sequenciamento de leitura longa, como Oxford Nanopore e PacBio, gerar conjuntos fechados de novos genomas bacterianos não requer mais métodos extenuantes, como o fechamento manual de novos conjuntos pelo multiplex PCR17,18. A combinação de tecnologias de sequenciamento de leitura curta da Próxima Geração e nanopore de sequenciamento de longa leitura permite a geração fácil de conjuntos precisos, completos e fechados de genoma bacteriano a custos relativamente baixos19. Sequenciamento de leitura curta produz conjuntos precisos e fragmentados de genoma geralmente consistindo de uma média de 40-100 contigs, enquanto o sequenciamento de nanoporo gera leituras longas de cerca de 5-100 kb de comprimento que são menos precisas, mas podem servir como andaimes para se juntar a contigs e resolver a sintensia genômica. Abordagens híbridas utilizando tecnologias de leitura curta e longa podem produzir genomas bacterianos precisos e completos19.
Descrito aqui é um protocolo abrangente para o isolamento e identificação de bactérias da urina humana, extração genômica de DNA, sequenciamento e montagem completa do genoma usando uma abordagem híbrida de montagem. Este protocolo fornece uma ênfase especial nas etapas necessárias para modificar adequadamente as leituras geradas pelo sequenciamento de leitura curta e longa leitura para a montagem precisa de um cromossomo bacteriano fechado e elementos extracromosomais, como plasmídeos.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G29398A</td><td>Centrífuga opcional, mas recomendada</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>Qualquer centrífuga para tubos cônicos e microcentrífugos giratórios (por exemplo, Modelos 5810R/5424R)</td></tr><tr><td>Eletroforese</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging System</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td>ChemiDoc modelos</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>Qualquer CO2 Incubadora (por exemplo, Thermo Forma modelo 3110)</td></tr><tr><td>Rack magnético</td><td>New England BioLabs</td><td>S15095</td><td>Rack de 12 tubos</td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--Nanodrop</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>PróximoSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>Outros modelos Illumina são aceitáveis</td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>BioTek</td> <td>-</td> <td>Fluorômetro Synergy H1</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>Scientific H2024</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler ThermoFisher</td><td>Scientific</td> <td>-</td> <td>Qualquer termociclador para PCR reações (por exemplo, sistema de PCR ProFlex)</td></tr> <tr><td>< forte > materiais: < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>solução salina tamponada com fosfato 10X (PBS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE</td> <td>tampão --</td><td>--</td> <td>1M Tris, 1M ácido bórico, 0,2M EDTA (pH 8,0)</td></tr> <tr><td>1429R primer</td><td>Sigma Aldrich (oligos personalizados)</td> <td>-</td> <td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td></tr><tr><td>1kb Ladder</td><td>VWR</td><td>101228-494</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-Cl (pH 7,5)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>6x Corante de carregamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0783588</td><td></td></tr><tr><td>8F primer</td><td>Sigma Aldrich (oligos personalizados)</td> <td>-</td> <td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td></tr><tr><td></td><td>Agar Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad Laboratories</td><td>63001</td><td></td></tr><tr>Sistema de Bolsa Anaeróbia <td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>- GasPak EZ</td><td>BD Sistemas de Diagnóstico</td><td>B260683</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Infusão de Coração para Cérebro</td><td></td><td>BD Sistemas de Diagnóstico 212304</td><td></td></tr><tr><td>CDC Anaeróbio 5% Ágar Sangue de Ovelha</td><td>BD</td><td>Sistemas de Diagnóstico L007357</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de diagnóstico</td><td>PA-257481.04</td><td></td>DNeasy da <td>orientação do BD de CHROMagar</td></tr><tr><td>Sangue & Tecido</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tiras Indicadoras Anaeróbicas Secas</td><td>BD Sistemas de Diagnóstico</td><td>271051</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Prova</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Para Biologia</td></tr><tr><td>Molecular Brometo de</td> <td>EtídioKit</td> de preparação de células de fluxo <td>BP130210</td><td></td>ThermoFisher Scientific</tr><tr><td></td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de lavagem de células de fluxo</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH003</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep de extração de gel</td><td>BioBasic</td><td>BS654</td><td></td></tr><tr><td>Kit de sequenciamento de ligação</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Research Products International Corp</td><td>L381005.05</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Expansão de código de barras nativo 1-12</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-NBD104</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0367L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M6630L</td><td></td></tr><tr><td>NEBTempo tampão de ligação rápida</td><td>New England BioLabs</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Módulo de reparo final / cauda de dA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Índices de CD de DNA Nextera</td><td>Illumina</td><td>20018708</td><td></td></tr><tr><td>Preparação da biblioteca Nextera DNA Flex - (M) Tagmentação</td><td>Illumina</td><td>20018705</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Kit</td><td>de Ensaio ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Tubos de Ensaio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>E6056L</td><td></td></tr><tr><td>R9 Célula de fluxo</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Laboratórios de Hemostat</td> <td>de Sangue de Ovelha</td><td>DS13250</td><td></td></tr><tr><td>tampão TE</td> <td>--</td><td>--</td> <td>10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8,0)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja triptica</td><td>BD Sistemas de diagnóstico</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Software & Ferramentas de bioinformática: </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bandagem</td> <td>--</td><td>--</td> <td>https://rrwick.github.io/Bandage/</td></tr> <tr><td>Centro de Epidemiologia Genômica</td> <td>--</td><td>--</td> <td>http://www.genomicepidemiology.org/</td></tr> <tr><td>Bancada de Trabalho de Genômica CLC 12</td><td>QIAGEN</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>CRISPRcasFinder</td> <td>--</td><td>--</td> <td>https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td></tr><tr><td>FastQC</td> <td>--</td><td>--</td> <td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td></tr> <tr><td>Geneious Prime</td><td>Geneious</td> <td>--</td><td></td></tr><tr><td>gVolante (BUSCO)</td> <td>--</td><td>--</td> <td>https://gvolante.riken.jp/</td></tr> <tr><td>Kbase Prokka Wrapper</td> <td>--</td><td>--</td> <td>https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td></tr><tr><td>Minimap2</td> <td>--</td><td>-- </td><td>https://github.com/lh3/minimap2</td></tr><tr><td>MinKNOW</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>NanoFilt</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/wdecoster/nanofilt</td></tr><tr><td>NanoStat</td><td>--</td><td>--https://github.com/wdecoster/nanostat</td><td></td></tr> <tr><td>PHASTER</td><td>-</td><td>---https://phaster.ca/</td><td></td></tr> <tr><td>Prokka</td><td>----</td><td></td><td>https://github.com/tseemann/prokka</td></tr><tr><td>QUAST</td><td>--</td><td>-</td><td>-http://quast.sourceforge.net/quast</td></tr><tr><td>Trim Galore</td><td>--</td><td>--</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td>--</td><td>--http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td></tr> <tr><td>Unicycler</td><td>----</td><td></td><td>https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length</td></tr></tbody></table>

