Name: In vivo Métodos para avaliar a função e estrutura do gânglio de gânglios da retina e da estrutura em animais grandes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprenda métodos in vivo para avaliar a função e estrutura do nervo óptico em cabras e macacos rhesus usando FVEP, PERG e OCT. Essas técnicas avançam a pesquisa em neurociência visual e neuropatias ópticas.

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Este estudo foi financiado pelas seguintes bolsas: National Key P&D Program of China (2021YFA1101200); Projeto de Pesquisa Médica de Wenzhou (Y20170188), Programa Nacional de P&D da China (2016YFC1101200); Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81770926;81800842); Principal Programa de P&D da província de Zhejiang (2018C03G2090634); e Programa de P&D chave do Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). O patrocinador ou organização de financiamento não teve papel no projeto ou condução desta pesquisa.

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<li>Porciatti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+assessment+of+retinal+ganglion+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function.</a> Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).</li>
<li>Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+retinal+ganglion+cell+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Assessing retinal ganglion cell damage.</a> Eye. 31 (2), 209-217 (2017).</li>
<li>Schuman, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+and+histologic+measurements+of+nerve+fiber+layer+thickness+in+normal+and+glaucomatous+monkey+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil-induced+ocular+hypertension+and+glaucomatous+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse.</a> eLife. 8, 45881(2019).</li>
<li>Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical%2C+horizontal%2C+and+torsional+eye+movement+responses+to+head+roll+in+the+squirrel+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey.</a> Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).</li>
<li>Porciatti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+pattern+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The mouse pattern electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Neste estudo, apresentamos um protocolo de VEP, PERG e OCT em cabra e rhesus macaque. Esses métodos in vivo podem ser aplicados em grandes modelos animais de várias neuropatias ópticas, como glaucoma, neuropatia isquêmica ou óptica traumática e neurite óptica9.
PvEP é mais estável e sensível que o FVEP17; no entanto, não pode ser provocado em cabra9. Como tal, a FVEP é realizada em cabra e pvep é realizada em rhes...

O nervo óptico (ON), que consiste em axônios das células gânglios da retina (RGC), transmite sinal visual da retina para o cérebro. Doenças on, como glaucoma, neuropatia óptica traumática ou isquêmica, muitas vezes causaram degeneração irreversível on/RGC e perda visual devastadora. Embora existam atualmente muitos avanços na regeneração ON e na proteção do RGC em modelos de roedores1,2,3,4,5,6, os tratamentos clínicos para a maioria das doenças ON permaneceram essencialmente os mesmos ao longo do último meio século com resultados insatisfatórios7,8 . Para preencher a lacuna entre a pesquisa básica e a prática clínica, estudos translacionais utilizando um grande modelo animal de doenças ON são muitas vezes necessários e benéficos devido à sua semelhança anatômica mais próxima com os humanos do que os modelos de roedores.
Os macaques de cabra e rhesus são duas grandes espécies animais usadas em nosso laboratório para modelar a doença ON humana. O tamanho do globo ocular de uma cabra, ON, e a estrutura adjacente (cavidade orbital e nasal, base do crânio, etc.) é semelhante ao de um humano baseado na tomografia do crânio 9. Como tal, o modelo de cabra oferece uma oportunidade de avaliar e refinar dispositivos terapêuticos ou procedimentos cirúrgicos antes do uso em humanos. O macaque rhesus, como primata não humano (NHP), tem um sistema visual único semelhante ao humano que não existe em outras espécies10,11. Além disso, as respostas fisiopatológicas a lesões e tratamentos em NHP são muito semelhantes às dos seres humanos12.
Testes in vivo para avaliar a estrutura e função on e RGC longitudinalmente são importantes em grandes estudos em animais. O eletroretinograma padrão (PERG) tem sido usado para avaliar a função RGC. O potencial evocado visual flash (FVEP) reflete a integridade da via retino-geniculo-cortical no sistema visual. Assim, o PERG combinado com o FVEP pode refletir a função ON9,13,14 . A tomografia de coerência óptica da retina (OCT) pode mostrar a estrutura da retina com alta resolução temporal e espacial, o que permite a medição da espessura do complexo gânglio da retina (GCC)9,15. Para exames eletrofisiológicos neste estudo, o monitoramento de sinais vitais (taxa de calor, taxa de quebra, pressão arterial) e nível de saturação de oxigênio (SpO2) antes dos testes são cruciais, pois esses parâmetros têm impactos potentes no fluxo sanguíneo ocular e, portanto, na função do sistema visual. No entanto, não monitoramos os sinais vitais ao realizar imagens de retina OCT por uma questão de simplicidade. De acordo com nosso estudo anterior9, a espessura do GCC medida pela imagem da retina OCT é bastante estável, com coeficiente inter-sessão de variação próximo a 3%. Estes testes in vivo em cabra e rhesus macaque foram descritos em detalhes em nosso estudo anterior9. Aqui apresentamos esses métodos para ajudar a aumentar a transparência experimental e a reprodutibilidade.