montagem híbrida de genoma de novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Sequências completas de genomas fornecem dados valiosos para a compreensão da diversidade genética e fatores de colonização únicos de micróbios urinários. Esses dados podem incluir elementos genéticos móveis, como plasmídeos e fágio extracromosomal, que contribuem para a disseminação da resistência antimicrobiana e complicam ainda mais o tratamento da infecção do trato urinário (ITU). Além de fornecer uma boa resolução da estrutura do genoma, genomas completos e fechados permitem a genômica comparativa detalhada e análises evolutivas. A geração de genomas completos de novo tem sido uma tarefa desafiadora devido às limitações da tecnologia de sequenciamento disponível. O Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) de ponta emparelhada produz leituras curtas de alta qualidade, muitas vezes resultando em conjuntos precisos, mas fragmentados de genomas. Pelo contrário, o sequenciamento de Nanopore fornece leituras longas de menor qualidade normalmente levando a conjuntos completos propensos a erros. Tais erros podem dificultar estudos de associação em todo o genoma ou fornecer resultados enganosos de análise de variantes. Portanto, abordagens híbridas que combinam leituras curtas e longas surgiram como métodos confiáveis para alcançar genomas bacterianos fechados altamente precisos. Relatado aqui é um método abrangente para a cultura de diversas bactérias urinárias, identificação de espécies por sequenciamento genético 16S rRNA, extração de DNA genômico (gDNA), e geração de leituras curtas e longas por plataformas NGS e Nanopore, respectivamente. Além disso, este método descreve um pipeline bioinforático de algoritmos de controle de qualidade, montagem e previsão genética para a geração de sequências completas de genoma anotadas. A combinação de ferramentas bioinformáticas permite a seleção de dados de leitura de alta qualidade para montagem de genoma híbrido e análise a jusante. A abordagem simplificada para o conjunto híbrido de novo genoma descrito neste protocolo pode ser adaptada para uso em qualquer bactéria cultural.

Este protocolo foi otimizado para a cultura e sequenciamento de bactérias urinárias pertencentes aos gêneros listados na Figura 1. Nem todas as bactérias urinárias são culturais por este método. Os meios de cultura e as condições são especificados pelo gênero na Figura 1. Avaliações exemplares de eletroforese de gel da integridade gDNA são retratadas na Figura 2. Uma visão geral do pipeline bioinforático para sequenciamento de leitura, montagem de genoma e anotação é descrita na Figura 3. Um guia para a estrutura do diretório computacional é fornecido na Figura 4 para simplificar a compreensão do protocolo e fornecer estrutura para uma organização bem-sucedida. Além disso, estão incluídos genomas completos representativos de dois Klebsiella spp., K. pneumoniae e K. oxytoca,que foram gerados por este protocolo. Uma representação dessas assembleias é fornecida na Figura 5 e também inclui um exemplo adicional incompleto do genoma K. pneumoniae. Uma visão geral detalhada de cada genoma completo totalmente anotado é mostrada na Figura 6. Finalmente, um resumo das estatísticas de leitura de sequenciamento é fornecido na Tabela 1 para oferecer uma ampla compreensão dos dados brutos e aparados suficientes para a geração de conjuntos de genomas fechados de alta qualidade. Além disso, os principais parâmetros dos dois representantes completam Klebsiella spp. genomas estão listados. Genomas e dados brutos foram depositados no Genbank sob o BioProject PRJNA683049.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg"> Figura 1: Cultura de urina modificada de diversos gêneros urinários. Gráfico para o ágar e caldo líquido que podem ser usados para cultivar diversos gêneros urinários. Toda a cultura é sugerida para ser realizada a 35 °C como descrito na subseção 1.1. Os círculos representam mídias apropriadas para a cultura de um determinado gênero, as cores foram arbitrariamente selecionadas para distinguir um tipo de mídia do outro. CDC-AN BAP (vermelho), Ágar de Sangue de Ovelhas CDC Anaerobe; 5% Ovino-BAP (laranja), Ágar de Sangue de Ovelha; BHI (verde), Infusão do Coração Cerebral; TSB (amarelo), Caldo de Soja Tptic; Orientação CHROMagar (azul). aGardnerella vaginalis deve ser cultivada em HBT Bilayer G. vaginalis Ágar seletivo em atmosfera microaerofílica e sob requisitos especiais de cultura de caldo44. bLactobacillus iners deve ser cultivado em placas de 5% Rabbit-BAP e caldo NYCIII em atmosfera microaerofílica. cLactobacillus spp. pode ser cultivada em MRS em condições microaerófilas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg"> Figura 2: Extração genômica de DNA agarose imagens em gel. Imagens de gel representativas que retratam os resultados da extração do GDNA. (A) Pista 1: 1 kb escada, Faixa 2: gDNA intacta representando extração bem sucedida, Faixa 3: mancha indicando gDNA fragmentada. (B) Pista 1: 1 kb escada, Lanes 2 &amp; 3: contaminação rRNA denotada por duas bandas entre 1,5 kb e 3 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg"> Figura 3: Fluxo de trabalho de montagem de genoma híbrido. Esquema de passos desde o controle de qualidade de leitura e pré-processamento até a anotação de montagem. A leitura de aparamento remove leituras ambíguas e de baixa qualidade. Os parâmetros de escore q e comprimento são indicados e representam as leituras que são retidas. A montagem utiliza leituras curtas e longas para gerar um conjunto híbrido de genoma de novo. A qualidade da montagem é avaliada com base na completude e correção utilizando ferramentas e parâmetros especificados. O conjunto final do genoma é anotado para todos os genes e loci específico de interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg"> Figura 4: Guia de estrutura dediretório de bioinformática. Um esquema de organização recomendada de diretórios e arquivos para o processamento de leituras curtas e longas, montagem híbrida e anotação de genoma e QC. As principais etapas de processamento de dados da linha de comando são destacadas ao lado de arquivos e diretórios correspondentes. Obtenção de comandos e bandeiras (em negrito), arquivos de entrada (azul), arquivos de saída ou diretórios (vermelho), entrada do usuário, como convenção de nomeação de arquivos (magenta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg"> Figura 5: Gráficos de montagem do genoma por Bandge. Gráficos de montagem completa do genoma representativo de (A) Klebsiella oxytoca KoPF10 e (B) Klebsiella pneumoniae KpPF25 e conjunto de genoma incompleto de (C) Klebsiella pneumoniae KpPF46. O genoma completo de KoPF10 demonstra um único cromossomo fechado e o genoma completo de KpPF25 consiste em um cromossomo fechado e cinco plasmídeos fechados. O cromossomo incompleto de KpPF46 consiste em dois contigs interligados. O conjunto uniciclista híbrido de novo gera um gráfico de montagem que é visualizado pela Bandage. O gráfico de montagem fornece um esquema simplista do genoma, indicando cromossomo fechado ou plasmídeos por um linker conectando duas extremidades de um único contig. A presença de mais de um contig interconectado indica montagem incompleta. O tamanho e a profundidade do Contig também podem ser notados no Curativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg"> Figura 6: Mapas completos do