<table><tbody><tr><td>Monitores de 47,6 x 26,8 cm</td><td>DELL Inc.</td><td>E2216HV</td><td>Os estímulos visuais de tabuleiros de xadrez preto-branco de reversão de contraste foram exibidos em telas tubo</td></tr><tr><td>traqueal de 6,0 mm</td><td>Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd</td><td>PVC 6.0</td><td>garantir o</td></tr><tr><td>clipe</td><td></td><td></td><td></td>jacaré</tr> das vias aéreas <tr><td>atropina</td><td>Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td>reduzir a secreção brônquica e proteger o coração da ativação do nervo vago</td></tr><tr><td>Carbomer Eye Gel</td><td>Fabrik GmbH Subsidiária da Bausch & Lomb</td><td></td><td>umedecer a córnea e estabilizar os eletrodos de registro Eletrodos</td></tr><tr><td>de gravação ERG-Jet</td><td>Roland Consult Stasche& Finger GmbH</td><td>2300 La Chaux-De-Fonds</td><td>ERG espéculo ocular de gravação</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd</td><td>ZYD020</td><td>fissura palpebral aberta</td></tr><tr><td>Heidelberg Spectralis OCT system</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td>OCT system</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td>( https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td>isoflurano anestesia</td></tr><tr><td>cabras Saanen machos</td><td>Caimu Livestock Company, país (Hangzhou, China)</td><td></td><td>As cabras Saanen machos, com idade entre 4 e 6 meses com peso de 19&ndash; </td></tr><tr><td>Eléctrodo de agulha</td> de 23 kg <td>Roland Consult Stasche& Uso de Finger GmbH</td><td>U51-426-G-D</td><td>para eletrodo de aterramento FVEP e eletrodos de referência PERG</td></tr><tr><td>cateter venoso periférico por via intravenosa</td><td>BD shanghai Medical Device Co., Ltd</td><td>383019</td><td>acesso intravenoso para atropina e propofol</td></tr><tr><td>propofol</td><td>Xian Lipont Enterprise Union Management Co., Ltd.</td><td></td><td>induzir anestesia de isoflurano em</td></tr><tr><td>cabra Tropicamida Phenylephrine Eye Drops</td><td>SANTEN OY, Japão</td><td></td><td>5% tropicamida e 5% cloridrato de fenilefrina</td></tr><tr><td>dispositivo de eletrofisiologia visual</td><td>Gotec Co., Ltd</td><td>Uso GT-2008V-III</td><td>para FVEP & Produtos Co</td></tr><tr><td>. da saúde animal de Huamu do</td> <td>xilazine</td> de PERG, Ltd.<td></td><td>anestesia com xilazina: injeção intramuscular de xilazina 3mg/kg</td></tr><tr><td>zoletil50</td><td>Virbac</td><td></td><td>induz anestesia com isoflurano em macaco</td></tr></tbody></table>

in vivo métodos para avaliar a função e estrutura do gânglio de gânglios da retina e da estrutura em animais grandes

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

O nervo óptico coleta sinais de axônios das células gânglios da retina e transmite sinal visual para o cérebro. Grandes modelos animais de lesão do nervo óptico são essenciais para traduzir novas estratégias terapêuticas desde modelos de roedores até aplicação clínica devido às suas semelhanças mais próximas com os humanos em tamanho e anatomia. Aqui descrevemos alguns métodos in vivo para avaliar a função e estrutura das células gânglios da retina (RGCs) e nervo óptico (ON) em animais de grande porte, incluindo potencial visual evocado (VEP), eletroretinograma padrão (PERG) e tomografia de coerência óptica (OUT). Tanto o primata de cabra quanto o não-humano foram empregados neste estudo. Ao apresentar esses métodos in vivo passo a passo, esperamos aumentar a reprodutibilidade experimental entre diferentes laboratórios e facilitar o uso de grandes modelos animais de neuropatias ópticas.