genoma de conjuntos híbridos anotados. Mapas de montagem gerados por Geneious Prime para o genoma completo de (A) K. oxytoca KoPF10 e (B) K. pneumoniae KpPF25 mostrando genes anotados denotados por setas coloridas ao longo de espinhas plasmidas. Cromossomos só mostram genes de rRNA e tRNA para simplicidade. As anotações do genoma foram realizadas utilizando Prokka, conforme indicado na seção 10 deste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg"> Tabela 1: Representante Klebsiella spp. características completas de montagem. Parâmetros de montagem da cepa de K. oxytoca KoPF10 e K. pneumoniae strain KpPF25. Os números de adesão para os dados depositados no NCBI são fornecidos. O número de leituras antes e depois do corte são especificados para ambas as tecnologias de sequenciamento. N50 é fornecido para leituras longas apenas uma vez que as leituras curtas são de um comprimento controlado. Plasmid replicon previu usando o banco de dados PlasmidFinder v2.1 Enteroebacteriaceae com parâmetros definidos para 80% de identidade e 60% de comprimento. um tipo de sequência MLST, Multilocus. b CDS, Sequências de codificação. c Plasmid replicon previu usando o banco de dados PlasmidFinder v2.1 Enterobacteriaceae com parâmetros definidos para 80% de identidade e 60% de comprimento. d Oxford Nanopore Technologies (ONT) depositou dados de leitura. e Illumina depositou dados de leitura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Este protocolo detalha uma abordagem abrangente para a montagem de um genoma híbrido de bactérias urinárias. Fornece um procedimento reprodutível para a geração de sequências completas de genomas circulares úteis no estudo de elementos genéticos cromossômicos e extracromosômicos que contribuem para a colonização urinária, patogênese e disseminação de resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Este protocolo abrangente instrui como gerar genomas próximos de diversas bactérias urinárias e permite que os leitores sem experiência de codificação implementem com sucesso os dutos de montagem e análise de genomas baseados em terminais. Conjuntos completos de genomas permitem a descoberta de genes que contribuem para a colonização e virulência entre bactérias commensais e uropatogênicas. Genomas próximos fornecem informações sobre a arquitetura do genoma e elementos genéticos móveis.O método de montagem do genoma híbrido pode ser aplicado a qualquer bactéria culturalmente isolada de outros locais anatômicos ou nichos ambientais para fornecer insights semelhantes sobre o conteúdo e a arquitetura do genoma. Siga o protocolo e o guia do fabricante para preparar uma piscina de DNA de dois fios e proceda à limpeza adicionando 2,5 vezes o volume de contas paramagnéticas à piscina de DNA e, em seguida, suavemente movendo o tubo para misturar o conteúdo. Gire brevemente a amostra a 2.000 vezes G e coloque a amostra em um rotador por cinco minutos à temperatura ambiente, em seguida, pique as contas no ímã.Em seguida, lave a pelota duas vezes com 250 microlitadores de 70% de etanol recém-preparado em água sem nuclease sem perturbar a pelota. Deixe o tubo no ímã durante as lavagens. Aspirar etanol após cada lavagem, em seguida, rapidamente girar a amostra a 2.000 vezes G antes de devolvê-lo ao ímã.Pipeta fora etanol residual e deixe a pelota secar por 30 segundos. Uma vez seco, resuspenque a pelota em 60 a 70 microlitadores de água sem nuclease e incubar a amostra em temperatura ambiente por dois minutos, em seguida, pelota a amostra no ímã até que o elto esteja claro. Transfira o elto para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro limpo.Quantifique a piscina de DNA concentrada de dois fios usando um fluorômetro, em seguida, prepare uma alíquota de 700 nanogramas da amostra em 65 microliter volume final para prosseguir para a etapa de ligadura adaptadora e manter o restante da piscina em quatro graus Celsius para uma segunda corrida após a primeira corrida terminar. Continue com a ligadura do adaptador de acordo com as instruções do fabricante. Para prosseguir com o sequenciamento, misture os buffers de escoramento e prime a célula de fluxo.Prepare a solução da biblioteca de DNA e carregue a amostra em gota para a porta de carregamento. Inicie a corrida de sequenciamento. Abra o software operacional para sequenciar e clique no botão iniciar e, em seguida, insira um nome para o experimento.Vá continuar a escolher o kit de preparação da biblioteca apropriado e o pacote de expansão de código de barras usado e, em seguida, clique em continuar a executar opções. Se planeja preparar uma biblioteca suficiente para uma segunda corrida, ajuste o comprimento de execução de 72 horas a 48 horas padrão e pressione continue a fazer a chamada base. Verifique a opção de chamada base em configuração rápida de base.Defina a codificação de barras para habilitar para que a saída FASTQ seja aparada das sequências de código de barras e des multiplexada em diretórios separados com base em código de barras. Clique em continuar a sair. Em seguida, escolha onde salvar dados de sequenciamento de saída.Espere aproximadamente 30 a 50 gigabytes de dados se apenas salvar a saída FASTQ e mais de 500 gigabytes de dados se salvar a saída FAST5. Se o planejamento de prosseguir com a filtragem manual após o sequenciamento, desmarque a opção de filtragem Qscore sete no comprimento de leitura sem filtro. Caso contrário, deixe a opção verificada.Vá continuar a executar a guia de configuração para revisar todas as configurações. Se as configurações estiverem corretas, clique no botão iniciar. Em caso de dúvida, clique em volta para fazer os ajustes necessários.No diretório de leituras longas, crie novos diretórios para cada código de barras usado na corrida. Copie todos os arquivos fastq que correspondem a cada código de barras na pasta apropriada. Combine todos os arquivos fastq para cada código de barras de cada execução.Uma vez que os arquivos são combinados, abra o terminal e navegue até os diretórios de código de barras dentro do diretório de leituras longas usando o comando cd. Para concatenar todos os arquivos fastq por código de barras em um único arquivo fastq, execute o comando e repita o procedimento para cada código de barras. Use o NanoStat para avaliar a qualidade de leitura da amostra executando o comando e, em seguida, registos, copiando a saída em um texto ou arquivo do Word para referência futura.Depois que os resultados forem salvos, use NanoFilt para filtrar leituras minion, descartando leituras com Q inferior a sete e comprimento inferior a 200 executando o comando. No arquivo aparado gerado, execute o NanoStat com o comando. Registre os resultados copiando a saída em um arquivo de texto ou Word e compare com os resultados anteriores para garantir que a filtragem tenha sido bem sucedida.Repita as etapas de cada código de barras usado na execução de sequenciamento. Para gerar montagem de genoma híbrido, organize os arquivos de leitura curta e arquivos de leitura longa em um único diretório chamado trimmed_reads. Assim, o diretório contém um fastq gerado anteriormente.gz arquivo para leituras longas aparadas e dois fastq. gz arquivos como R1 e R2 para leituras curtas aparadas. Navegue até o diretório trimmed_reads que armazena os arquivos de leitura usando o comando cd no terminal.Uma vez no diretório correto, feche os dois arquivos de leitura curta para armazenar no fastq. formato gz executando o comando. Repita o passo tanto para R1 quanto para R2. Certifique-se de que todos os arquivos de leitura estão no fastq.formato gz e verifique se todos os arquivos correspondem ao mesmo isolado. Inicie o conjunto híbrido usando o Unicycler executando o comando. Quando a corrida estiver concluída, revise o monociclador.arquivo de registro para garantir que não haja erros. Regisso número, tamanho e status completo ou incompleto do contexto gerado. Se contextos incompletos forem identificados no registro Unicycler, reloja o Unicycler no modo em negrito adicionando o sinalizador ao comando.Abra o Curativo e clique no arquivo, em seguida, escolha o gráfico de carga e selecione o conjunto. arquivo gfa que foi salvo anteriormente para o unicycler_output_directory gerado pelo Unicycler. Uma vez que o arquivo esteja carregado, clique no botão de gráfico de desenho na barra de ferramentas à esquerda e avalie se o conjunto está completo examinando como os contigs estão conectados e organizados.Navegue dentro do terminal até a pasta que armazena a saída Docicr usando o comando cd. Em seguida, execute o protocolo quast executando o comando. Revise os relatórios gerados pelo quast no diretório de saída quast_output_directory.Navegue dentro do terminal até a pasta que armazena a saída do Unicycler usando o comando cd e execute prokka executando o comando. Revise as anotações abrindo a tabela tsv e carregando o arquivo gff gerado no software de análise de sequência. Visualize e analise as anotações no software.Nas imagens representativas do gel, são retratados resultados genômicos de DNA ou extração de gDNA. Pode-se observar a extração e separação bem-sucedida de gDNA intacta. Extração mal sucedida mostrando contaminação fragmentada de GDNA e RNA também são retratadas.Os gráficos de montagem do genoma das bactérias foram gerados pelo Conjunto Híbrido de Novo Unicycler e visualizados pela Bandge. O genoma completo de Klebsiella oxytoca KoPF10 demonstrou um único cromossomo fechado e o genoma completo de Klebsiella pneumoniae KpPF25 consistia de um cromossomo fechado e cinco plasmídeos fechados. O cromossomo incompleto de Klebsiella pneumoniae KpPF46 consistia de dois contigs interconectados.Os mapas de montagem gerados por Geneious Prime para o genoma completo de Klebsiella oxytoca KoPF10 e Klebsiella pneumoniae KpPF25 mostrando genes anotados denotados por setas coloridas ao longo de espinhas plasmidas. Para garantir que o carregamento da célula de fluxo seja bem sucedido, filtrar leituras longas usando as configurações recomendadas e garantir que todos os arquivos estejam no fastq. formato gz.Execute o comando Unicycler correto usando arquivos pertencentes à mesma amostra.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Contaminação durante o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos continua a ser um grande problema. Aqui, nós mostramos um método para sequenciar o genoma de um Tardigrada de um único espécime com tão pouco quanto 50 pg de DNA genômico sem amplificação do genoma inteiro para minimizar o risco de contaminação.