Figura 1A mostra resultados representativos da FVEP em cabra. Embora as formas de onda na mesma intensidade flash tenham relativa semelhança, ainda recomendamos examinar as formas de onda duas vezes. Ondas eletromagnéticas geradas por dispositivos eletrônicos interferirão com os sinais elétricos coletados, resultando em alto ruído de linha de base e baixa repetibilidade da forma de onda. Portanto, recomenda-se garantir que não haja dispositivos eletrônicos redundantes conectados ao ambiente ...

Aqui demostramos vários testes in vivo (flash visual evocado potencial, eletroretinograma padrão e tomografia de coerência óptica) em cabra e macaque rhesus para entender a estrutura e função do nervo óptico e seus neurônios.

In vivo Métodos para avaliar a função e estrutura do gânglio de gânglios da retina e da estrutura em animais grandes

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...

Oi, pessoal. Este é Yikui Zhang do Hospital Wenzhou Eye. O nervo superior não tem Exxons das células gânglios de orexina, e depois transmite o sinal visual para o cérebro.Modelo maior de lesão nervosa superior são essenciais para traduzir o novo tratamento do modelo robô para a aplicação linfática. Aqui, descrevemos alguns métodos in vivo para avaliar a estrutura e a função das células gânglios orexinas no nervo superior em animais de grande porte. Ao apresentar este método passo a passo, esperamos aumentar as deficiências reprodutivas experimentais e facilitar o uso de modelos maiores de neurose óptica.Raspe a lâmina eletrônica. E, prepare-o com 70% de álcool três vezes, para limpar a pele e expor a veia subcutânea. Insira um rodízio venoso periférico por via intravenosa.Em seguida, gotejar atropina e propofol. Entubar a cabra com um tubo traqueal de seis milímetros e conectar-se a um respirador artificial. A anestesia foi mantida com 3,5% de isoflurane em oxigênio a uma taxa de fluxo gerenciada constante de dois litros.Coloque o sensor de temperatura sob a língua da cabra. Corte a saturação de oxigênio na extremidade proximal da orelha de cabra. Amarre o manguito da pressão arterial na base da coxa.Grampo ECG ceia nos membros em ordem. Então, podemos monitorar os indicadores vitais da cabra. Raspe o cabelo e desinfete a pele com betadina e 70% de álcool três vezes no centro do osso frontal.Abra o saco de esterilizador contendo tesouras e as unhas. Faça incisões de pele para expor o crânio com uma tesoura. Parafusos de aço para implantados no centro do osso frontal.Raspe o cabelo e desinfete a pele com betadina e 70% de álcool três vezes em um ponto médio de duas orelhas no osso occipital. Faça incisões na pele. Parafusos de aço para implantados no ponto médio de duas orelhas em osso occipital.O eletrodo da agulha moída é inserido subcutâneamente sob o parafuso frontal do crânio. O eletrodo ativo e o eletrodo de referência estão conectados a parafusos frontais e occipitais, respectivamente, com clipes de jacaré para reduzir a impotência do eletrodo. Remendar um olho.Aplique colírios de anestesia tópico na superfície ocular. Pupilas de ambos os lados são dilatadas por colírios de micose. Coloque a cabeça da cabra em um estimulador cheio de gás com luz ambulante.Coloque o cobertor preto sobre o estimulador e a cabeça de cabra por cinco minutos de adaptação. O espéculo das pálpebras é usado para expor totalmente sua pupila. Verifique a impotência de contato do tecido eletrodo.Certifique-se de que a impotência seja inferior a 10 quilômetros para cada um evitar interferência eletromagnética de outros dispositivos elétricos na mesma sala. Verifique o ruído da linha de base sem estimulação da luz. Inicie a gravação do FVEP.Observe que a gravação de FVEP em cada intensidade de luz é realizada duas vezes. Note que úmido a córnea com lágrima artificial se ela parecer seca. Repita sobre os passos para o olho contralateral.Inicie a gravação do FVEP em diferentes intensidades de luz consecutivamente. Para cada gravação, 64 traços são mediados para produzir uma forma de onda. O primeiro pico positivo e ativo na forma de onda FVEP foi designado como P1 e N1. O eletrodo terrestre esterilizado está posicionado no lóbulo da orelha.Os eletrodos ativos e de referência esterilizados são inseridos subcutâneamente ao longo da linha média e do osso frontal e occipital, respectivamente. O espéculo das pálpebras é usado para expor totalmente sua pupila. Remendar um olho.Regisso padrão de respostas VEP do outro olho em diferentes