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

O propósito do presente protocolo é usar uma combinação de computacional e pesquisa do banco para encontrar romance sequências que não podem ser separadas facilmente uma sequência co purificante, que pode ser apenas parcialmente conhecida.

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Long-leitura sequências facilitam grandemente a montagem de genomas complexas e caracterização da variação estrutural. Nós descrevemos um método para gerar as sequências ultra-longa pelas plataformas de sequenciamento baseado em nanopore. A abordagem adota uma extração de DNA otimizada seguida de preparações de biblioteca modificada para gerar centenas de mil leituras com cobertura moderada de células humanas.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

Nós validamos anteriormente um protocolo para sequenciamento do vírus Usutu (USUV) baseado em amplicon em uma plataforma de sequenciamento de nanoporos. Aqui, descrevemos os métodos usados com mais detalhes e determinamos a taxa de erro da célula de fluxo Nanopore R10.

Validando o sequenciamento de nanoporos de genoma inteiro, usando o vírus Usutu como exemplo

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Este protocolo foi otimizado para sequenciamento profundo direcionado de 18 regiões de resistência a medicamentos em Mycobacterium tuberculosis usando uma plataforma de sequenciamento de leitura longa, seguida de análise com um pipeline de bioinformática específico para tuberculose projetado para dados de leitura longa.

Sequenciamento de Amplicon usando as tecnologias de sequenciamento de leitura longa

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir o sequenciamento do genoma completo de infecções bacterianas sexualmente transmissíveis a partir de amostras clínicas usando enriquecimento alvo. Este novo método baseado em painel sindrômico supera os desafios de DNA humano abundante e baixas cargas bacterianas, facilitando a vigilância genômica para Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium.

Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Aprenda a montagem híbrida de genoma de novo para bactérias urinárias usando sequenciamento de leitura curta e longa. Este método gera genomas circulares completos para estudar colonização e resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa (Vídeo) | JoVE Journal

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

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