frequências espaciais consecutivamente. Conecte-se ao eletrodo de terra com um clipe de jacaré. Dois eletrodos de referência de agulha esterilizado são colocados sob a pele um centímetro atrás do canthus lateral em ambos os lados.O espéculo das pálpebras é usado para expor totalmente sua pupila. Dois eletrodos de gravação ERG desinfetados são centrados em ambas as córneas após a aplicação tópica de lágrima artificial. Dois estimuladores são colocados na frente de cada olho com uma distância de visualização de 50 centímetros.Certifique-se de que a impotência está abaixo de 10 quilômetros. Rastreie o ruído da linha de base sem estimulação da luz. Aponte a luz ambulante.Inicie a gravação do ERG padrão de ambos os olhos simultaneamente em diferentes frequências espaciais consecutivamente. Finalmente, o retorno da tela para gravar o padrão ERG sem estimuladores visuais e um controle ativo. O filtro bandpass está programado para variar de um a 75 Hertz para três ERG padrão CPD.O filtro bandpass é de um a 50 Hertz para suavizar a forma sem afetar sua amplitude. Os primeiros picos positivos e ativos na forma de onda são designados como P1 e N1. O padrão de amplitude ERG medido de N1 a P1.To reduzir a impotência de eletrodos, uma referência de agulha esterilizada é colocada sob a pele frontal. E um eletrodo de referência de agulha esterilizado é colocado sob a pele um centímetro atrás do canthus lateral de um lado.Um eletrodo de gravação ERG desinfetado é colocado na córnea em uma aplicação tópica de lágrima artificial. Remendar um olho. Um display é colocado a uma distância de visualização de 50 centímetros.O espéculo das pálpebras é usado para expor totalmente sua pupila. Em seguida, a cabra é colocada no descanso do queixo. Alinhe a cabra com a câmera para enviar sua cabeça de nervo óptico na imagem de oftalmoscopia a laser do scan confocal modificando sua posição da cabeça.Clique no botão iniciar para entrar na fase final de detecção. Espere a máquina terminar de carregar. Pressione o botão de partida amarelo para iniciar a imagem formal.Ajuste o joystick para iluminar uniformemente a imagem infravermelha para melhorar a qualidade da imagem. Deslize a câmera para a frente até que a imagem OCT de retina vertical seja mostrada na tela superior direita. Modifique o joystick para que dance uniformemente em uma imagem de OCT de retina horizontal.Pressione o botão no joystick para capturar sua imagem automaticamente. Segure este joystick para manter a qualidade da imagem na tela de imagem ao vivo até que a execução da imagem seja concluída. Em seguida, pressione adquirir.Selecione uma foto inicial de alta qualidade. Clique com o botão direito do mouse e selecione definir referência. Pressione o botão de acompanhamento para permitir que o programa corresponda automaticamente à varredura atual com a varredura da linha de base.Uma vez combinado, pressionou o botão no joystick para ativar o rastreamento automático em tempo real. Clique no botão de medição para entrar na plataforma de medição. Escolha a borracha de uma ferramenta e limpe a linha RFL, que é automaticamente rotulada por máquina.Escolha a ferramenta de desenho de linha para delinear manualmente o limite entre IPL e INL. Entre as linhas vermelha e azul está o complexo GCC. A imagem alterada de retina no macaque rhesus é realizada utilizando-se o mesmo equipamento e procedimento que os utilizados em cabra.Figura A mostra representante FVEP em cabra. A figura B mostra forma de onda ERG padrão representativa em cabra. Figura C mostra padrão representativo FVEP em rhesus macaque.E, figura D mostra forma de onda ERG padrão representativa em rhesus macaque. A Figura dois mostra imagens representativas de OCT de retina ao redor da cabeça do nervo óptico e a espessura do complexo GCC em diferentes regiões periféricas em cabra e no macaque rhesus. O grande modelo animal desempenha um papel importante na pesquisa translacional.Em muitos casos, efeitos terapêuticos promissores em pequenos modelos animais não foram traduzidos para pacientes humanos. Neste estudo, apresentamos protocolo de vídeo da FVEP, PERG e OCT em cabra e o macaque rhesus. Este método in vivo pode ser aplicado em modelo maior de várias neurose óptica, como neuropatia isquêmica de glaucoma ou traumática óptica e neurite óptica.

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A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

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